專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因魚類細胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物指示物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因魚類細胞及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)境中的遺傳毒物能直接或間接地損傷生物體的DNA，使基因和染色體發(fā)生突變而誘發(fā)腫瘤，甚至通過生殖細胞將這種損傷傳遞給后代，危害人類健康和動植物的生存。因此，建立快速有效的遺傳毒性檢測技術(shù)和評價體系具有重大意義。目前的遺傳毒性的檢測終點可分為4大類基因突變、DNA損傷、染色體損傷和染色體組損傷。雖然目前已建立的遺傳毒性檢測技術(shù)有200多種，但真正經(jīng)過驗證有合適的靈敏度和特異性的檢測方法只有十幾種。而且由于一種遺傳毒性檢測方法通常只能反映一個或兩個遺傳學(xué)終點，不能涵蓋所有的遺傳學(xué)終點，故要對某種藥品的遺傳毒性做出準確評價，往往需要進行多個遺傳毒性檢測實驗。我國常用的方法有微生物回復(fù)突變實驗(如Ames實驗)、哺乳動物培養(yǎng)細胞染色體畸變實驗、嚙齒動物微核實驗和體外真核細胞基因突變實驗等。如體內(nèi)誘變實驗顯示I個或以上陽性結(jié)果，則還需要進行生殖細胞遺傳毒性測試。細菌Ames實驗是檢測基因突變的常用方法，快速簡便，特異性高，但靈敏性偏低，不能檢測與真核細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的遺傳毒性效果，代表性差。微核實驗和染色體畸變實驗涉及到染色體的制備，實驗操作難度大，比較慢。酵母和哺乳動物細胞基因突變實驗也存在靈敏度低的問題。彗星實驗用于檢測DNA損傷快速靈敏，但假陽性率高?；铙w動物實驗如轉(zhuǎn)LacZ基因小鼠突變實驗，成本高，實驗難度大，只有少數(shù)實驗室有能力做。隨后，為實現(xiàn)遺傳毒性檢測的快速和高通量，人們又發(fā)展出報告基因檢測系統(tǒng)，即將綠色熒光蛋白基因(GFP)和熒光素酶基因(Iuc)與DNA損傷反應(yīng)相關(guān)基因的啟動子相連接，通過檢測熒光信號的變化來檢測細胞內(nèi)的DNA損傷。RAD54基因是酵母細胞中的DNA損傷修復(fù)基因，目前已有多種以RAD54基因啟動子驅(qū)動的GFP或Iuc報告基因遺傳毒性檢測系統(tǒng)在酵母中建立起來，并且具有較高的特異性和靈敏性，也適于高通量篩選(ffalmsley et al.,1997. Yeast 13,1535-1545 ;Billinton et al.,1998.Biosensors &Bioelectronics 13，831-838 ;Liu et al.,2008.Mutation Research 653,63-69)。在哺乳動物細胞中存在p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)細胞暴露于具有遺傳毒性的化學(xué)物質(zhì)而出現(xiàn)DNA損傷時，p53信號通路可以感受這種損傷信號，上調(diào)細胞內(nèi)p53蛋白的水平。P53是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠識別并激活其下游一系列靶基因的表達，例如DNA修復(fù)基因P53R2、生長停滯和DNA修復(fù)基因GADD45a和細胞周期抑制因子p21基因等，引起細胞生長停滯，進行DNA修復(fù)，如果損傷太嚴重而無法修復(fù)的話，則啟動細胞凋亡。因此，p53又是一種腫瘤抑制因子，并被稱為“基因組衛(wèi)士”，在維持基因組的穩(wěn)定上起重要作用?？傊?，將這些基因的啟動子與報告基因相連，并整合到哺乳動物細胞基因組中，得到的轉(zhuǎn)基因細胞就可以用于藥品或環(huán)境樣品的遺傳毒性檢測。Ohno等(2005，2006)將由P53R2基因啟動子驅(qū)動的熒光素酶重構(gòu)基因(P53R2-1UC)導(dǎo)入人的培養(yǎng)細胞(p53+)中，構(gòu)建了人轉(zhuǎn)基因細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)(Ohno et al. , 2005. Mutation Research 588,47-57 ;0hno et al.，2008. Mutation Research 656，27-35)。用各種遺傳毒物和非遺傳毒物處理該細胞，然后檢測熒光素酶基因的表達，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)操作簡便，具有很好的專ー性和靈敏性。