專利名稱：一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
畜牧業(yè)規(guī)?；B(yǎng)豬產(chǎn)生的廢氣對周圍環(huán)境造成了較大的污染，而H2S是產(chǎn)生惡臭氣味的重要因素之一，可使畜禽生產(chǎn)性能下降，造成幼仔中毒死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活都造成較大的影響。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，培育減排H2S的環(huán)境友好型轉(zhuǎn)基因豬便成為可能，它可以從根本上緩解養(yǎng)殖場產(chǎn)生的環(huán)境問題。生活在潮濕惡臭環(huán)境中的光合細(xì)菌莢膜紅細(xì)菌capsulatus)中產(chǎn)生一種膜結(jié)合蛋白_硫化物醌氧化還原酶(Sulfide-quinone reductase, SQR),可以利用H2S作為氫供體為光合細(xì)菌提供能量。 雖然莢膜紅細(xì)菌可以產(chǎn)生SQR蛋白，但因該細(xì)菌生長條件較難控制，將其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)仍然受到限制，所以如何制備適于工業(yè)化生產(chǎn)的重組細(xì)菌成為目前研究的課題。外源蛋白的表達(dá)水平與多種因素有關(guān)，如啟動子和終止子的強(qiáng)弱、質(zhì)?？截悢?shù)、蛋白穩(wěn)定性、翻譯效率，表達(dá)系統(tǒng)和宿主的兼容性等。其中，宿主密碼子偏好性是影響外源蛋白表達(dá)的重要因素之一。無論在原核表達(dá)系統(tǒng)還是真核表達(dá)系統(tǒng)，稀有密碼子過多會嚴(yán)重影響蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)水平急劇下降；而偏離規(guī)范的密碼子，即不同的生物能把同種密碼子識別為不同的氨基酸，將直接導(dǎo)致了基因不能進(jìn)行異源表達(dá)或者只表達(dá)出無活性的蛋白質(zhì)。目前，克服制約瓶頸現(xiàn)象解決的主要策略是在不改變所編碼蛋白的氨基酸序列基礎(chǔ)上，通過序列定點突變或全基因合成手段，從基因本身更改特有的稀有密碼子從而實現(xiàn)功能蛋白的異源表達(dá)。而對于SQR蛋白的基因優(yōu)化目前還屬于空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還
原酶基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因的表達(dá)載體。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。本研究對sqr基因進(jìn)行優(yōu)化的時候兼顧以下幾個方面盡量使用偏好密碼子，以提高mRNA的翻譯效率；降低GC含量，調(diào)整基因AT含量，防止提前終止；去除sqr基因中影響mRNA有效翻譯和穩(wěn)定性的二級結(jié)構(gòu)；除去使mRNA不穩(wěn)定和降解的序列和結(jié)構(gòu)。實驗表明優(yōu)化后的基因在CHO細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均高于其原始基因序列。優(yōu)化后的sqr基因片段核苷酸序列與原序列比對相似性為81%，427個氨基酸中有228個氨基酸的密碼子得到優(yōu)化，優(yōu)化率達(dá)到54%。一種硫化物醌氧化還原酶的表達(dá)載體,該表達(dá)載體是由優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因插入到表達(dá)載體(也稱出發(fā)載體)的多克隆位點構(gòu)建而成。所述出發(fā)載體優(yōu)選原核表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體pRSET A、或真核表達(dá)載體pcDNA3. I。一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，是由上述硫化物醌氧化還原酶的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞構(gòu)建而成。本發(fā)明的優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因在制備轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本研究對光合細(xì)菌(莢膜紅細(xì)菌)中的硫化物醌還原酶(sqr)基因進(jìn)行了優(yōu)化，使其在表達(dá)量上高出正常菌株，從培育環(huán)境友好型動物新品種的角度出發(fā)，為轉(zhuǎn)基因豬的制備探路，以期從轉(zhuǎn)基因全新的角度降低養(yǎng)殖場中硫化氫氣體的排放，從根本上解決養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中的環(huán)境污染問題。


