專利名稱：一株阿魏酸酯酶生產(chǎn)菌株及應(yīng)用該菌株生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的微生物菌株，特別涉及一株綠木霉及利用該菌生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法。
背景技術(shù)：
阿魏酸酯酶也被稱為肉桂酸酯酶，是羧酸酯水解酶的一個(gè)亞類，也是一種胞外酶，它可以水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來。阿魏酸在植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中起著重要的作用，它可以在植物細(xì)胞壁的木質(zhì)素與木質(zhì)素之間，木質(zhì)素與半纖維素之間，半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構(gòu)成一個(gè)骨架結(jié)構(gòu)，使得整個(gè)細(xì)胞壁變得堅(jiān)硬。阿魏酸酯酶可以打開細(xì)胞壁木質(zhì)素中阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等分子與半纖維素支鏈形成的致密網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從空間上對細(xì)胞壁中纖維素和半纖維 素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推測認(rèn)為是消除細(xì)胞壁降解限制因子的關(guān)鍵酶之一。在造紙工業(yè)中，經(jīng)阿魏酸酯酶處理的原料，木質(zhì)素更容易脫除，可減少制漿工序的化學(xué)藥品用量。而纖維細(xì)胞壁經(jīng)阿魏酸酯酶處理后，表面變得疏松，成紙時(shí)可以提高紙品的機(jī)械強(qiáng)度。利用阿魏酸酯酶處理紙漿后產(chǎn)生的阿魏酸可作為優(yōu)質(zhì)的抗氧化劑，除此之外，阿魏酸還具有的抗腫瘤、消炎、促進(jìn)傷口愈等保健作用，所以阿魏酸可作為功能因子開發(fā)功能性的食品。同時(shí)，阿魏酸可以作為合成天然香蘭素的前體，以阿魏酸為原料，利用微生物的方法生產(chǎn)的香蘭素與合成的香蘭素相比具有毒性低，安全性高的特點(diǎn)，可以用作食品和化妝品行業(yè)的香料。專利CN200810056477. 6公開了一種阿魏酸酯酶的提取方法，但操作較為復(fù)雜，關(guān)于阿魏酸酯酶的研究，有很多問題需要解決，主要是目前篩選出的分泌阿魏酸酯酶的微生物的分泌量仍然達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)阿魏酸酯酶的要求；其次，阿魏酸酯酶提取方法有待改進(jìn)，其工業(yè)化生產(chǎn)受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述技術(shù)存在的不足,提供一種利用綠色木霉(Trichoderma viride)通過液體發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，收率較現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道提高了數(shù)倍，所采用的菌株代碼為JBSH-001，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo. 5612 ;該菌株可應(yīng)用于生產(chǎn)阿魏酸酯酶，該方法發(fā)酵所得阿魏酸酯酶酶活可達(dá)200mU/ml以上，純化后的阿魏酸酯酶酶活可達(dá)50000mU/g以上。本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案是首先獲得了一株新的菌株，該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 5612，其具體獲得方法如下( I)出發(fā)囷株以本實(shí)驗(yàn)室收減的各種囷株作為起始囷株，其中包括多種木腐囷、軟腐菌、枯萎菌和其他霉菌，分類培養(yǎng)建立菌種庫。
(2)篩選方法以阿魏酸甲酯作為唯一碳源制備平板培養(yǎng)基，接入上述菌株在適宜條件下培養(yǎng)，根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈進(jìn)行一級篩分。初步篩選具有產(chǎn)阿魏酸酯酶能力的菌株，然后對初篩菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)液體培養(yǎng)物中阿魏酸酯酶的活性大小篩選出其中的2株產(chǎn)酶活性最高的菌株作為馴化菌株。(3)對2株待馴化菌株的生理生化特性、產(chǎn)酶性能等進(jìn)行比較深入研究，最終篩選出一株產(chǎn)酶能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)并具有穩(wěn)定的傳代特性的菌株，將其初步命名為JBSH01。