專利名稱：一種將多個基因同時導(dǎo)入微生物基因組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將多個基因同時導(dǎo)入微生物基因組的方法。
背景技術(shù)：
能源、人口及環(huán)境問題是當(dāng)前的主要問題，如果將豐富的可再生資源轉(zhuǎn)化成生物能源，不僅解決了能源與環(huán)境的問題，同時還節(jié)約了糧食、解決了由人口眾多帶來的糧食問題。
目前基因工程改造已經(jīng)成為提高工業(yè)微生物菌種水平，推動生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的核心技術(shù)。基因工程改造的一個重要方向是在宿主菌中導(dǎo)入新的基因或提高原有基因的表達(dá)量，可以通過將含有目的基因片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌實(shí)現(xiàn)，也可以通過將目的基因片段插入到重組載體上轉(zhuǎn)化宿主菌從而重組到基因組上實(shí)現(xiàn)，其中后者由于在菌種傳代過程中更加穩(wěn)定而在工業(yè)生產(chǎn)中得到更優(yōu)先的應(yīng)用。以釀酒酵母為例，其具有較強(qiáng)的抗逆性，是生產(chǎn)酒精較為理想的生產(chǎn)菌株，在食品、發(fā)酵等工業(yè)領(lǐng)域已有大量應(yīng)用。隨著近年來對釀酒酵母生理生化性能和發(fā)酵水平等要求的不斷提高，越來越需要進(jìn)行多基因操作。釀酒酵母同源重組發(fā)生的概率非常高，線性DNA片段導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中可以很容易在同源序列處發(fā)生同源重組，這使得在釀酒酵母中很容易實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)、基因中斷、基因置換等等。但是，當(dāng)所需要的表達(dá)基因過多時，具有如下局限性一方面載體構(gòu)建比較困難，同時需要多次連接轉(zhuǎn)化；另一方面如果載體過大，轉(zhuǎn)化比較困難，不容易得到重組菌株；如果借助整合載體，基因的拷貝數(shù)往往也較低，不易實(shí)現(xiàn)外源基因的聞效表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種將多個基因同時導(dǎo)入微生物基因組的方法。本發(fā)明提供了一種制備表達(dá)多個外源基因的重組微生物的的方法，包括如下步驟將各個基因的表達(dá)盒一起導(dǎo)入宿主微生物，得到將所述多個外源基因整合入基因組并表達(dá)所述多個外源基因的重組微生物；當(dāng)所述多個外源基因?yàn)閮蓚€外源基因時，第一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有同源臂甲，第二個基因的表達(dá)盒的3’末端具有同源臂乙，第一個基因的表達(dá)盒的3’末端與第二個基因的表達(dá)盒的5’末端具有相同的同源臂；當(dāng)所述多個外源基因?yàn)槿齻€外源基因時，第一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有所述同源臂甲，第三個基因的表達(dá)盒的3’末端具有所述同源臂乙，第二個基因的表達(dá)盒的5’末端與第一個基因的表達(dá)盒的3’末端具有相同的同源臂，第二個基因的表達(dá)盒的3’末端與第三個基因的表達(dá)盒的5’末端具有相同的同源臂；當(dāng)所述多個外源基因?yàn)樗膫€以上外源基因時，第一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有所述同源臂甲，最后一個基因的表達(dá)盒的3’末端具有所述同源臂乙，每個基因的表達(dá)盒的3’末端和下一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有相同的同源臂；
所述同源臂甲和所述同源臂乙可以與所述宿主微生物的基因組發(fā)生同源重組。每個基因的表達(dá)盒均包括啟動子、所述基因和終止子。所述宿主微生物可為具有高效率的基因重組能力的原核微生物或真核微生物，具體可為酵母，優(yōu)選為釀酒酵母。所述同源重組的位點(diǎn)可為所述宿主微生物染色體DNA的任意位點(diǎn)，優(yōu)選為所述宿主微生物的18srDNA或26srDNA。每個所述同源臂的長度均為50bp以上。所述同源臂甲具體可如序列表的序列I自5’末端第I至766位核苷酸所示。