圖I.莢膜紅細(xì)菌sqr2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中1、2為sqr2基因；M :DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2 . sqr基因的信號肽預(yù)測。圖3. sqr基因優(yōu)化前后的CAI值及密碼子頻率分布。圖4. sqr基因優(yōu)化前后mRNA 二級結(jié)構(gòu)。圖5.重組質(zhì)粒pRSET A-sqr的菌液PCR鑒定，I 陰性對照；2飛=PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒pRSET A-sqr ；M DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6.不同誘導(dǎo)時間的pRSETA-sqr融合蛋白表達(dá)。0 :IPTG誘導(dǎo)空載體pRSETA的表達(dá)；M :分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ;1 7 :IPTG分別誘導(dǎo)0、2、4、5、6、7、8h時pRSETA-sqr的表達(dá)。圖7. SQR原核表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot驗證，M :分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ；1 pRSETA 載體；2 pRSETA-sqr2 融合蛋白。圖8. 15min內(nèi)不同濃度的decyl_UQ反應(yīng)情況(A)和雙倒數(shù)法求SQR酶的Km值(B)。圖9.真核表達(dá)載體 pcDNA3. I-SQR(A)與 pcDNA3. 1-SQR2 (B)的構(gòu)建。M DL5000marker ； I :重組載體；2 :重組載體的Xho I和Kpn I雙酶切結(jié)果。圖10. CHO細(xì)胞的總RNA抽提。圖11. sqr與sqr2的mRNA相對表達(dá)。圖 12. pcDNA3. 1-sqr 與 pcDNA3. I_sqr2 融合蛋白表達(dá)，SQR pcDNA3. 1-sqr 融合蛋白；SQR2: pcDNA3. I_sqr2融合蛋白；B pcDNA3. IB空載體；L :未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。圖13. sqr2轉(zhuǎn)基因小鼠總RNA抽提結(jié)果。圖14. sqr2基因在轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織的表達(dá)情況，1_13分別為心、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸道、肌肉、腮腺、頜下腺、舌下腺、水、陽性質(zhì)粒。圖15. Western blot驗證SQR蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠各組織的表達(dá)情況，a (_)、c(-):轉(zhuǎn)基因陰性小鼠；b (+)、d(+):轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。圖16. Western blot驗證SQR蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠各組織的表達(dá)情況的灰度值分析。圖17.小鼠代謝收集的氣體圖譜代謝產(chǎn)生的氣體(A)，糞便發(fā)酵產(chǎn)生的氣體(B)。
圖18.小鼠代謝和糞便發(fā)酵產(chǎn)生的氣體中H2S含量分析，其中A圖為小鼠代謝產(chǎn)生氣體中H2S含量，(NaHS-(+):飼喂日常飼料的轉(zhuǎn)基因陽性鼠；NaHS-(-):飼喂日常飼料的轉(zhuǎn)基因陰性鼠；NaHS+(+):飼喂添加0. 56 u mol/kg NaHS飼料的轉(zhuǎn)基因陽性鼠；NaHS+(-):飼喂添加0. 56 u mol/kg NaHS飼料的轉(zhuǎn)基因陰性鼠。B圖為糞便發(fā)酵產(chǎn)生的氣體中H2S含量，其中，(NaHS-(+):飼喂日常飼料的轉(zhuǎn)基因陽性鼠；NaHS-(-):飼喂日常飼料的轉(zhuǎn)基因陰性鼠；NaHS+(+):飼喂添加0. 56 u mol/kg NaHS飼料的轉(zhuǎn)基因陽性鼠；NaHS+(-):飼喂添加0. 56 u mol/kg NaHS飼料的轉(zhuǎn)基因陰性鼠。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實施例不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制，實施例中如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)實驗技術(shù)。實施例中所用生物材料來源如下
莢膜紅細(xì)菌{Rhodobacter capsulatus ):購于廣東省微生物研究所。pMD18-T vector、pMD20_T vector、大腸桿菌表達(dá)載體pRSET A、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)、DH5a感受態(tài)細(xì)胞均購自Takara公司。真核表達(dá)載體pcDNA3. I購自廣州英偉創(chuàng)津公司。實驗所用的Fvb和ICR小鼠購自廣州賽業(yè)公司。實施例I
一、莢膜紅細(xì)菌sqr基因的克隆 購買的莢膜紅細(xì)菌進(jìn)行復(fù)蘇擴(kuò)大培養(yǎng)。參照GenBank 上莢膜紅細(xì)菌 DSM155(Accession No. X97478. 2)的 sqr 基因序列，利用primer5. O、Genetool等軟件設(shè)ii^一對引物SI
F :5’ GAGCTGGCCGGTCTGAACTTC 3’(SEQ ID NO:2);
