專利名稱：豬基因組假attP位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及豬基因組的假attP位點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
運(yùn)用各種分子手段將外源基因整合于豬基因組，賦予豬特定的性狀，是推動(dòng)豬用于基礎(chǔ)科學(xué)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)研究的有效途徑。從位點(diǎn)特異性的角度考查，外源基因的整合手段可分為非定點(diǎn)和定點(diǎn)兩類。非定點(diǎn)型包括裸DNA顯微注射、病毒介導(dǎo)、轉(zhuǎn)座子等。雖然病毒介導(dǎo)和轉(zhuǎn)座子在基因轉(zhuǎn)移效率上有較大提高，但是由于識(shí)別位點(diǎn)的嚴(yán)謹(jǐn)性較低，整合特異性沒有實(shí)質(zhì)性改進(jìn)，因此難以對整合位點(diǎn)進(jìn)行嚴(yán)格控制，外源基因的表達(dá)也難以預(yù)期(馬元武等.轉(zhuǎn)座子SleepingBeauty和PiggyBac.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26 (9) :783-787)。為了克服上述不足，各種定點(diǎn)型技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生?；虼虬惺亲顬闇?zhǔn)確的整合策略，但其依賴于同源重組，而自然條件下重組頻率很低；此外，豬胚胎干細(xì)胞(ES)與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)技術(shù)目前尚未成熟，因此通過基因打靶實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合難度非常大(聞益波等.豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景.遺傳，2011，33(4) :307-313.)。研究人員隨即轉(zhuǎn)向位點(diǎn)特異重組技術(shù)(SSR, site-speccificrecombination),其中應(yīng)用最為廣泛的是Cre/LoxP、FLP/FRT系統(tǒng)。二者隸屬于位點(diǎn)特異重組酶的酪氨酸家族，作用機(jī)理相似，均介導(dǎo)可逆重組反應(yīng)，這就決定了二者介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)整合的凈效能仍然較低；而且實(shí)際使用中還需將其識(shí)別序列“預(yù)置”于基因組的特定位點(diǎn)，從可操作性的角度來講難度反而增大(Nern A, et al. Multiple new site-specificrecombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U SA, 2011，108(34) :14198-14203. )。ZFN (鋅指核酸酶)和TALEN (轉(zhuǎn)錄激活樣因子核酸酶)對識(shí)別模塊(DNA結(jié)構(gòu)域)和功能模塊(FokI核酸酶)進(jìn)行了巧妙結(jié)合，可借助細(xì)胞內(nèi)的雙鏈斷裂(double-strand break, DSB)和非同源末端連接(non-homo logous end joining, NHE J)介導(dǎo)外源基因的定點(diǎn)整合，但實(shí)際中要設(shè)計(jì)和篩選高特異性和高親和性的核酸酶并不容易(Gabriel R, et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nucleasespecificity. Nat Biotechnol, 2011, 29 (9) :816-823.)?，F(xiàn)實(shí)的困境促使研究人員開始探詢外源基因在豬基因組內(nèi)高效定點(diǎn)整合的新策略。在自然界，存在一類能夠催化不可逆重組反應(yīng)的位點(diǎn)特異修飾酶，成員包括4C31、TP901-1、Bxbl、U153等，其中以Φ C31整合酶的研究背景最為清晰。<i)C31整合酶來自鏈霉菌噬菌體，屬于位點(diǎn)特異重組酶的絲氨酸家族，可催化兩個(gè)不同的識(shí)別位點(diǎn)attB (細(xì)菌附著位點(diǎn),bacterial attachment site)和attP (卩遼菌體附著位點(diǎn),phageattachment site)之間的特異重組(Thorpe HM, et al. In vitro site-specificintegration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc Natl Acad Sci USA, 1998，95(10):5505-5510.)。attB和 attP位點(diǎn)的主要特征是各在中間位置有一段“TTG”，作為重組“樞紐“，側(cè)翼是兩個(gè)反向重復(fù)序列。重組之后生成的是attL和attR雜合位點(diǎn)，不能再作為(i)C31整合酶的底物。因此該反應(yīng)是單向性的，重組之后的基因結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，這是該酶具有高效催化活性的一個(gè)重要原因。實(shí)驗(yàn)證實(shí)attB和attP最小活性序列長度分別為34bp和39bp (Groth AC, et al. Aphage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.Proc Natl Acad Sci U S A, 2000，97 (11) : 5995-6000.)。