專利名稱：梨小食心蟲成蟲觸角總rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小型蛾類昆蟲觸角總RNA的提取方法，具體說是梨小食心蟲成蟲觸角總RNA的提取方法。
背景技術(shù)：
梨小食心蟲Grapholita molesta(Busck)是一種嚴(yán)重危害桃、梨等果樹的世界性重要害蟲，在我國廣泛分布于除西藏以外的所有省市自治區(qū)。近年來，由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，水果栽培模式和管理措施的變化等因素的影響，梨小食心蟲在我國許多地方連年大發(fā)生，不但給果業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重地挫傷了廣大果農(nóng)的生產(chǎn)積極性。已成為制約梨、桃等果業(yè)生產(chǎn)進(jìn)一步向優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)方向發(fā)展的重要因素之一。長期以來，對梨小食心蟲的防治主要以果實(shí)套袋和化學(xué)農(nóng)藥為主，前者雖然環(huán)保且效果較好，但操作費(fèi)工、費(fèi)時(shí)，成本隨勞動(dòng)力價(jià)格的上漲已很難使果農(nóng)接受。在許多地方，果實(shí)套袋的投資已達(dá)1000元/畝左右?；瘜W(xué)防治則因梨小食心蟲鉆蛀危害，隱蔽性強(qiáng)而使效果較差；加之該蟲一年多代，需多次用藥，不僅引起抗藥性日漸增強(qiáng)，而且導(dǎo)致果品農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染加重。因此，探索梨小食心蟲低成本且高效無害化的防治方法已成為桃、梨生產(chǎn)中亟待解決的突出問題，勢在必行。研究表明，昆蟲能夠感受空氣中的揮發(fā)物質(zhì)，并依此作為尋偶，覓食和尋找產(chǎn)卵場所的信息。而昆蟲觸角感受器中的氣味結(jié)合蛋白與脂溶性的氣味物質(zhì)的結(jié)合，是昆蟲專一性識別外界氣味化合物的第一步生化反應(yīng)，這對于昆蟲與外界信息化合物的交流意義重大。對此進(jìn)行深入研究可為農(nóng)業(yè)害蟲防治提供新的思路與途徑，為研制開發(fā)無污染、不殺傷天敵、與環(huán)境友好的高效驅(qū)避劑和引誘劑提供理論依據(jù)。對氣味結(jié)合蛋白研究的經(jīng)典方法是直接從昆蟲觸角中提取粗蛋白，然后通過聚丙烯酰氨凝膠電泳、凝膠層析離子交換柱等方法進(jìn)行分離純化得到昆蟲氣味結(jié)合蛋白，但是大部分昆蟲觸角很小，要分離純化比較 困難，且該過程比較繁瑣。近年來，科學(xué)家們利用發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)克隆得到氣味結(jié)合蛋白的基因，再利用體外表達(dá)的方法獲得足量目的蛋白，這從一定程度上緩解了研究氣味結(jié)合蛋白的難度。但是該方法也必須先從昆蟲觸角中提取總RNA，這對于觸角較大的昆蟲不難做到，可是像梨小食心蟲這類小型蛾類昆蟲卻不是易事，如果沒有一套完整有效的提取方法很容易使RNA降解使后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行實(shí)施。

發(fā)明內(nèi)容
針對像梨小食心蟲成蟲這類小型蛾類昆蟲不易提取高質(zhì)量觸角總RNA的問題，本發(fā)明的目的在于，提供一種簡便有效的梨小食心蟲成蟲觸角總RNA的提取方法。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種梨小食心蟲成蟲觸角總RNA的提取方法，將昆蟲在低溫條件下冷凍昏迷，用小型醫(yī)用剪刀和鑷子將數(shù)根觸角剪下，并立即置于浸在液氮中的I. 5ml離心管中，然后從液氨中取出離心管并馬上加入少量總RNA提取液，用勻漿器將其充分勻漿后加入足量總RNA提取液，移液器吹打數(shù)次后轉(zhuǎn)入另一新離心管中，然后按照總RNA提取方法，經(jīng)氯仿抽提，異丙醇和乙醇沉淀分離得到高純度的總RNA。本發(fā)明的能方法簡單方便有效，解決RNA在提取過程中降解的問題，可以獲得高質(zhì)量的總RNA，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。


圖I是梨小食心蟲雌雄成蟲觸角總RNA完整性檢測電泳圖；圖中，泳道I為雌成蟲觸角總RNA，泳道2為雄成蟲觸角總RNA。圖2是梨小食心蟲雌雄成蟲觸角總RNA反轉(zhuǎn)錄的CDNA模板對氣味結(jié)合蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測電泳圖；圖中，M為DNALD2000Marker ;泳道I為雌成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄 cDNA模板對梨小食心蟲普通氣味結(jié)合蛋白2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為雄成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA模板對梨小食心蟲普通氣味結(jié)合蛋白2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；圖3是梨小食心蟲雌雄成蟲觸角總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板對內(nèi)參基因Actin PCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測電泳圖；圖中，M為DNA LD2000Marker ;泳道I為雌成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA模板對梨小食心蟲Actin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為雄成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA模板對梨小食心蟲Actin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。為了清楚的理解本發(fā)明，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例給出一種梨小食心蟲成蟲觸角總RNA的提取方法，具體按下列步驟實(shí)施I、首先將50頭梨小食心蟲成蟲放入_20°C的冰箱內(nèi)冷凍8min，然后置一張白紙上，用12. 5cm的小型醫(yī)用鑷子夾住昆蟲頭部，用12. 5cm的小型醫(yī)用剪刀輕輕將觸角剪下，浸入在液氨中的無蓋I. 5ml離心管中，該管心管帶有直徑為2cm的浮標(biāo)且管內(nèi)裝有約50ul的液氮。2、待所有成蟲的觸角都裝入離心管后，將離心管從液氮中取出并馬上加入125ul的總RNA提取液(Trizol，深圳晶美公司)，用微量電動(dòng)組織勻漿器(該勻漿器配套使用