R:5’ CGCGCCTGTCCTTCGCCTCCGTGACA 3’ (SEQ ID NO:3)。利用上述引物，以提取的莢膜紅細(xì)菌基因組DNA為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增sqr基因。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖1，可見一條約1550bp的條帶。按Omega公司PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒說明書來進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收和提純，經(jīng)測序，片段長度為1547bp，其中包括1284bp的sqr基因全長⑶S。二、sqr基因的信號肽預(yù)測及密碼子優(yōu)化
將克隆所得的sqr基因通過網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫SignalP 4. 0 Sever信號肽預(yù)測(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)和DNAStar序列分析軟件對基因產(chǎn)物進(jìn)行信號妝的預(yù)測。為使sqr基因在小鼠體內(nèi)得到更高水平的表達(dá)從而更好的發(fā)揮功能，根據(jù)sqr在小鼠中表達(dá)的密碼子使用偏好性，使用GenScript稀有密碼子分析軟件對克隆所得的sqr基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，提高密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI值。同時，在sqr基因5'端分別添加豬腮腺蛋白基因的信號肽。SignalP 4.0預(yù)測結(jié)果中，C-Score預(yù)測待測氨基酸序列可能的切割位點，而且信號肽切割位點的C值最大。S-Score與C-Score結(jié)合起來更能準(zhǔn)確預(yù)測切割位點。切割處的Y-Score對應(yīng)的S值在曲線的波峰(谷)；C值峰值大。S-Mean是S值的平均數(shù)，而D-Mean是S-Mean和Y-Max的簡單平均數(shù)，是預(yù)測待測蛋白氨基酸序列為分泌型蛋白或非分泌型蛋白的標(biāo)準(zhǔn)。SignalP4. 0預(yù)測結(jié)果顯示(圖2):從莢膜紅細(xì)菌中擴(kuò)增得到的SQR沒有信號肽，非分泌型蛋白。故在對其進(jìn)行優(yōu)化時，5'端添加了豬腮腺蛋白的信號肽。sqr基因中攜帶稀有密碼子，會降低在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯效率。根據(jù)小鼠對密碼子的偏愛性，將sqr基因進(jìn)行了優(yōu)化，得到的新序列定為sqr2(SEQ ID NO: I)。序列比對結(jié)果顯示與sqr序列的相似性為81%，氨基酸序列未變。427個氨基酸中有228個氨基酸的密碼子發(fā)生優(yōu)化，優(yōu)化率達(dá)到54%。為提高sqr基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平，預(yù)測sqr2的CAI值由0. 79提高到0. 81(圖3)，經(jīng)過密碼子偏好性改造，GC含量得到了優(yōu)化，sqr基因的GC含量(GC%)由原來的64. 23%降為54. 95%，去除了一些重復(fù)序列，打破了一些莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖4)，避免其影響與核糖體結(jié)合的mRNA的穩(wěn)定性，延長了 mRNA的半衰期。sqr2全長基因序列為直接化學(xué)合成。
三、sqr2在大腸桿菌中的表達(dá) I. pRSET- sqr2表達(dá)載體構(gòu)建
以莢膜紅細(xì)菌基因組DNA為模板，以S2為引物，常規(guī)PCR擴(kuò)增sqr2基因。F: 5，CCGCTCGAGATGGCTCATATCGTGGTTCTG 3，(SEQ ID NO:4，下劃線部分為ZAo I酶切位點)；
R: 5’AACTCCAGTTACCCCTTCTTCACGGCCTTCAG3，(SEQ ID NO: 5，下劃線部分為I 酶切
位點)。PCR 反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性 3 min，I 個循環(huán)；94°C 30 s，61°C 30s,72°C 90s, 29個循環(huán)；72°C后延伸8 min。PCR產(chǎn)物回收，與pMD18_T simple載體克隆連接構(gòu)建成克隆載體T_sqr2進(jìn)行克隆擴(kuò)增，培養(yǎng)后選擇經(jīng)鑒定正確的陽性T_sqr2菌抽提質(zhì)粒(按Omega Plasmid Kit試劑盒操作)。將質(zhì)粒pRSET A與T_sqr2用通o I和I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建成原核表達(dá)載體pRSET-sqr2，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用Amp+抗生素平板進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑選10個單菌落用特異性引物利進(jìn)行PCR鑒定，在約1300bp處均出現(xiàn)一條亮帶，與預(yù)期大小相符(圖5，其中泳道I為陰性對照)。2.重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)