作為原核生物附著位點(diǎn)的 attB和attP，理論上在動(dòng)物基因組內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)，但是研究發(fā)現(xiàn)<i)C31整合酶具有修飾未改造動(dòng)物基因組(unmodified genome)的能力，這是因?yàn)閯?dòng)物基因組內(nèi)存在與野生attP位點(diǎn)具有一定相似度的天然序列，被稱為“假attP位點(diǎn)”(pseudo attP site),可作為<i)C31整合酶的錨定位點(diǎn)，介導(dǎo)外源基因的定點(diǎn)整合?，F(xiàn)已在人、小鼠、果蠅、大鼠、牛、雞等多個(gè)物種內(nèi)發(fā)現(xiàn)了假attP位點(diǎn)。分析相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)該類定點(diǎn)整合反應(yīng)具有兩個(gè)重要特點(diǎn)(I)基因整合效率高。Thyagarajan等將含有attB位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告載體和<tC31整合酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞。經(jīng)過抗藥性篩選，穩(wěn)定克隆的數(shù)量增加了 8. 6倍，熒光素酶的表達(dá)水平比無Φ C31組至少高10倍。這比Cre酶或FLP酶介導(dǎo)的整合入LoxP或FRT位點(diǎn)的活性高 10 100倍(Thyagarajan B, et al. Site-specific genomic integration in mammaliancells mediated by phage Φ C31 integrase. Mol Cell Biol,2001，21 (12):3926-3934.) 。在牛細(xì)胞內(nèi)，<i>C31整合酶介導(dǎo)外源基因平均整合率是無<i)C31組的2. 7倍，在小鼠NIH 3T3細(xì)胞內(nèi)，比率達(dá)到15. 47倍，而在雞原生殖細(xì)胞(PGCs)內(nèi)的整合率則提高20倍(Ma Qff, et al. Identification of pseudo attP sites for phage Φ C31 integrasein bovine genome. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345(3):984-988;LeightonPA, et al. Genetic modification of primordial germ cells by gene trapping, genetargeting, and Φ C31 integrase. Mol Reprod Dev, 2008，75 (7) : 1163-1175.)。(2)位點(diǎn)特異性好。動(dòng)物假attP位點(diǎn)的數(shù)量有限，而且<i)C31整合酶有作用于“整合熱點(diǎn)”的傾向性，整合特異性高。<tC31整合酶可在小鼠體外培養(yǎng)細(xì)胞、胚胎以及個(gè)體三個(gè)層次，有效識(shí)別同一位點(diǎn)mpsLl(Chr2)介導(dǎo)基因定點(diǎn)整合，該位點(diǎn)是小鼠基因組的整合熱點(diǎn)(OlivaresEC,et al.Site-specific genomic integration produces therapeutic Factor IXlevels in mice. Nat Biotechnol, 2002，20(II):1124-1128;Hollis RP, et al. Phageintegrases for the construction and manipulation of transgenic mammals. ReprodBiol Endocrinol, 2003，1(1) :79-83. )。BF4 (4q31)是?；蚪M的整合熱點(diǎn)，74% 的整合事件集中于該位點(diǎn)(57個(gè)克隆點(diǎn)中有42個(gè)是整合于BF4位點(diǎn))(0u HL, et al. A Φ031integrase—mediated integration hotspot in favor of transgene expression existsin the bovine genome. FEBS Journal, 2009，276 (I) : 155-163.)。此外整合酶還具有自主作用和介導(dǎo)單拷貝外源基因整合的優(yōu)勢。上述突出特點(diǎn)使得該酶在基因功能研究、基因治療、生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)基因生物研制等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。然而，與此形成強(qiáng)烈反差的是，該酶在豬基因組修飾方面的研究尚無公開報(bào)道。發(fā)明人于2012年3月I日檢索PubMed，以關(guān)鍵詞“PhiC31 integrase”查詢，檢出文獻(xiàn)113篇;以關(guān)鍵詞“PhiC31 integrase pig “查詢,檢出文獻(xiàn)為O篇。分析文獻(xiàn)的發(fā)表時(shí)間，發(fā)現(xiàn)有關(guān)<i)C31整合酶的研究呈現(xiàn)迅速增長的態(tài)勢1998-2002年間為8篇，2003-2007年間增至38篇，2008-2012年間達(dá)到67篇。發(fā)明人查詢到國家自然科學(xué)基金委近12年(1999-2011)共資助有關(guān)<i>C31整合酶的研究項(xiàng)目4項(xiàng)，均為近5年內(nèi)立項(xiàng)，但沒有與豬基因組修飾相關(guān)的項(xiàng)目。發(fā)明人登陸中國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(SIPO)和美國專利商標(biāo)局(USPTO)網(wǎng)站，查詢到與<i)C31整合酶有關(guān)的專利分別為10件和13件，均未涉及豬的研究。