(4)以該菌株為出發(fā)菌株，采用常規(guī)誘變方法，如UV，DMS，麗S，NTG等，結(jié)合低能離子注入法，反復(fù)多次誘變，復(fù)篩，最終獲得了高產(chǎn)菌株JBSH-001。發(fā)明人對該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心進(jìn)行了生物保藏，保藏編號為CGMCC No. 5612，經(jīng)檢測其為存活狀態(tài)。上述JBSH-001菌株，其形態(tài)特征如下菌絲纖細(xì)無色，具分隔，多分枝。分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，對生或互生，一般有2-3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。分生孢子多為球形，孢壁具小疣突，綠色。在PDA培養(yǎng)基上菌落初為白絮狀，后為暗綠色。上述形態(tài)特征與綠色木霉Trichodermaviride的培養(yǎng)特性一致。發(fā)明人同時(shí)對其進(jìn)行了 16S rDNA測序，其基因序列如Seq ID No:l所示，該序列為菌株JBSH-001的16S rDNA的全序列。用所測得的16S rDNA序列進(jìn)行BLSTN比對，結(jié)果顯示，菌株JBSH-001的16S rDNA的核苷酸序列與木霉屬Trichoderma spp.不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性,與其中明確標(biāo)記為綠色木霉Trichoderma viride的5株菌株有100%的同源性，因而進(jìn)一步確定本發(fā)明所提供的菌株為一株綠色木霉菌株。本發(fā)明所獲得的菌株綠色木霉Trichoderma viride JBSH-001,可以應(yīng)用于日常的生產(chǎn)當(dāng)中，特別是可以應(yīng)用于阿魏酸酯酶的生產(chǎn)，具體步驟主要包括綠色木霉菌液體發(fā)酵以及阿魏酸酯酶的提取分離和純化步驟，其特征在于在綠色木霉菌液體發(fā)酵中應(yīng)用阿魏酸酯酶產(chǎn)生和積累誘導(dǎo)工序，所述的阿魏酸酯酶產(chǎn)生和積累誘導(dǎo)工序具體步驟如下A.誘導(dǎo)因子篩選從阿魏酸衍生物、生長因子、酶系的調(diào)控方面篩選誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)因子選自維生素類或阿魏酸衍生物或誘導(dǎo)離子或其他誘導(dǎo)因子或其混合物；B.誘導(dǎo)因子使用方法維生素類或阿魏酸衍生物或誘導(dǎo)離子添加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)合中期補(bǔ)加碳源和氮源，用于誘導(dǎo)和促進(jìn)產(chǎn)生阿魏酸酯酶。首先要用常規(guī)培養(yǎng)使木霉菌體生長，進(jìn)入產(chǎn)酶期后再陸續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、蔗糖等碳源和蛋白胨、酵母浸粉、酵母提取物等氮源，通過不斷補(bǔ)料使菌體生長，從而增加阿魏酸酯酶的表達(dá)和分泌。其中所述誘導(dǎo)因子中的誘導(dǎo)離子選自硼離子或鎂離子或鈷離子或鑰離子中的一種或幾種的混合物；維生素類選自維生素B或葉酸；阿魏酸衍生物為阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯；其它誘導(dǎo)因子為甲殼素或殼聚糖或米糠或麩皮中的一種或幾種的混合物。之所以選擇上述的物質(zhì)作為誘導(dǎo)因子，發(fā)明人經(jīng)過研究后發(fā)現(xiàn)針對本發(fā)明所述的菌株而言，要使其產(chǎn)生膠霉菌素，誘導(dǎo)調(diào)控的方法主要通過三種方式1、補(bǔ)充酶表達(dá)的底物，如阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、甲殼素、殼聚糖、麩皮，從而來誘導(dǎo)菌產(chǎn)生阿魏酸酯酶；2、補(bǔ)充生物生長必須的營養(yǎng)因子，如維生素B、葉酸等；3、補(bǔ)充菌體中各種酶系的輔酶離子，主要選擇自金屬離子或其他例子，一般可以采用其可溶性金屬鹽的形式，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過上述的三種誘導(dǎo)因子，結(jié)合對于發(fā)酵過程的控制，可以實(shí)現(xiàn)阿魏酸酯酶的產(chǎn)量提高。更為具體的生產(chǎn)步驟如下( I)綠色木霉菌液體發(fā)酵A.菌種活化；B.液體種子制備；C.發(fā)酵菌種活化后，經(jīng)液體發(fā)酵擴(kuò)繁種子液，再利用液體深層發(fā)酵方法獲得阿魏酸酯酶發(fā)酵液； 其中發(fā)酵過程將液體種子以2-10% (v/w)的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h,補(bǔ)加O. 5-1% (v/w)的碳源以及O. 