Hastwell等(2006,2009)將GADD45a基因啟動子驅(qū)動的GFP重構(gòu)基因(GADD45a_GFP)導(dǎo)入人的TK6細胞(P53+)中，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的人轉(zhuǎn)基因細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)具有較高的專ー性和靈敏性(Hastwell et al.,2006. Mutation Research 607,160-175 ;Hastwell et al.,2009.Mutagenesis24(5) ,455-463)。最近，Zager 等(2010)又將 p21 基因啟動子驅(qū)動的 GFP 重構(gòu)基因(P21-GFP)導(dǎo)入人肝癌細胞H印G2(p53+)中，成功構(gòu)建了哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)建立在DNA損傷介導(dǎo)的p21基因的表達基礎(chǔ)上，快速簡便，具有較高的專ー性和靈敏性(Zager et al. , 2010. Radiol. Oncol. 44 (I), 42-51)。但是，這些已建立的基于p53信號通路對DNA損傷反應(yīng)基礎(chǔ)上的哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)，還存在以下幾個問題(I)哺乳動物細胞系大多來源于腫瘤組織，而50%以上的腫瘤組織細胞中的P53基因或p53通路相關(guān)基因發(fā)生了突變，因此可利用的哺乳動 物細胞并不多。(2)哺乳動物細胞對培養(yǎng)條件的要求高，培養(yǎng)溫度需要恒定在37°C，需要專門的培養(yǎng)設(shè)備CO2培養(yǎng)箱，這制約了這些遺傳毒性感受細胞的運輸和商品化。(3)腫瘤細胞生長快，需要每隔3-5天更換培養(yǎng)基，使這些遺傳毒性感受細胞商品化后的保質(zhì)期難以令人滿意。⑷細胞中GFP的表達量要足夠高，熒光信號的強度才能達到檢測要求。因此，GFP報告基因檢測系統(tǒng)需要設(shè)定閾值，相對熒光信號(即遺傳毒物處理組GFP熒光強度/未處理組GFP熒光強度)需要大于此閾值才能認定為陽性結(jié)果。(5)處理組與對照組之間的細胞接種密度差異和取樣誤差等可顯著影響檢測結(jié)果。因此，有必要建立ー種非哺乳動物的細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種轉(zhuǎn)基因魚類細胞及其應(yīng)用，即能用于遺傳毒性檢測的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明將含有螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)報告基因的質(zhì)粒和含有海腎熒光素酶基因(Renilla luciferase)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到牙鲆鰓細胞中建立了轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc，該轉(zhuǎn)化細胞可以有效地對環(huán)境中的有毒物質(zhì)進行指示，從而促成了本發(fā)明。本發(fā)明的ー個方面涉及ー個轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc，其保藏編號為CCTCC C201251，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏單位地址湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏中心，保藏日期2012年4月25日。該轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞攜帶有表達螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)報告基因的質(zhì)粒pGL3-p21-Iuc (螢火蟲熒光素酶由人p21基因啟動子驅(qū)動)和含有表達海腎熒光素酶基因(Renilla luciferase)的質(zhì)粒pRL-CMV_luc (海腎熒光素酶由細胞肥大病毒啟動子CMV驅(qū)動)。