所述同源臂乙具體可如序列表的序列2自5’末端第2425至3148位核苷酸所示。所述同源臂甲具體可如序列表的序列7自5’末端第I至1180位核苷酸所示。所述同源臂乙具體可如序列表的序列8自5’末端第1165至2281位核苷酸所示。當(dāng)所述多個外源基因?yàn)閮蓚€外源基因時第一個基因的表達(dá)盒自5’末端至3’末端依次為如下元件序列表的序列7自5’末端第I至1180位核苷酸所示的同源臂甲、序列表的序列7自5’末端第1181至1778位核苷酸所示的PGK啟動子、第一個基因、序列表的序列7自5’末端第3120至3460位核苷酸所示的AOX終止子；第二個基因的表達(dá)盒自5’末端至3’末端依次為如下元件序列表的序列8自5’末端第I至341位核苷酸所示的AOX終止子、序列表的序列8自5’末端第342至443位核苷酸所示的色氨酸啟動子、第二個基因、序列表的序列8自5’末端第1119至1164位核苷酸所示的色氨酸終止子、序列表的序列8自5’末端第1165至2281位核苷酸所示的同源臂乙。當(dāng)所述多個外源基因?yàn)槿齻€外源基因時第一個基因的表達(dá)盒自5’末端至3’末端依次為如下元件序列表的序列I自5’末端第I至766位核苷酸所示的同源臂甲、序列表的序列I自5’末端第767至1444所示的GPD啟動子、第一個基因、序列表的序列I自5’末端第2759至3047位核苷酸所示的CYC終止子；第二個基因的表達(dá)盒自5’末端至3’末端依次為如下元件序列表的序列2自5’末端第I至289位核苷酸所示的CYC終止子、序列表的序列2自5’末端第290至887位核苷酸為PGK啟動子、第二個基因、序列表的序列2自5’末端第2691至3236位核苷酸所示的ADHl終止子、序列表的序列2自5’末端第3237至4643位核苷酸所示的ADHl啟動子；第三個基因的表達(dá)盒自5’末端至3’末端依次為如下元件序列表的序列3自5’末端第I至1407位核苷酸所示的ADHl啟動子、第三個基因、序列表的序列3自5’末端第2224至2424位核苷酸所示的組氨酸終止子、序列表的序列3自5’末端第2425至3148位核苷酸所示的同源臂乙。所述多個外源基因可為木糖異構(gòu)酶基因、木酮糖激酶基因和G418基因；所述木糖異構(gòu)酶如序列表的序列4所示；所述木酮糖激酶如序列表的序列5所示；所述G418如序列表的序列6所不。所述木糖異構(gòu)酶基因具體可如序列表的序列I自5’末端第1445至2758位核苷酸所示。所述木酮糖激酶基因具體可如序列表的序列2自5’末端第888至2690位核苷酸所示。所述G418基因具體可如序列表的序列3自5’末端第1408至2223位核苷酸所示。所述木糖異構(gòu)酶基因的表達(dá)盒優(yōu)選如序列表的序列I所示；所述木酮糖激酶基因的表達(dá)盒優(yōu)選如序列表的序列2所不；所述G418基因的表達(dá)盒優(yōu)選如序列表的序列3所不。所述宿主微生物具體可為釀酒酵母W303-1B。采用本段方案得到的微生物命名為重組微生物甲。
所述多個外源基因可為NADH氧化酶基因和色氨酸基因；所述NADH氧化酶基因如序列表的序列9所不；所述色氣酸基因編碼序列表的序列10所不的蛋白質(zhì)。所述NADH氧化酶基因具體可如序列表的序列7自5’末端第1779至3119位核苷酸所示。所述色氨酸基因具體可如序列表的序列8自5’末端第443至1118位核苷酸所示。所述NADH氧化酶基因的表達(dá)盒優(yōu)選如序列表的序列7所不；所述色氣酸基因的表達(dá)盒優(yōu)選如序列表的序列8所示。所述宿主微生物具體可為重組微生物甲。任一所述方法得到的重組微生物均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了在微生物體內(nèi)將多個基因一步整合到基因組上的方法，該方法利用同源重組的原理，將所需要的多個基因表達(dá)盒同時導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，通過體內(nèi)自身同源重組的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)將多個基因按照一定順序一步定點(diǎn)整合。通過該方法，可以將目標(biāo)代謝途徑所含多個基因一步導(dǎo)入宿主菌株中，并按所設(shè)定的順序排列，直接獲得所需要的工程菌株， 避免多次轉(zhuǎn)化及載體構(gòu)建所帶來的麻煩。


圖I為表達(dá)木糖代謝途徑重組菌株功能性鑒定的結(jié)果.圖2為表達(dá)NADH氧化酶重組菌株功能鑒定的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例I、在釀酒酵母中構(gòu)建木糖異構(gòu)代謝途徑本實(shí)施例在釀酒酵母中表達(dá)木糖異構(gòu)酶基因(XI基因)和木酮糖激酶基因(XK基因)，同時表達(dá)篩選標(biāo)記基因(G418基因)；為增加拷貝數(shù)，本實(shí)施例選擇的基因組整合位點(diǎn)為多拷貝的18srDNA整合位點(diǎn)。一、木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)盒的犾得人工合成木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)盒(又稱Cl片段，3047bp)，即序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子(序列I中，自5’末端第I至766位核苷酸為釀酒酵母18srDNA的同源序列甲、第767至1444位核苷酸為GPD啟動子、第1445至2758位核苷酸為XI基因、第2759至3047位核苷酸為CYC終止子)。