上述查詢顯示有關(guān)4C31整合酶的研究正逐漸引起重視，但其應(yīng)用范疇有待拓寬。因此，本發(fā)明的目的在于分離和鑒定豬基因組假attP位點(diǎn)，并闡釋其功能特征，為豬轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供新策略。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明人通過構(gòu)建含有attB序列的綠色熒光蛋白表達(dá)載體，并將其與4C31整合酶表達(dá)載體按照一定的摩爾比例轉(zhuǎn)染豬腎PK15細(xì)胞，以G418篩選單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。提取轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的基因組DNA，采用熱不對稱PCR，分離外源基因的整合位點(diǎn)。通過與野生型attP位點(diǎn)比對,得到豬假attP位點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供豬基因組內(nèi)可被鏈霉菌噬菌體<i)C31整合酶識(shí)別的假attP位點(diǎn)，其40bp的識(shí)別序列為5’ CCAAGGATTTGGATTTCATC Tgt gtatgctcagtactttt3’ (SEQ ID No. I);該位點(diǎn)在豬基因組的定位是I號染色體,watson鏈，坐標(biāo) 114220087-114220126。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供上述假attP位點(diǎn)用于在豬基因組內(nèi)整合外源基因，操作步驟包括(I)構(gòu)建、制備含有attB位點(diǎn)的外源基因表達(dá)載體和Φ C31整合酶表達(dá)載體；
(2)將上述2種載體按照5:1的摩爾比例轉(zhuǎn)染豬細(xì)胞；(3)G418加壓篩選單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。利用本發(fā)明提供的假attP位點(diǎn)，可以將外源基因在<i)C31整合酶的介導(dǎo)下以較高效率整合于豬基因組內(nèi)。該假attP位點(diǎn)位于豬基因組的基因間隔區(qū)，不影響內(nèi)源基因的表達(dá)，不影響豬細(xì)胞的正常生理功能，是一個(gè)安全位點(diǎn)。本發(fā)明將有力促進(jìn)外源基因定點(diǎn)整合技術(shù)在轉(zhuǎn)基因豬研究和生產(chǎn)中的應(yīng)用。除非特別指出或是單獨(dú)定義，本文所使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員共知的、無歧義的相同含義。本文所提及的所有已公開的專利申請和參考文獻(xiàn)均已通過完整引用的方式并入本申請中。


圖I含attB位點(diǎn)的綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-Cl-attB酶切鑒定右側(cè)泳道為Lamda DNA marker,左側(cè)泳道為AseI酶切pEGFP_Cl_attB載體產(chǎn)物，可見400bp的插入片段釋放出來，證明attB核心序列已經(jīng)成功構(gòu)建到外源基因表達(dá)載體上。圖2整合pEGFP-Cl-attB的豬轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系熒光照片右側(cè)照片為單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的亮視野，左側(cè)為該細(xì)胞系的熒光照片。顯示所有細(xì)胞發(fā)出均勻綠光，證明該細(xì)胞系的EGFP表達(dá)一致、強(qiáng)烈。圖3染色體步移產(chǎn)物電泳圖M為Ikb DNA ladder (Fermentas),右側(cè)依次為步移第一輪、第二輪、第三輪的PCR產(chǎn)物。第二輪可見清晰的特異產(chǎn)物，第三輪可見單一、銳利的特異產(chǎn)物。圖4整合位點(diǎn)的測序信號圖
下劃虛線表示豬基因組序列，下劃實(shí)線表示pEGFP-Cl-attB序列。測序結(jié)果表明pEGFP-Cl-attB在attB樞紐處斷裂整合到了豬基因組的特定位點(diǎn)。圖55'整合位點(diǎn)的確認(rèn)在整合位點(diǎn)的5'兩側(cè)設(shè)計(jì)跨界引物，擴(kuò)增豬基因組DNA與外源基因之間的片段，反證外源基因的插入位置。M為DL2000 DNA Ladder，I號泳道為水作模板，2號泳道為pEGFP-Cl-attB表達(dá)載體作模板，3號泳道為未修飾豬基因組DNA為模板，4號泳道為IOng轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系基因組DNA為模板，5號泳道為IOOng轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系基因組DNA為模板。顯示在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，PCR擴(kuò)增出540bp的特異片段，而在所有陰性對照中均無該片段。證明外源基因的插入位置與理論分析相符。圖63'整合位置的確認(rèn)在整合位點(diǎn)的5'兩側(cè)設(shè)計(jì)跨界引物，擴(kuò)增豬基因組DNA與外源基因之間的片 段，反證外源基因的插入位置。M為DL2000 DNA Ladder，I號泳道為水作模板，2號泳道為pEGFP-Cl-attB表達(dá)載體作模板，3號泳道為未修飾豬基因組DNA為模板，4號泳道為50ng轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系基因組DNA為模板。