05-0. 2% (v/w)的氮源；(2)阿魏酸酯酶的制備A.固液分離將上述發(fā)酵的阿魏酸酯酶發(fā)酵液經(jīng)固液分離后，清液用于制備阿魏酸酯酶；B.發(fā)酵清液采用微濾脫除膠質(zhì)以及不溶性顆粒，經(jīng)超濾膜濃縮后，添加保護(hù)劑，經(jīng)噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗品；而為了得到阿魏酸酯酶純品，發(fā)明人將上述步驟(2)獲得的清夜，直接經(jīng)固液分離后，采用微濾脫除膠質(zhì)以及不溶性顆粒，經(jīng)超濾膜濃縮后，用鹽析的方法，得到阿魏酸酯酶粗酶，經(jīng)復(fù)溶后，配制O. 5-2%的酶液，經(jīng)層析純化，超濾脫鹽后，經(jīng)冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品。其中所述步驟(2)中的固液分離為板框過濾或三足離心或碟式離心；所述的步驟
(3)中微濾膜的孔徑為O. 1-0. 5 μ m，超濾膜的孔徑為2000-10000Dalton ;所述的鹽析介質(zhì)是氯化鈉或硫酸鈉或硫酸鎂或硫酸銨；所述的步驟(3)中層析采用的是離子交換層析，使用的層析介質(zhì)為 DOWEX MXA-1 或 Q-Sepharose FF 或 DEAE-Sephacel 或 DEAE-Sepharose FF或717強(qiáng)堿性離子交換樹脂或D201大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂。更為具體的過程如下(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20 0C _25°C)活化 4h-8h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，沖洗入裝有滅菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個(gè)三角瓶，培養(yǎng)溫度24°c，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，振蕩培養(yǎng)24_48h制備種子液；(3)發(fā)酵、誘導(dǎo)過程在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基總重量O. 01-0. 05%金屬離子(如鎂離子或鈷離子或鑰離子或硼離子中的一種或幾種混合物)；及占培養(yǎng)基總重量O. 005-0. 02%的生長因子(如維生素B或葉酸或其混合物)，將液體種子以2-10% (v/w)的接種量在無菌操作的條件下接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h，補(bǔ)加O. 5-1% (v/w)的碳源(如葡萄糖或蔗糖一種或幾種混合物)以及O. 05-0. 2%的氮源(如蛋白胨或酵母浸粉或酵母粉中的一種或幾種混合物)，總共培養(yǎng)96-144h，獲得阿魏酸酯酶發(fā)酵液，經(jīng)固液分離后獲得發(fā)酵清液。 (4 )阿魏酸酯酶的提取發(fā)酵清液經(jīng)4000-6000r/min離心分離后，清液采用O. 1-0. 22 μ m的微濾膜組件過濾澄清溶液，進(jìn)而用2000-60000Dalton的超濾膜組件超濾濃縮，濃縮到濃度為5-10% (v/v)，添加5-10%的保護(hù)劑(w/v)，經(jīng)噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗
品O(5)阿魏酸酯酶的純化發(fā)酵清液經(jīng)4000-6000r/min離心分離后，清液采用O. 1-0. 22 μ m的微濾膜組件澄清溶液，進(jìn)而用2000-60000Dalton的超濾膜組件濃縮，濃縮到濃度為5-10% (v/v)，用重量分?jǐn)?shù)50-70%硫酸銨鹽析，經(jīng)2000-6000r/min離心后，沉淀用pH為6. 86的磷酸鹽緩沖鹽配制O. 5-1% (w/v，濕重)的酶液，采用QFF瓊脂糖凝膠層析純化，超濾脫鹽后，經(jīng)冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品。其中，步驟(4)獲得的阿魏酸酯酶粗品成本較低，可以直接用于飼料、農(nóng)產(chǎn)品加工中，而步驟(4)獲得的阿魏酸酯酶純品純度高，可用于食品、造紙等方面。其中菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶的生產(chǎn)條件的確定，其方法如下(I)采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過改變溫度、初始pH值、接種量、裝料量和培養(yǎng)時(shí)間，確定液體種子最佳培養(yǎng)條件和液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件；