本發(fā)明的另ー個方面涉及到轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞的應(yīng)用，用于指示環(huán)境樣品或化學(xué)藥品的遺傳毒性。本發(fā)明還涉及ー個遺傳毒性檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)用轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞作為生物指示物。該遺傳毒性檢測系統(tǒng)的使用方法如下以不同濃度的環(huán)境樣品或化學(xué)藥品處理轉(zhuǎn)基因細胞；24小時后，收集處理后的轉(zhuǎn)基因細胞進行裂解；測定各個細胞裂解液樣品的螢火蟲熒光發(fā)光值RLU和海腎熒光發(fā)光值RLU，計算每個樣品的相對熒光比值螢火蟲熒光RLU/海腎熒光RLU ;然后根據(jù)該比值的大小繪制劑量效應(yīng)曲線，根據(jù)該曲線的變化趨勢，評價所檢測環(huán)境樣品或化學(xué)藥品的遺傳毒性大小。本發(fā)明的牙鲆鰓細胞p2IFGLuc及應(yīng)用牙鲆鰓細胞p2IFGLuc建立的遺傳毒性檢測系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(I)魚類細胞系大多來源于正常組織，P53信號通路完整；(2)魚類細胞的適溫范圍廣，150C _35°C都能生長，最適溫度20°C _25°C，因而可室溫操作和運輸；(3)魚類細胞生長速度比腫瘤細胞慢，每隔7-10天傳代一次。細胞單層在15°C條件下可維持I個月以上，提高了該細胞產(chǎn)品的保存期限，保證了該細胞產(chǎn)品的運輸和應(yīng)用；(4)魚類細胞可密閉培養(yǎng)，不需要二氧化碳培養(yǎng)箱；(5)在細胞中引入雙熒光報告基因質(zhì)粒，采用雙熒光報告基因檢測技術(shù)測定，快速靈敏，測定結(jié)果穩(wěn)定?？傊?，本發(fā)明所設(shè)計的遺傳毒性檢測系統(tǒng)，操作簡便快速，具有合適的專一性和靈敏度，可快速和高通量篩選藥品和環(huán)境污染物的遺傳毒性，這對于保護人類的生命健康和生物種的正常延續(xù)具有重要而深遠的意義。


圖I :本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc的形態(tài)；圖2 p2IFGLuc細胞應(yīng)答三種藥物處理的時間效應(yīng)關(guān)系；其中三種藥物分別為博萊霉素(Bleomycin)、絲裂霉素C(Mitomycin C)和酒精(Alcohol);三種藥物的處理濃度分別為博萊霉素30ii g/ml、絲裂霉素ClOii g/ml和酒精30% (v/v) ；control組代表轉(zhuǎn)染后未加藥物處理的p21FGLuc細胞，數(shù)值以平均數(shù)土標準誤表不;圖3 p2IFGLuc細胞應(yīng)答三種藥物處理的劑量效應(yīng)關(guān)系；其中三種藥物分別為博萊霉素(Bleomycin)、絲裂霉素C(Mitomycin C)和酒精(Alcohol);三種藥物的處理時間分別為博萊霉素4h、絲裂霉素C 2h和酒精lh，數(shù)值以平均數(shù)土標準誤表示；圖4 :在細胞毒性相似條件下，三種藥物處理轉(zhuǎn)基因細胞p21FGLuc后，熒光蛋白表達情況的比較圖；其中處理條件分別為30ii g/ml博萊霉素，4h ；10u g/ml絲裂霉素C，2h ；30% (v/v)酒精，lh。數(shù)值以平均數(shù)土標準誤表示；圖5 :不同濃度環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)處理轉(zhuǎn)基因細胞(p21FGLuc)24小時后的熒光素酶上調(diào)表達情況；其中S9+表示環(huán)磷酰胺經(jīng)過鼠肝S9復(fù)合物激活；S9-表示環(huán)磷酰胺未經(jīng)鼠肝S9復(fù)合物激活，數(shù)值以平均數(shù)土標準誤表示；圖6 :不同濃度鄰苯二甲酸二(2_乙基己基)酷(di (2-ethylhexyl) phthalate)處理p2IFGLuc細胞24h后的熒光素酶上調(diào)表達情況；其中DEHP的濃度變化從0. 005到200 U g/ml，0代表control組，即未進行藥物處理的p21FGLuc細胞，數(shù)值以平均數(shù)土標準誤表示； 圖7 :不同濃度D-甘露糖(Diannitol)處理轉(zhuǎn)基因細胞(p21FGLuc) 24小時后的熒光素酶上調(diào)表達情況，數(shù)值以平均數(shù)土標準誤表示；圖8 pGL3-Basic報告質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)；