其中，XI基因編碼序列表的序列4所示的蛋白質(zhì)。二、木酮糖激酶基因表達(dá)盒的獲得人工合成木酮糖激酶基因表達(dá)盒(又稱C2片段，4643bp)，即序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子(序列2自5’末端第I至289位核苷酸為CYC終止子、第290至887位核苷酸為PGK啟動子、第888至2690位核苷酸為XK基因、第2691至3236位核苷酸為ADHl終止子、第3237至4643位核苷酸為ADHl啟動子)。其中，XK基因編碼序列表的序列5所不的蛋白質(zhì)。三、篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒的獲得人工合成篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒(又稱C3片段，3148bp)，即序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子(序列3中，自5’末端第I至1407位核苷酸為ADHl啟動子、第1408至2223位核苷酸為G418基因、第2224至2424位核苷酸為組氨酸終止子、第2425至3148位核苷酸為釀酒酵母18srDNA的同源序列乙)。其中，G418基因編碼序列表的序列6所示的蛋白質(zhì)。四、三個表達(dá)盒的綜合分析以上三個表達(dá)盒中，木糖異構(gòu)酶基因表達(dá)盒中的CYC終止子可以和木酮糖激酶基因表達(dá)盒中的CYC終止子發(fā)生同源重組，木酮糖激酶基因表達(dá)盒中的ADHl啟動子可以和篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒中的ADHl啟動子發(fā)生同源重組。ISsrDNA的同源序列甲為體內(nèi)整合位點(diǎn)同源臂前半段，ISsrDNA的同源序列乙為體內(nèi)整合位點(diǎn)同源臂后半段。五、重組菌的獲得
釀酒酵母(W303-1B ;野生型釀酒酵母)購自歐洲釀酒酵母菌種庫，EUROpeanSaccharomyces Cerevisiae 編號 20000A 的菌株 BMA64-1A,網(wǎng)址為 http://web,uni-frankfurt. de/fbl5/mikro/euroscarf/data/w303. html)。將等摩爾的Cl片段、C2片段和C3片段同時電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后在含200 u g/ml G418的YPD固體培養(yǎng)基上30°C倒置培養(yǎng)(3_4天可以觀察到菌落出現(xiàn))，采用梯度稀釋法在含200 u g/ml G418的YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，共獲得10株純培養(yǎng)的菌株(重組菌甲)。六、重組菌的功能鑒定以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基(pH 5. 5):溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下酵母氮堿
0.67g/100mL, 2g/100mL 木糖，lOmg/lOOml 尿卩密唳，lOmg/lOOmL 組氨酸，lOmg/lOOmL 色氨酸，IOmg/1OOmL 亮氨酸。從步驟五得到的重組菌甲中隨機(jī)取3株和野生型釀酒酵母一起分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)將菌株接種至以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基，使其初始OD6tltl=O. 2，然后30°C、220rpm(振蕩半徑3cm)振蕩培養(yǎng)120小時。分別于25小時、50小時、75小時、100小時、120小時
和145小時取樣并檢測OD6tltl值，結(jié)果見圖I (三株重組菌甲，每株菌進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值；野生型釀酒酵母進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值)。結(jié)果表明，在木糖培養(yǎng)基中，野生型釀酒酵母菌株生長緩慢，而重組菌則能快速生長。即本實(shí)施例中通過導(dǎo)入木糖異構(gòu)酶基因、木酮糖激酶基因和篩選標(biāo)記基因成功構(gòu)建并篩選得到了具有木糖異構(gòu)代謝途徑的釀酒酵母，并且該代謝途徑中的兩個基因都得到了高效表達(dá)。實(shí)施例2、在釀酒酵母中表達(dá)NADH氧化酶基因本實(shí)施例在實(shí)施例I得到的重組菌中表達(dá)NADH氧化酶基因(noxE基因)，以減少木糖發(fā)酵中木糖醇的產(chǎn)生；為了增加拷貝數(shù)，本案例選擇釀酒酵母中26srDNA做為基因整合位點(diǎn)。