將重組表達(dá)質(zhì)粒pRSETA-sqr2和空質(zhì)粒pRSET A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)菌，涂板、挑囷；
2)在含Amp的LB培養(yǎng)基中371振蕩培養(yǎng)過夜后，取空載體的菌液和重組菌分別按1:100體積比接入含氨芐青霉素的3 mL和30 mL LB培養(yǎng)基中，220 r/min、37 °C振蕩培養(yǎng);
3)測0D600值為0.4 0. 6時，分別取出3 mL重組菌液/管，共7管(包含空載體pRSETA菌液)，并均加入0.4 mmol/L的IPTG 37 °C繼續(xù)培養(yǎng)l_8h，分別在誘導(dǎo)2、4、5、6、7、8h時各取I管。另外取I mL未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液對照；
4)將表達(dá)后的菌液按6500r/min離心3. 5 min，棄上清，加入80 u LI X電泳上樣緩沖液懸浮菌體，于各EP管中混勻，混勻后100°C煮沸5 min,短暫離心，吸取上清8 y L點樣，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳；5)電泳結(jié)果見圖6，不同誘導(dǎo)時間的全菌體經(jīng)12% SDS-PAGE后染色，與空載體對照菌和未誘導(dǎo)菌相比，均在相對分子量約為50kD處出現(xiàn)新的蛋白帶，說明SQR融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，隨誘導(dǎo)時間的延長，融合蛋白相對含量呈遞增趨勢，誘導(dǎo)6h表達(dá)產(chǎn)量達(dá)最高值，誘導(dǎo)時間再延長，表達(dá)產(chǎn)量不再增加。由此可見，用IPTG作為誘導(dǎo)物時，最佳誘導(dǎo)時間為4 h。將pRSET A-sqr2表達(dá)的融合蛋白命名為pRSET A-SQR06)將0.4 mmol /T, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h得到的SQR融合蛋白進(jìn)行Werstern-blot檢測，His標(biāo)簽抗體能特異與SQR融合蛋白上的His標(biāo)簽結(jié)合，在大約50 KDa處檢測到重組菌液中SQR的表達(dá)(圖7)。3. SQR蛋白的酶活分析
測定0D275 nm處添加不同泛醌濃度時SQR催化decylubiquinone (decyl-UQ)的反應(yīng)情況，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨后測定在不同底物濃度下分析SQR蛋白酶的活性，發(fā)現(xiàn)該酶在Na2S的存在下有一定的消化decyl-UQ的能力(圖8)。根據(jù)雙倒數(shù)法計算出該酶的Km 4 (圖8)。 實施例2 sqr基因優(yōu)化前后在CHO細(xì)胞系中的表達(dá)
真核表達(dá)載體pcDNA3. I_sqr/sqr2的構(gòu)建設(shè)計含有通01和治粘性末端的序列引物S3，序列如下
F: 5' -CCGCTCGAGATGTTTCAACTTTGGAAACTTGTTTTCTTGTGCGGTCTGCTCATTGGGACCTCAGCGTCTATGGCTCATATCGTG -3' (SEQ ID NO:6，ZAo I);
R: 5' - CGGGGTACCGACCCCTTCTTCACGGCCTT -3' (SEQ ID , Kpn I)。分別以sqr和Sqr2基因序列為模板，S3為引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆載體克隆后分別與質(zhì)粒pcDNA3. I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用連接酶連接，構(gòu)建成新的表達(dá)載體 pcDNA3. 1-sqr 和 pcDNA3. I_sqr2。對構(gòu)建的真核表達(dá)重組載體pcDNA3. l_sqr和pcDNA3. I_sqr2進(jìn)行測序，并用XhoI和Kpn I雙酶切檢測(圖9，圖中2泳道)，在5000bp和1300bp附近均有檢測到表達(dá)載體和sqr/sqr2基因的目的條帶，證明真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。四、sqr與sqr2基因mRNA的表達(dá)水平比較
所得的pcDNA3. 1-sqr和pcDNA3. I_sqr2無內(nèi)毒素抽提之后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系，同時用空載體pcDNA3. I以及未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞作對照。試劑盒提取轉(zhuǎn)染48 h后各組CHO細(xì)胞的總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖10，圖中清晰可見28S與18S條帶和一條微弱的5S條帶，這是由于用試劑盒抽提一般都會將5S破壞，因此5S條帶非常模糊。一般地，只要28S和18S 2條帶清晰，完整無拖帶，且28S帶的亮度是18S帶的兩倍，表明總RNA無降解。本實驗所提取的RNA完全符合這要求，并且總RNA經(jīng)Eppendorf核酸蛋白濃度測定儀測定,260 nm的吸收值與280 nm的吸收值比值均在I. 8 - 2.0之間，表明無蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)污染，提取的總RNA質(zhì)量完好，可以繼續(xù)進(jìn)行下游的反轉(zhuǎn)錄及實時定量檢測。通過Realtime-PCR檢測sqr、sqr2基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參作為對照，結(jié)果如圖11所示，實驗組細(xì)胞目的基因sqr2的mRNA表達(dá)水平是sqr的9倍之多，這表明pcDNA3. 1-sqr和pcDNA3. I_sqr2質(zhì)粒成功的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，sqr2的mRNA表達(dá)水平極顯著的高于sqr的表達(dá)水平(/ < 0. 001)。