顯示在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，PCR擴(kuò)增出IlOObp的特異片段，而在所有陰性對照中均無該片段。證明外源基因的插入位置與理論分析相符。圖7豬轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系EGFP表達(dá)量培養(yǎng)基和PK15上清為陰性對照，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的EGFP表達(dá)量由GloMax Jr熒光計(jì)測定。顯示整合于本發(fā)明提供的豬假attP位點(diǎn)處的外源基因其EGFP表達(dá)量為陰性對照的50倍，證明該假attP位點(diǎn)可維持外源基因的高效表達(dá)。圖8豬假attP位點(diǎn)的染色體定位利用BLAT工具，將本發(fā)明提供的豬假attP位點(diǎn)定位于豬基因組，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)位于豬I號染色體的基因間隔區(qū)，其5’端鄰近基因?yàn)長0C100738975，3’端鄰近基因?yàn)長0C100151775。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以含有attB位點(diǎn)的綠色熒光蛋白表達(dá)載體為外源基因，以豬腎PK15細(xì)胞為宿主細(xì)胞，實(shí)施鏈霉菌噬菌體<i)C31整合酶介導(dǎo)的外源基因定點(diǎn)整合，并通過染色體步移技術(shù)分離得到豬基因組中可被鏈霉菌噬菌體<i)C31整合酶識(shí)別的假attP位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，對該位點(diǎn)的序列特征、基因組定位、外源基因表達(dá)等做出分析，闡明了該位點(diǎn)的功能特性。以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做詳細(xì)的闡釋。需要指出的是，本實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明的權(quán)利要求做出限制或限定。實(shí)施例I含attB位點(diǎn)的綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-Cl-attB的構(gòu)建(I)主要試劑與材料來源pBCPB+載體購自 Addgene, pEGFP-Cl-EGFP 購自 Clontech。Lamda DNA marker和AseI限制性內(nèi)切酶購自Fermentas。高保真DNA聚合酶KOD Plus及其配套的緩沖液(10 X buffer)，dNTP, MgSO4均購自東洋紡生物科技有限公司。重組載體按照北京天根生物科技有限公司提供的小提中量超純質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行。DNA割膠回收試劑盒購自Qiagen公司。測序委托深圳華大基因有限公司完成。
擴(kuò)增attB 序列的引物為 AttB-F:gtcattaatCGCCATTCAGGCTGCGCA(SEQ ID No. 2),AttB-R:gtcattaatCTCGGCCTCGACTCTAG (SEQ ID No. 3)。下劃線序列表示 AseI 酶切位點(diǎn)。引物由上海英駿生物科技有限公司合成，以干粉形式分裝、運(yùn)輸、保存。引物用TE緩沖液(ρΗ=8· O)稀釋為10 μ mo I/L的溶液，_20°C保存?zhèn)溆谩?2)操作步驟-以KODPlus擴(kuò)增attB序列，反應(yīng)體系組成為
權(quán)利要求
1.豬基因組內(nèi)可被鏈霉菌噬菌體4C31整合酶識(shí)別的假attP位點(diǎn)，其特征在于，其40bp 的識(shí)別序列為5’CCAAGGAirTGGAITTCATC Tgt gtatgctcagtactttt3’ ；該位點(diǎn)在豬基因組的定位是I號染色體，watson鏈，坐標(biāo)114220087-114220126。
2.權(quán)利要求I所述假attP位點(diǎn)用于在豬基因組內(nèi)整合外源基因，其特征在于，操作步驟包括 (1)構(gòu)建、制備含有attB位點(diǎn)的外源基因表達(dá)載體和4C31整合酶表達(dá)載體； (2)將上述2種載體按照5:1的摩爾比例轉(zhuǎn)染豬細(xì)胞； (3)G418加壓篩選單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了豬基因組假attP位點(diǎn)及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。本發(fā)明從豬基因組中分離到1個(gè)假attP位點(diǎn)，與野生型attP位點(diǎn)有40%的序列相似度，具有回文序列特征。該位點(diǎn)能被鏈霉菌噬菌體фC31整合酶所識(shí)別，從而介導(dǎo)含attB位點(diǎn)的外源基因以較高的效率整合于此位點(diǎn)。經(jīng)蛋白含量測定，該位點(diǎn)維持EGFP基因的表達(dá)水平是無外源基因組的50倍。本發(fā)明為豬轉(zhuǎn)基因的定點(diǎn)整合與高效表達(dá)提供了新的技術(shù)方案，為豬功能基因組研究提供了新策略，因此具有重要的科學(xué)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/10GK102796736SQ201210276350
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者畢延震, 鄭新民, 喬憲鳳, 劉西梅, 馬卓, 張龍, 周荊榮, 華文君, 李莉, 肖紅衛(wèi), 張立蘋, 華再東, 魏慶信 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所