一、NADH氧化酶基因表達(dá)盒的構(gòu)建人工合成NADH氧化酶基因表達(dá)盒(又稱C4片段，3460bp)，即序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子(序列7自5’末端第I至1180位核苷酸為釀酒酵母26srDNA的同源序列甲、第1181至1778位核苷酸為PGK啟動子、第1779至3119位核苷酸為noxE基因、第3120至3460位核苷酸為AOX終止子)。其中，noxE基因編碼序列表的序列9所示的蛋白質(zhì)。二、篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒的構(gòu)建(trp_)人工合成篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒(又稱C5片段，2281bp)，即序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子(序列8自5’末端第I至341位核苷酸為AOX終止子、第342至443位核苷酸為色氨酸啟動子、第444至1118位核苷酸為色氨酸基因、第1119至1164位核苷酸為色氨酸終止子、第1165至2281位核苷酸為釀酒酵母26srDNA的同源序列乙)。其中，色氨酸基因編碼序列表的序列10所不的蛋白質(zhì)。三、兩個表達(dá)盒的綜合分析以上兩個個表達(dá)盒中，NADH氧化酶基因表達(dá)盒中的AOX終止子可以和篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒中的AOX終止子發(fā)生同源重組。26srDNA的同源序列甲為體內(nèi)整合位點(diǎn)同源臂前半段，26srDNA的同源序列乙為體內(nèi)整合位點(diǎn)同源臂后半段。 四、重組菌的獲得營養(yǎng)缺陷型選擇平板(pH5. 5):溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下酵母氮堿
0.67g/100mL, 2g/100mL 葡萄糖，10mg/100mL 尿卩密卩定，IOmg/1OOmL 組氨酸，10mg/100mL 亮氨酸。將等摩爾的C4片段、C5片段同時電擊轉(zhuǎn)化實(shí)施例I得到的重組菌的感受態(tài)細(xì)胞，然后在營養(yǎng)缺陷型選擇平板上30°C倒置培養(yǎng)(3-4天可以觀察到菌落出現(xiàn))，采用梯度稀釋法在營養(yǎng)缺陷型選擇平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，共獲得20株純培養(yǎng)的菌株(重組菌乙)。五、重組菌的功能的鑒定木糖發(fā)酵培養(yǎng)基(YPX培養(yǎng)基，pH5. 5):溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下酵母粉IOg/L,蛋白胨20g/L，木糖45g/L。從步驟四得到的重組菌乙中隨機(jī)取3株菌和實(shí)施例I得到的重組菌甲一起，分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)(I)將菌株接種至YPD培養(yǎng)基，30°C、220rpm (振蕩半徑3cm)振蕩培養(yǎng)至0D6(I(I=8，即菌株達(dá)到對數(shù)生長期,離心(4500rpm, IOmin)收集菌體。(2)將步驟(I)收集的菌體接種至木糖發(fā)酵培養(yǎng)基，使其初始濃度為0D_=8，然后30°C靜止培養(yǎng)。分別于0小時、7小時、23小時、31小時和48小時和57小時取樣并檢測木
糖醇濃度。檢測木糖醇濃度的方法將發(fā)酵液13000rpm常溫離心2min，0. 22 u m濾膜過濾后，取濾液進(jìn)行HPLC ；HPLC采用Bio-rad HPX-87H柱子，流動相為0. 5mM硫酸水溶液，流動相流速為0. 55mL/min ;木糖醇標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司，貨號X3375)的出峰時間13. 3min, 10g/L木糖醇標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為2486387，所以木糖醇濃度與峰面積的函數(shù)為Y=X/2486387*10(Y代表木糖醇濃度，單位為g/L ;x代表峰面積)。結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，實(shí)施例I得到的重組菌NADH輔酶過量導(dǎo)致大量木糖醇積累，而實(shí)施例2的步驟四得到的重組菌在NADH氧化酶的幫助下，減少了對木糖醇的積累。即本實(shí)施例中通過導(dǎo)入NADH氧化酶基因和篩選標(biāo)記基因成功構(gòu)建并篩選得到了高效表達(dá)NADH氧化酶基因的釀酒酵母。
權(quán)利要求