圖9 pRL-CMV報告質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)；圖10 pcDNA3. l/V5_HisA 載體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式本發(fā)明將2個報告質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到牙鲆鰓細胞FG中，經(jīng)過長期的篩選獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化細胞，并構(gòu)建得到轉(zhuǎn)基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)。轉(zhuǎn)入牙鲆鰓細胞FG中的2個報告質(zhì)粒，其中ー個報告質(zhì)粒pGL3-p21-luc含有螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)報告基因，該基因的表達由人p21基因啟動子驅(qū)動，因而其報告基因的表達是DNA損傷信號誘導(dǎo)特異性的，即感受DNA損傷信號，上調(diào)螢火蟲熒光素酶基因的表達；另外ー個報告質(zhì)粒pRL-CMV-luc含有海腎熒光素酶基因(Renillaluciferase)(圖9)，該基因的表達由細胞肥大病毒(CMV)基因啟動子驅(qū)動，該基因的表達是組成性表達，不受DNA損傷信號的誘導(dǎo)，與細胞數(shù)量呈正相關(guān)，作為內(nèi)對照，校正系統(tǒng)檢測誤差。該魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)在構(gòu)建過程中，通過報告質(zhì)粒或共轉(zhuǎn)染抗性質(zhì)粒引入Neomycin抗性基因，因而需要在培養(yǎng)基中添加一定濃度的藥物G418來選擇和維持報告基因的穩(wěn)定整合。藥品處理后的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶基因的表達量，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Promega公司試劑盒)來測定，具體測定方法參見試劑盒說明書(Promega 公司，Dual- Luciferase Reporter Assay System, Cat.No. E1910)。計算每個樣品的相對熒光比值螢火蟲熒光RLU/海腎熒光RLU，然后根據(jù)該比值的大小繪制劑量效應(yīng)曲線，根據(jù)該曲線的變化趨勢，以評價所檢測化學(xué)藥品或環(huán)境樣品的遺傳毒性大小。上述的質(zhì)粒pGL3-p21_luc的構(gòu)建步驟如下用HindIII核酸內(nèi)切酶酶切PffffP-Luc 質(zhì)粒(pffffP-Luc 質(zhì)粒參見文獻El-Diery et al. , 1993. Cell 75 (4)，817-825)，酶切獲得ー個長度為2. 4kb的DNA片段。該片段為人p21基因啟動子序列，然后將該片段插入螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-basic-luc(Promega公司產(chǎn)品，Cat. #1751)的多克隆位點(見圖8)，操作步驟根據(jù)說明書來進行。上述的表達海腎熒光素酶基因(Renilla luciferase)的質(zhì)粒pRL-CMV-luc，購自Promega 公司(Cat. #E2261)。上述的牙鲆鰓細胞系FG，來源于牙鲆的鰓組織，由中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院童裳亮教授于 1997 年建立(Tong et al. , 1997. Aquaculture 156,327-333)?，F(xiàn)在中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院進行傳代培養(yǎng)和液氮凍存保種。上述的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc的構(gòu)建方法如下(I)在六孔細胞培養(yǎng)板中，接種培養(yǎng)FG細胞單層，待細胞鋪板率達到60% -80%,利用Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)，將2個報告質(zhì)粒(pGL3_p21_luc和pRL-CMV-luc)和I個抗性質(zhì)粒(pcDNA3. l/V5A_His圖譜見圖10)按照比例5 : I : 1，以每孔2iig DNA的總量，共轉(zhuǎn)染到FG細胞中，25°C培養(yǎng)。