I.5ml的塑料研磨棒)充分勻漿組織樣品后再加入875ul的總RNA提取液，經(jīng)移液器吹打數(shù)次，然后將樣品轉(zhuǎn)入另一新離心管中。3、將盛有足量總RNA提取液的勻漿樣品室溫放置5min，12000g，4°C離心lOmin。4、然后加入200ul氯仿,蓋緊尚心管,劇烈震蕩30s,待溶液充分乳化后,室溫靜置3min, 1200(^,4。。離心 15min。5、從離心機(jī)中取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)入另一新離心管中，向上清液中加入500ul的異丙醇后充分混勻，室溫放置20min，12000g，4°C離心15min。6、小心棄上清，慢慢沿離心管壁加入濃度為75%的乙醇lml，12000g，4°C離心5min后小心棄去乙醇，室溫干燥3min，加入適量(30_50ul) DEPC處理后的超純水溶解沉淀后，得到高純度的總RNA，取少部分用于檢測，其余于-80°C保存，或直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
梨小 食心蟲雌雄成蟲觸角總RNA完整性檢測電泳圖如圖I所示；圖中，泳道I為雌成蟲觸角總RNA，泳道2為雄成蟲觸角總RNA。梨小食心蟲雌雄成蟲觸角總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板對氣味結(jié)合蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測電泳圖如圖2所示；圖中，M為DNA LD2000Marker ;泳道I為雌成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA模板對梨小食心蟲普通氣味結(jié)合蛋白2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為雄成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA模板對梨小食心蟲普通氣味結(jié)合蛋白2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。梨小食心蟲雌雄成蟲觸角總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板對內(nèi)參基因ActinPCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測電泳圖如圖3所示；圖中，M為DNALD2000Marker ;泳道I為雌成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA模板對梨小食心蟲Actin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為雄成蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA模板對梨小食心蟲Actin基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。得到的梨小食心蟲雌雄成蟲觸角總RNA質(zhì)量如表I所示。表I梨小食心蟲雌雄成蟲觸角總RNA質(zhì)量
權(quán)利要求
1.一種梨小食心蟲成蟲觸角總RNA的提取方法，其特征在于，將梨小食心蟲成蟲在低溫條件下冷凍昏迷，用小型醫(yī)用剪刀和鑷子將數(shù)根觸角剪下，并立即置浸在液氮中的I. 5ml離心管中，然后從液氨中取出離心管并馬上加入少量總RNA提取液，用勻漿器將其充分勻漿后加入足量總RNA提取液，移液器吹打數(shù)次后轉(zhuǎn)入另一新離心管中，然后按照總RNA提取方法，經(jīng)氯仿抽提，異丙醇和乙醇沉淀分離得到高純度的總RNA。
2.如權(quán)利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述的低溫條件為溫度_20°C，時(shí)間為8min。
3.如權(quán)利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述的剪刀和鑷子均為長度12.5cm的小型醫(yī)用剪刀和鑷子。
4.如權(quán)利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述的觸角數(shù)量為50根。
5.如權(quán)利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述浸在液氮中的I.5ml離心管為去蓋離心管。
6.如權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述的去蓋離心管帶有直徑為2cm的浮標(biāo)并且離心管中盛有50ul的液氮。
7.如權(quán)利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述的勻漿器為微量電動(dòng)組織勻漿器，該勻漿器配套使用I. 5ml的塑料研磨棒。
8.如權(quán)利要求I所述的提取方法，其特征在于，所述的少量總RNA提取液的量為125ul。
9.如權(quán)利要求I所術(shù)的提取方法，其特征在于，所述總RNA的提取方法包括下列步驟 A、首先將盛有足量總RNA提取液的勻漿樣品室溫放置5min，12000g，4°C離心lOmin。
B、然后加入200ul氯仿，蓋緊離心管，劇烈震蕩30s，待溶液充分乳化后，室溫靜置3min, 1200(^,4。。離心 15min。
C、從離心機(jī)中取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)入另一新離心管中，向上清液中加入500ul的異丙醇后充分混勻，室溫放置20min, 12000g,4°C離心15min。
D、棄上清，慢慢沿離心管壁加入濃度為75%的乙醇lml，12000g，4°C離心5min后棄去乙醇，室溫干燥3min，然后加入適量DEPC處理后的超純水溶解沉淀，得到高純度的總RNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種梨小食心蟲成蟲觸角總RNA的提取方法，將梨小食心蟲成蟲在低溫條件下冷凍昏迷，用小型醫(yī)用剪刀和鑷子將數(shù)根觸角剪下，并立即置浸在液氮中的1.5ml離心管中，然后從液氨中取出離心管并馬上加入少量總RNA提取液，用勻漿器將其充分勻漿后加入足量總RNA提取液，移液器吹打數(shù)次后轉(zhuǎn)入另一新離心管中，然后按照總RNA提取方法，經(jīng)氯仿抽提，異丙醇和乙醇沉淀分離得到高純度的總RNA。該方法簡單方便，能解決RNA在提取過程中降解的問題，從而獲得高質(zhì)量的總RNA。
文檔編號C12N15/10GK102634508SQ201210121388
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月24日
發(fā)明者仵均祥, 張國輝, 李怡萍, 許向利 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)