(2)采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過改變培養(yǎng)的碳氮源和無機(jī)鹽組成確定該菌株液體種子最佳培養(yǎng)基組成和液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成。經(jīng)過上述單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)所獲得菌株、液體種子培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件如下液體種子培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為蔗糖2% 4%，酵母浸粉O. 2% 1%，硫酸鎂 O. 02-0. 1%，磷酸二氫鉀 O. 01-0. 05%,加水至 IOOOmL ；液體種子培養(yǎng)條件接種量為每個(gè)三角瓶接種I只菌株斜面培養(yǎng)物，PH值自然，培養(yǎng)溫度24 28°C，搖床轉(zhuǎn)速75-200r/mi η,培養(yǎng)時(shí)間為24 48h ；經(jīng)過上述單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)所獲得菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件如下液體培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為蔗糖2% 4%，蛋白胨O. 2 1%，麩皮1-4% ；土豆汁1-4% ;硫酸鎂O. 02-0. 1%，磷酸二氫鉀O. 01-0. 05%,硫酸鋅O. 001-0. 005%,維生素B120. 005%，加水至 IOOOmL ；液體發(fā)酵條件接種量為5%_10% (v/w), pH值自然，培養(yǎng)溫度24 28°C，搖床轉(zhuǎn)速 75-200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為 96_144h ；利用上述綠木霉發(fā)酵，將液體發(fā)酵后阿魏酸酯酶酶活可達(dá)200mU/ml以上，純化后的阿魏酸酯酶酶活可達(dá)50000mU/g以上。利用該菌株生產(chǎn)阿魏酸酯酶有以下優(yōu)點(diǎn)I、利用該菌株發(fā)酵制備阿魏酸酯酶酶活可達(dá)200mU/ml以上，純化后的阿魏酸酯酶酶活可達(dá)50000mU/g以上；2、該菌株的代謝產(chǎn)物阿魏酸酯酶為胞外酶，減少細(xì)胞壁破碎過程，大大降低能耗，降低生產(chǎn)成本。綜上所述，本發(fā)明提供了一株阿魏酸酯酶高產(chǎn)菌株及利用該菌株進(jìn)行液體發(fā)酵制備阿魏酸酯酶的方法，該菌株可應(yīng)用于生產(chǎn)阿魏酸酯酶，該方法發(fā)酵所得阿魏酸酯酶酶活產(chǎn)率可達(dá)200mU/ml以上。保藏信息保藏時(shí)間2011年12月16日保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號CGMCCNo. 5612
保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所分類命名綠色木霉(Trichodermaviride)
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍，下述實(shí)施例中所采用的菌種均為保藏號為CGMCCNo. 5612的菌種。實(shí)施例I(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養(yǎng)基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個(gè)三角瓶，PH值自然，培養(yǎng)溫度24°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；種子培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 2%，硫酸鎂O. 05%,磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發(fā)酵、調(diào)控過程將液體種子以10% (v/v)的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h，補(bǔ)加40% (w/v)的葡萄糖無菌溶液25mLl% (w/v)的葡萄糖及20% (w/v)的蛋白胨無菌溶液5mL0. 1% (w/v)的蛋白胨，共培養(yǎng)96h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為蔗糖4%，蛋白胨1%，麩皮4% ;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%，氯化鈷O. 001%,維生素B120. 