Western blot檢測sqr基因優(yōu)化前后蛋白表達(dá)水平比較對瞬時轉(zhuǎn)染48h的CHO細(xì)胞進(jìn)行蛋白抽提，以小鼠內(nèi)參GAPDH做內(nèi)參，通過His標(biāo)簽抗體檢測pcDNA3. l_sqr與pcDNA3. I_sqr2融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)情況，Western blot結(jié)果表明(圖12)，轉(zhuǎn)染兩個表達(dá)載體的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基中均未檢測到SQR的表達(dá)，而在CHO細(xì)胞內(nèi)有SQR蛋白的表達(dá)，55KD處有目的條帶出現(xiàn)，且轉(zhuǎn)染了 pcDNA3. I_sqr2的CHO細(xì)胞中SQR蛋白的表達(dá)高于轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1-sqr的細(xì)胞組，進(jìn)一步說明優(yōu)化后的sqr2基因比sqr基因更適于在倉鼠卵巢細(xì)胞CHO中表達(dá)。實施例3顯微注射法制備sqr2轉(zhuǎn)基因小鼠
將優(yōu)化后的基因sqr2插入到轉(zhuǎn)基因載體的多克隆位點構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，進(jìn)行顯微注射小鼠(由廣州賽業(yè)公司完成)，一共注射了 350枚受精卵，第一次注射200個，存活 155個，移植6只代孕鼠，出生9只小鼠(部分死亡)。第二次注射150個卵，存活110個，移植4只代孕鼠，出生17只小鼠。首建者轉(zhuǎn)基因小鼠在6周齡左右與非轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行第一次交配，獲得F1代小鼠，斷奶后又再次交配，小鼠傳代情況見表I所示。對出生的后代小鼠進(jìn)行PCR檢測，根據(jù)陽性轉(zhuǎn)基因小鼠的數(shù)量可以計算遺傳率。結(jié)果表明pPSP- sqr2轉(zhuǎn)基因小鼠中15、35號不能將導(dǎo)入的外源基因遺傳給后代，其余的14、16、33、34、36號Ftl小鼠都能遺傳給后代，其中14、16號遺傳概率最高,36號遺傳概率較高,33、34號遺傳率較低。表I轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代
權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種硫化物醌氧化還原酶的表達(dá)載體，其特征在于由權(quán)利要求I所述優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因插入到表達(dá)載體的多克隆位點構(gòu)建而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述硫化物醌氧化還原酶的表達(dá)載體，其特征在于所述原核表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體pRSET A或真核表達(dá)載體pcDNA3. I。
4.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于由權(quán)利要求2所述硫化物醌氧化還原酶的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞構(gòu)建而成。
5.權(quán)利要求I所述優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因在制備轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達(dá)載體，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因(sqr)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。優(yōu)化后的sqr基因片段核苷酸序列與原序列比對相似性為81%，427個氨基酸中有228個氨基酸的密碼子得到優(yōu)化，優(yōu)化率達(dá)到54%。本發(fā)明從培育環(huán)境友好型動物新品種的角度出發(fā)，為轉(zhuǎn)基因動物的制備探路，以期從轉(zhuǎn)基因全新的角度降低動物養(yǎng)殖場中硫化氫氣體的排放，從根本上解決養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的環(huán)境污染問題。
文檔編號C12N15/63GK102719454SQ20121019761
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月15日
發(fā)明者張哲 , 張豪, 李加琪, 賀艷芬 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)