1.一種制備表達(dá)多個外源基因的重組微生物的方法，包括如下步驟將各個基因的表達(dá)盒一起導(dǎo)入宿主微生物，得到將所述多個外源基因整合入基因組并表達(dá)所述多個外源基因的重組微生物； 當(dāng)所述多個外源基因?yàn)閮蓚€外源基因時，第一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有同源臂甲，第二個基因的表達(dá)盒的3’末端具有同源臂乙，第一個基因的表達(dá)盒的3’末端與第二個基因的表達(dá)盒的5’末端具有相同的同源臂； 當(dāng)所述多個外源基因?yàn)槿齻€外源基因時，第一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有所述同源臂甲，第三個基因的表達(dá)盒的3’末端具有所述同源臂乙，第二個基因的表達(dá)盒的5’末端與第一個基因的表達(dá)盒的3’末端具有相同的同源臂，第二個基因的表達(dá)盒的3’末端與第三個基因的表達(dá)盒的5’末端具有相同的同源臂； 當(dāng)所述多個外源基因?yàn)樗膫€以上外源基因時，第一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有所述 同源臂甲，最后一個基因的表達(dá)盒的3’末端具有所述同源臂乙，每個基因的表達(dá)盒的3’末端和下一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有相同的同源臂； 所述同源臂甲和所述同源臂乙可以與所述宿主微生物的基因組發(fā)生同源重組。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于每個基因的表達(dá)盒均包括啟動子、所述基因和終止子。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述宿主微生物為酵母，優(yōu)選為釀酒酵母。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述同源重組的位點(diǎn)為所述宿主微生物的18srDNA 或 26srDNA。
5.如權(quán)利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述多個外源基因?yàn)槟咎钱悩?gòu)酶基因、木酮糖激酶基因和G418基因；所述木糖異構(gòu)酶如序列表的序列4所示；所述木酮糖激酶如序列表的序列5所不；所述G418基因編碼序列表的序列6所不的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述木糖異構(gòu)酶基因如序列表的序列I自5’末端第1445至2758位核苷酸所示；所述木酮糖激酶基因如序列表的序列2自5’末端第888至2690位核苷酸所示；所述G418基因如序列表的序列3自5’末端第1408至2223位核苷酸所示。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述木糖異構(gòu)酶基因的表達(dá)盒如序列表的序列I所示；所述木酮糖激酶基因的表達(dá)盒如序列表的序列2所示；所述G418基因的表達(dá)盒如序列表的序列3所示。
8.如權(quán)利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述多個外源基因?yàn)镹ADH氧化酶基因和色氨酸基因；所述NADH氧化酶基因如序列表的序列9所示；所述色氨酸基因編碼序列表的序列10所不的蛋白質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述NADH氧化酶基因如序列表的序列7自5’末端第1779至3119位核苷酸所示；所述色氨酸基因如序列表的序列8自5’末端第444至1118位核苷酸所示。
所述NADH氧化酶基因的表達(dá)盒具體如序列表的序列7所示；所述色氨酸基因的表達(dá)盒具體如序列表的序列8所； 所述宿主微生物具體為權(quán)利要求5至7中任一所述方法制備得到的重組微生物。
10.權(quán)利要求I至9中任一所述方法得到的重組微生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將多個基因同時導(dǎo)入微生物基因組的方法。本發(fā)明提供了制備表達(dá)多個外源基因的重組微生物的方法，包括如下步驟將各個基因的表達(dá)盒一起導(dǎo)入宿主微生物，得到將多個外源基因整合入基因組并表達(dá)所述多個外源基因的重組微生物；第一個基因的表達(dá)盒的5’端具有同源臂甲，最后一個基因的表達(dá)盒的3’端具有同源臂乙，每個基因的表達(dá)盒的3’末端和下一個基因的表達(dá)盒的5’末端具有相同的同源臂；所述同源臂甲和所述同源臂乙可與所述宿主微生物的基因組發(fā)生同源重組。通過該方法，可以將目標(biāo)代謝途徑所含多個基因一步導(dǎo)入宿主菌株中，并按所設(shè)定的順序排列，直接獲得所需要的工程菌株，避免多次轉(zhuǎn)化及載體構(gòu)建所帶來的麻煩。
文檔編號C12R1/865GK102719481SQ20121019699
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者孫紅兵, 張博, 張延平, 朱泰承, 李寅, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所