005%，加水至IOOOmL ;滅菌條件為121 °C，O. 15Mpa 滅菌 20mi η ；發(fā)酵結(jié)束以后，發(fā)酵液酶活為248mU/mL，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心IOmin后，清液采用O. 22 μ m的陶瓷微濾膜組件過濾，濾液用IOOOODalton的超濾膜組件濃縮，濃縮到重量濃度為5% (v/v),添加10% (w/v)的玉米淀粉,經(jīng)噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗品25. 3g。酶活 7200mU/g。實(shí)施例2(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養(yǎng)基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個(gè)三角瓶，PH值自然，培養(yǎng)溫度24°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；種子培養(yǎng)基組成(w/w)為按重量計(jì)(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉0.6%，硫酸鎂O. 05%，磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發(fā)酵、調(diào)控過程 將液體種子以5% (v/v)的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h，補(bǔ)加40% (w/v)的蔗糖無菌溶液25mL及20% (w/v)的酵母浸粉無菌溶液5mLl% (w/v)的蔗糖糖及O. 1% (w/v)的酵母浸粉，共培養(yǎng)120h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為鹿糖4%，蛋白胨1%，阿魏酸乙酯1% ;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,氯化鈷O. 001%,維生素B60. 005%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa 滅菌 20min ；發(fā)酵結(jié)束以后，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心lOmin，清液采用O. 22 μ m的陶瓷微濾膜組件過濾，濾液用6000Dalton的超濾膜組件濃縮,濃縮到原體積的10% (v/v),用60% (w/V)硫酸銨鹽析,經(jīng)4000r/min離心后,沉淀用pH為6. 86的磷酸鹽緩沖鹽配制成O. 5% (w/V，濕重)的酶液，采用DEAE-Sepharose FF介質(zhì)進(jìn)行柱層析純化，洗脫液超濾脫鹽后，經(jīng)冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品470mg，酶活86450mU/g。實(shí)施例3(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養(yǎng)基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個(gè)三角瓶，PH值自然，培養(yǎng)溫度24°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；種子培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 2%，硫酸鎂O. 05%,磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發(fā)酵、調(diào)控過程將液體種子以5% (v/v)的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h，補(bǔ)加40% (w/v)的蔗糖無菌溶液25mL及20% (w/v)的酵母浸粉無菌溶液5mL補(bǔ)加1% (w/v)的鹿糖及O. 1% (w/v)的酵母浸粉，共培養(yǎng)120h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為蔗糖4%，酵母浸粉1%，阿魏酸甲酯2%;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 005%,鑰酸銨O. 001%,維生素B10. 01%,加水至IOOOmL ；發(fā)酵結(jié)束以后，酶活為248mU/mL發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心lOmin，清液采用O. I μ m的陶瓷微濾膜組件過濾，濾液用IOOOODalton的超濾膜組件濃縮，濃縮到重量濃度為8% (v/v)，添加10% (w/v)的淀粉，經(jīng)噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗品55. 3g。測定其酶活為 3800mU/g。