其中，抗性質(zhì)粒pcDNA3. l/V5A_His，為Invitrogen公司產(chǎn)品，含有Neomycin基因，具有抗G418活性；(2)48小時后，倒掉舊的培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基MEM培養(yǎng)基，添加10%小牛血清、 100IU/ml青霉素和100 Ug/ml硫酸鏈霉素)，換成選擇性培養(yǎng)基(含終濃度為600 y g/ml G418的生長培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)，定期換液，篩選2周后，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牙鲆鰓細胞p2IFGLuc0之后，將G418的終濃度降為300 y g/ml維持培養(yǎng)(維持培養(yǎng)基含終濃度為300 u g/ml G418的生長培養(yǎng)基)或凍存。為了驗證上述所得到的轉(zhuǎn)基因細胞在檢測遺傳毒物的遺傳毒性上的特異性，我們用典型遺傳毒物和非遺傳毒物對p21FGLuc細胞進行了時間依賴和劑量依賴的檢測實驗。
(I)圖2是p21FGLuc細胞應(yīng)答遺傳毒物博萊霉素(30 ii g/ml)和絲裂霉素C (10 y g/ml)，以及非遺傳毒物酒精(30%，v/v)處理的時間效應(yīng)檢測結(jié)果。從圖4中可見，遺傳毒物博萊霉素和絲裂霉素C的處理，可明顯誘導(dǎo)該魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)的熒光蛋白上調(diào)表達，而非遺傳毒性物質(zhì)酒精卻不能誘導(dǎo)該魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)的熒光蛋白上調(diào)表達。而且這個系統(tǒng)對遺傳毒物的應(yīng)答速度很快。在不同長度的處理時間里，報告基因的表達水平相對穩(wěn)定。(2)圖3是p21FGLuc細胞應(yīng)答遺傳毒物博萊霉素和絲裂霉素C，以及非遺傳毒物酒精處理的劑量效應(yīng)檢測結(jié)果。結(jié)果表明，該魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)對遺傳毒物表 現(xiàn)出明顯的劑量依賴性表達，對非遺傳毒物卻沒有。(3)在相似的細胞毒性條件下，博萊霉素對p21FGLuc細胞的遺傳毒性要高于絲裂霉素C (圖4)。這表明該轉(zhuǎn)基因細胞在檢測遺傳毒物的遺傳毒性上具有很好的特異性，檢測結(jié)果穩(wěn)定，并可以比較遺傳毒性的大小。上述轉(zhuǎn)基因魚類細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)在檢測環(huán)境污染物和化學(xué)藥品的遺傳毒性上的應(yīng)用實例如下實施例I :環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)是一種已知的環(huán)境遺傳毒物,在已知的細菌、酵母和哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)中，以及微核和染色體畸變實驗中，均顯示陽性結(jié)果。環(huán)磷酰胺本身不具有遺傳毒性，但經(jīng)過鼠肝S9復(fù)合物的代謝激活后，即形成具有遺傳毒性的磷酰胺代謝產(chǎn)物。我們用不同濃度環(huán)磷酰胺處理p21FGLuc細胞24小時后，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)代謝激活的環(huán)磷酰胺不能上調(diào)細胞中螢火蟲熒光素酶基因的表達，而經(jīng)代謝激活的環(huán)磷酰胺可顯著上調(diào)細胞中螢火蟲熒光素酶基因的表達(如圖5所示)。這表明，與其他遺傳毒性檢測系統(tǒng)一樣，本遺傳毒性檢測系統(tǒng)也得到了陽性結(jié)果。實施例2 :在檢驗該系統(tǒng)的靈敏性時，我們選擇了可疑致癌物鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)是增塑劑的一種，是目前比較有爭議的一種化學(xué)物質(zhì)。在細菌、酵母和哺乳動物細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)中，以及微核和染色體畸變實驗中，均顯示陰性結(jié)果。但是，DEHP可引起嚙齒類動物肝臟致癌。目前在歐美國家的化妝品行業(yè)中已經(jīng)明確禁止添加DEHP，在食品及玩具中，它也有確定的添加標準。可見，人們?nèi)匀缓軗?dān)心DEHP對人類健康的安全性。已有的研究認為DEHP誘導(dǎo)嚙齒動物肝癌發(fā)生與 其誘導(dǎo)肝臟細胞的過氧化物酶體增生有關(guān)，但尚缺乏遺傳毒性方面的實驗證據(jù)。我們用不同濃度的DEHP處理p21FGLuc細胞后，誘導(dǎo)熒光信號的結(jié)果如圖6所示。發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境濃度條件下(0. 005 u g/ml), DEHP就可以明顯誘導(dǎo)p21FGLuc細胞的DNA損傷反應(yīng)；在50 u g/ml時，DNA損傷反應(yīng)達到峰值。這表明，p2IFGLuc細胞對DEHP的遺傳毒性檢測結(jié)果為陽性，且隨著DEHP的濃度增加，檢測到的熒光信號越來越強，存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。本遺傳毒性檢測系統(tǒng)首次提供了 DEHP具有遺傳毒性的實驗證據(jù)，至少在檢測DEHP的遺傳毒性上，本系統(tǒng)比其它系統(tǒng)要靈敏得多。實施例3 D-甘露醇(D-mannitol)是典型的非遺傳毒物，在已有的所有遺傳毒性檢測系統(tǒng)中，均為陰性結(jié)果。我們用用不同濃度D-甘露醇處理p21FGLuc細胞，發(fā)現(xiàn)不能上調(diào)細胞中螢火蟲熒光素酶基因的表達(圖7)。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞在進行遺傳毒性檢 測的時候，不會發(fā)生假陽性結(jié)果。
權(quán)利要求
1.ー個轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞，其保藏編號為CCTCC C 201251。
2.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞，其特征在于該轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞攜帶有表達螢火蟲熒光素酶報告基因的質(zhì)粒pGL3-p21-luc和含有表達海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒pRL-CMV-luc。
3.權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞的應(yīng)用，其特征在干，是用于指示環(huán)境樣品或化學(xué)藥品的遺傳毒性。
4.一種遺傳毒性檢測系統(tǒng)，其特征在于，所述的遺傳毒性檢測系統(tǒng)是用權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞作為生物指示物。
5.權(quán)利要求4所述的檢測系統(tǒng)的使用方法，步驟如下首先以不同濃度的環(huán)境樣品或化學(xué)藥品處理轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞；24小時后，收集處理后的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞進行裂解；測定各個細胞裂解液樣品的螢火蟲熒光發(fā)光值RLU和海腎熒光發(fā)光值RLU，計算每個樣品的相對熒光比值螢火蟲熒光RLU/海腎熒光RLU ;然后根據(jù)該比值的大小繪制劑量效應(yīng)曲線，根據(jù)該曲線的變化趨勢，評價所檢測環(huán)境樣品或化學(xué)藥品的遺傳毒性大小。
6.如權(quán)利要求5所述的使用方法，其特征在于所述的化學(xué)藥品為鄰苯ニ甲酸ニ(2-こ基己基)酷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因魚類細胞及其應(yīng)用，即能用于遺傳毒性檢測的轉(zhuǎn)基因牙鲆鰓細胞p21FGLuc和用該轉(zhuǎn)化體作為生物指示物的應(yīng)用。本發(fā)明所設(shè)計的遺傳毒性檢測系統(tǒng)，操作簡便快速，具有合適的專一性和靈敏度，可快速和高通量篩選藥品和環(huán)境污染物的遺傳毒性，這對于保護人類的生命健康和生物種的正常延續(xù)具有重要而深遠的意義。
文檔編號C12Q1/02GK102660508SQ20121012878
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月27日
發(fā)明者耿德玉, 郭華榮 申請人:中國海洋大學(xué)