實(shí)施例4(I)菌種活化將4°C條件下保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至室溫條件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液體種子制備在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養(yǎng)基的三角瓶中，I支試管菌種接種I個(gè)三角瓶，PH值自然，培養(yǎng)溫度24°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時(shí)間為48h ；種子培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為蔗糖2%，酵母浸粉O. 2%，硫酸鎂O. 05%,磷酸二氫鉀O. 025%,加水至IOOOmL ;滅菌條件為121。。，O. 15Mpa滅菌20min ；(3)發(fā)酵、調(diào)控過程將液體種子以5% (v/v)的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h，補(bǔ)加40% (w/v)的蔗糖無菌溶液25mL及20% (w/v)的酵母浸粉無菌溶液5mL補(bǔ)加1% (w/v)的鹿糖及O. 1% (w/v)的酵母浸粉，共培養(yǎng)120h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成，按重量計(jì)(w/w)為蔗糖4%，酵母浸粉1%，阿魏酸甲酯2%;硫酸鎂O. 1%，磷酸二氫鉀O. 05%,硫酸鋅O. 005%,鑰酸銨O. 001%,維生素B10. 01%,加水至10OOmT,；發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心IOmin后，清液采用O. 10 μ m的陶瓷微濾膜組件過濾,濾液用6000Dalton的超濾膜組件濃縮，濃縮到原濾液體積的10%，用70%的硫 酸銨鹽析，經(jīng)4000r/min離心后,沉淀用pH為6. 86的磷酸鹽緩沖鹽配制O. 5% (w/v,濕重)的酶液，采用QFF瓊脂糖凝膠柱層析純化，再經(jīng)超濾脫鹽后，冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品395mg，測定其酶活 92600mU/g。
權(quán)利要求
1.一株阿魏酸酯酶高產(chǎn)菌株，其保藏號為CGMCC No. 5612。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的菌株，其特征在于該菌株為綠色木霉菌株，該其16S核糖體DNA即16S rDNA的基因序列如Seq ID No: I所示。
3.一種利用權(quán)利要求I所述菌株生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，主要包括綠色木霉菌液體發(fā)酵以及阿魏酸酯酶的提取分離和純化步驟，其特征在于在綠色木霉菌液體發(fā)酵中應(yīng)用阿魏酸酯酶產(chǎn)生和積累誘導(dǎo)工序， 所述的阿魏酸酯酶產(chǎn)生和積累誘導(dǎo)工序具體步驟如下 A.誘導(dǎo)因子篩選 從阿魏酸衍生物、維生素類生長因子、酶系的調(diào)控方面篩選誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)因子選自維生素類或阿魏酸衍生物或誘導(dǎo)離子或其他它誘導(dǎo)因子或其混合物； B.誘導(dǎo)因子使用方法 維生素類或阿魏酸衍生物或誘導(dǎo)離子添加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，結(jié)合中期補(bǔ)加碳源和氮源，用于誘導(dǎo)和促進(jìn)產(chǎn)生阿魏酸酯酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于所述誘導(dǎo)因子中的誘導(dǎo)離子選自硼離子或鎂離子或鈷離子或鑰離子中的一種或幾種的混合物；維生素類選自維生素B或葉酸；阿魏酸衍生物為阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯；其它誘導(dǎo)因子為甲殼素或殼聚糖或米糠或麩皮中的一種或幾種的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于具體步驟如下 (1)綠色木霉菌液體發(fā)酵 A.菌種活化； B.液體種子制備； C.發(fā)酵菌種活化后，經(jīng)液體發(fā)酵擴(kuò)繁種子液，再利用液體深層發(fā)酵方法獲得含阿魏酸酯酶的發(fā)酵液； 其中發(fā)酵過程將液體種子以2-10v/v%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h，補(bǔ)加O. 5-lw/v%的碳源物質(zhì)以及O. 05-0. 2w/v%的氮源物質(zhì)； (2)阿魏酸酯酶的制備 A.固液分離將上述發(fā)酵的含阿魏酸酯酶的發(fā)酵液經(jīng)固液分離后，清液用于制備阿魏酸酯酶； B.發(fā)酵清液采用微濾脫除膠質(zhì)以及不溶性顆粒，經(jīng)超濾膜濃縮后，添加保護(hù)劑，經(jīng)噴霧干燥得到阿魏酸酯酶粗品。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于具體步驟如下 (1)綠色木霉菌液體發(fā)酵 A.菌種活化； B.液體種子制備； C.發(fā)酵菌種活化后，經(jīng)液體發(fā)酵擴(kuò)繁種子液，再利用液體深層發(fā)酵方法獲得含阿魏酸酯酶的發(fā)酵液； 其中發(fā)酵過程將液體種子以2-10v/v%的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h，補(bǔ)加O. 5-lw/v%的碳源物質(zhì)以及O. 05-0. 2w/v%的氮源物質(zhì)； (2)阿魏酸酯酶的制備A.固液分離將上述發(fā)酵的含阿魏酸酯酶的發(fā)酵液經(jīng)固液分離后，清液用于制備阿魏酸酯酶； B.將上述步驟A獲得的清液，采用微濾脫除膠質(zhì)以及不溶性顆粒，經(jīng)超濾膜濃縮后，用鹽析的方法，得到阿魏酸酯酶粗酶，再復(fù)溶后，配制成O. 5-2w/v%的酶液，經(jīng)柱層析純化，超濾脫鹽后，冷凍干燥得到阿魏酸酯酶純品。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的固液分離為板框過濾或三足式離心機(jī)離心或碟片式離心機(jī)離心；所述的步驟(3)中微濾膜的孔徑為O.1-0. 5 μ m，超濾膜的孔徑為截留物質(zhì)的分子量2000-10000Dalton ;所述的鹽析介質(zhì)是氯化鈉或硫酸鈉或硫酸鎂或硫酸銨溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中柱層析采用的是離子交換層析，使用的層析介質(zhì)為DOWEX MXA-I或Q-Sepharose FF或DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose FF或717強(qiáng)堿性離子交換樹脂或D201大孔強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述制備方法，其特征在于所述的綠色木霉菌菌絲體的發(fā)酵制備具體步驟為將保存在PDA培養(yǎng)基上的試管斜面菌種移至20°C -25°C條件下活化4h-8h ;在無菌操作臺上，用IOmL滅菌后的蒸餾水將經(jīng)過活化的試管斜面菌種制成菌體懸浮液，在無菌的條件下沖洗入裝有滅菌種子培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)溫度24°C,搖床轉(zhuǎn)速200r/min,培養(yǎng)時(shí)間為48h,制備液體種子； 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加占培養(yǎng)基總重量O. 01-0. 05w/w%的含誘導(dǎo)離子的鹽，占培養(yǎng)基總重量O. 005-0. 02w/w%的維生素類，及占培養(yǎng)基總重量O. l-4w/w%的阿魏酸衍生物或其他它誘導(dǎo)因子或其混合物；將液體種子以2-10v/v%的接種量在無菌操作的條件下接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C培養(yǎng)48h，補(bǔ)加O. 5-lw/v%的碳源物質(zhì)以及O. 05-0. 2w/v%的氮源物質(zhì)，總共培養(yǎng)96-144h。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述制備方法，其特征在于所述的碳源物質(zhì)為葡萄糖或蔗糖或淀粉中的一種或幾種的混合物；所述的氮源物質(zhì)蛋白胨或酵母浸粉或酵母粉或玉米漿中的一種或幾種的混合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一株阿魏酸酯酶高產(chǎn)菌株及利用該菌株進(jìn)行液體發(fā)酵制備阿魏酸酯酶的方法；本發(fā)明所涉及的阿魏酸酯酶生產(chǎn)菌株為絲狀真菌，經(jīng)16SrDNA鑒定為一株綠色木霉(Trichodermaviride)，菌株代碼為JBSH-001，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.5612?？衫迷摼暌后w發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶，該方法發(fā)酵所得阿魏酸酯酶酶活可達(dá)200mU/ml以上,純化后的阿魏酸酯酶酶活可達(dá)50000mU/g以上。
文檔編號C12N1/14GK102796673SQ20121030754
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者徐澤平, 馬韻升, 史慶苓, 楊傳倫, 張心青, 王秀芝, 付慧君, 虞鳳慧 申請人:黃河三角洲京博化工研究院有限公司, 山東京博控股股份有限公司