專利名稱：一種新型的無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新型的無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，適用于人多能干細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
人多能干細(xì)胞典型特點(diǎn)是，在體外不斷自我更新，同時(shí)保持向各個(gè)胚層細(xì)胞分化的潛能。由于人胚胎干細(xì)胞建立涉及倫理與法律等問題，其研究與應(yīng)用受到一定的限制。而誘導(dǎo)多能干細(xì)胞很好地解決了人胚胎干細(xì)胞存在的倫理爭(zhēng)議，同時(shí)由于其具有與人胚胎干細(xì)胞相似的特性，即自我更新與分化潛能，因而為再生醫(yī)學(xué)尤其是個(gè)性化的治療帶來了希望。人多能干細(xì)胞不僅為基礎(chǔ)研究提供了獨(dú)特的模型，而且在細(xì)胞移植治療方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。然而在培養(yǎng)人多能干細(xì)胞時(shí)，其與動(dòng)物源制品(如動(dòng)物血清或動(dòng)物蛋白) 的接觸會(huì)提高這種細(xì)胞吸收非人源代謝產(chǎn)物或被非人源病原污染的風(fēng)險(xiǎn)。例如，在有動(dòng)物源成分存在的培養(yǎng)體系中，細(xì)胞會(huì)吸收并表達(dá)唾液酸Neu5Gc。由于人類循環(huán)系統(tǒng)中存在識(shí)別Neu5Gc的抗體，當(dāng)含有Neu5Gc的細(xì)胞或組織移植入人體時(shí)，機(jī)體會(huì)識(shí)別這些非人源的抗原，從而對(duì)移植細(xì)胞或組織產(chǎn)生排斥反應(yīng)，造成移植失敗。同時(shí)飼養(yǎng)層的存在導(dǎo)致耗費(fèi)大量的人力和物力，且飼養(yǎng)層細(xì)胞的批次性也會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)的不穩(wěn)定性。因此，確定培養(yǎng)系統(tǒng)中的各種成分則有利于優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)并具有較高的可重復(fù)性。近年，研究者們研究發(fā)展出如下不同的人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)(一)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的發(fā)展人多能干細(xì)胞最初在以小鼠的胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)衍化而來的條件下建立并進(jìn)行培養(yǎng)的，即含有鼠胚胎成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層以及含有胎牛血清的培養(yǎng)基。為降低培養(yǎng)系統(tǒng)中非人源成分，研究者嘗試不同組織來源的人源細(xì)胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)人多能干細(xì)胞。 Richard(Richards, Μ. , Fong, C. Y. , Chan, ff. K. , Wong, P. C. &Bongso, A.、Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2002、20、9、933_6。)等首次以胎兒 / 成人成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，以人血清作為培養(yǎng)基，建立首個(gè)無動(dòng)物源的培養(yǎng)系統(tǒng)。隨后人骨髓來源間充質(zhì)細(xì)胞，新生兒包皮細(xì)胞，人胚胎干細(xì)胞分化來源的成纖維樣細(xì)胞，胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞等被嘗試用作人多能干細(xì)胞的飼養(yǎng)層。雖然各種人源細(xì)胞用于培養(yǎng)人多能干細(xì)胞， 但是其支持人多能干細(xì)胞不分化的能力各不相同。這可能與細(xì)胞來源，培養(yǎng)條件的不同等因素有關(guān)。同時(shí)，制備飼養(yǎng)層的細(xì)胞也需要大量的人力、物力，其批次之間的差異性也無法解決。因此，發(fā)展無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)系統(tǒng)具有更大的應(yīng)用價(jià)值。( 二)無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的發(fā)展Xu(Xu,C. ,et al. >Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells,Nat Biotechnol、2001、19、10、971_4。)等首次報(bào)道將人多能干細(xì)胞培養(yǎng)在由 Matrigel (BD公司)作為細(xì)胞外基質(zhì)以及鼠胚胎成纖維細(xì)胞來源的條件培養(yǎng)基構(gòu)成的無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)。兩種培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)人胚胎干細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜相似,說明在此無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，細(xì)胞不會(huì)受到額外的刺激。Matrigel是鼠EHS瘤細(xì)胞的提取物，因其來源提高人多能干細(xì)胞臨床應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)以及其成分的不確定性，因此研究者們嘗試以純化的蛋白或人工合成物替代Matrigel。在胚胎成纖維細(xì)胞來源的條件培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基以及含牛血白蛋白的無血清培養(yǎng)基中，層黏連蛋白(Laminin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)和重組表達(dá)的玻璃粘連蛋白(Vitronectin)均被報(bào)道能夠代替Matrigel長(zhǎng)期維持人多能干細(xì)胞的增殖。2006 年，Ludwig (Ludwig, T. E. , et al.、Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions、Nat Biotechnol、2006、24、2、185-7。)等報(bào)道在成分明確的培養(yǎng)基TeSR中使用四種大分子的混合物包括層黏連蛋白、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白和膠原IV (Colagen IV)等成功培養(yǎng)人多能干細(xì)胞并在此培養(yǎng)系統(tǒng)中建立新的人多能干細(xì)胞細(xì)胞株。但由于此培養(yǎng)系統(tǒng)的高昂費(fèi)用不便于推廣應(yīng)用。(三)培養(yǎng)基的發(fā)展在含有胎牛血清的培養(yǎng)體系中，很多干細(xì)胞死亡并大量分化。隨后，Amit(Amit， M. , et al.、ClonalIy derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture、 Dev Biol、2000、227、2、271-8。)等嘗試用 KO SR(Invitrogen)代替胎牛血清降低了因血清批次間差異帶來的不穩(wěn)定性。隨后Xu(Xu, C. , et al.、Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2001、19、10、971_4o ) 等應(yīng)用鼠胚胎成纖維細(xì)胞來源的條件培養(yǎng)基，以Matrigel作為細(xì)胞外基質(zhì)成分能長(zhǎng)期維持人多能干細(xì)胞不分化的狀態(tài)，也就是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)方法。但是該培養(yǎng)直接接觸到鼠源、牛源的物質(zhì)，對(duì)將來應(yīng)用的臨床應(yīng)用上會(huì)有很大的障礙。

發(fā)明內(nèi)容
多能干細(xì)胞的培養(yǎng)需要有細(xì)胞外基質(zhì)的支持，同時(shí)需要適合的培養(yǎng)基，然而現(xiàn)有的培養(yǎng)系統(tǒng)含有動(dòng)物源制品，顯然提高了多能干細(xì)胞吸收非人源代謝產(chǎn)物或被非人源病原污染的風(fēng)險(xiǎn)。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在克服這個(gè)難點(diǎn)，通過應(yīng)用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法從胎盤組織中提取了能夠支持人胚胎干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白即人源化基質(zhì)，同時(shí)以人血漿為原料，以NaCl沉淀的方法獲得的組分配制成的人源化培養(yǎng)基，與人源化基質(zhì)共同構(gòu)成無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)系統(tǒng)。為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明提供了一種新型的無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，它包括支持人多能干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的人源化基質(zhì)和人源化培養(yǎng)基，所述的人源化基質(zhì)富含人IV型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白，所述的人源化培養(yǎng)基富含纖維粘連蛋白和玻璃連接蛋白。優(yōu)選地，所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的人源化基質(zhì)按如下步驟制備而成(I)新鮮胎盤去掉羊膜與臍帶后，剪成不超過O. 3X0. 3X0. 3cm大小的組織塊，以冷水將組織塊懸起，4°C攪拌，12h后，用ImmXlmm的篩網(wǎng)過濾，將截留的組織仍用冷水懸起，以冷水洗2天，每12h換水一次，第三次過濾后，將截留的組織用冷的IM NaCl緩沖液懸起，4°C攪拌；其中所述的NaCl緩沖液按如下方法配制58. 5g NaCl與25ml Tris緩沖液，溶于Milli-Q水中，調(diào)節(jié)pH至7. 5，定容至IL ;所述的Tris緩沖液按如下方法配制242. 28gTris堿溶于800ml Milli-Q水中，調(diào)節(jié)pH至7. 5，加Milli-Q水定容至IL ；(2)以冷的IM NaCl緩沖液洗4天，每12h換液一次，第八次更換NaCl緩沖液時(shí)， 用1_X1_的篩網(wǎng)過濾，將截留的組織用冷的O. 5M醋酸溶液懸起，4°C攪拌；(3)以冷的O. 5M醋酸溶液洗3天，每12h換液一次，第六次換O. 5M醋酸溶液時(shí)， 用ImmXlmm的篩網(wǎng)過濾，將截留的組織稱重；以胃蛋白酶組織為I : 400的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，同時(shí)以200g/L將酶與組織塊懸起于O. 5M醋酸溶液中，4°C攪拌24h ；(4)7100g，4°C離心lh，去掉上清，收集沉淀并稱重，以質(zhì)量體積比為I : I的條件加入2M尿素緩沖液，4°C攪拌24h ;其中所述的尿素緩沖液按如下方法配制240. Og尿素、 12. Ig Tris 堿、18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，濃 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7. 4，Milli-Q 水定容至2L ；(5) 13000rpm，4°C離心30min，上清液裝入25KD的透析袋中，以TBS緩沖液+0. 5% 氯仿為周圍溶液于4°C透析2h，然后徹底清洗燒杯與透析袋外表面后，以冷的TBS緩沖液為周圍溶液，繼續(xù)4°C透析，每2h換TBS緩沖液一次，共換3次，最后一次透析時(shí)，4°C，過夜， 透析好的液體，即為人源化基質(zhì)；其中所述的TBS緩沖液按如下方法配制12. Ig Tris堿， 18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，濃 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7. 4，Milli-Q 水補(bǔ)齊至 2L。優(yōu)選地，所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的人源化培養(yǎng)基含有人血漿的NaCl沉淀組分。優(yōu)選地，所述的人血漿的NaCl沉淀組分按如下步驟制備而成(I)將經(jīng)過安全檢測(cè)的四種血型的血漿，以等體積比例混合，分裝成36ml/BD管， 每管加入6ml的林格液，混合均勻后再加入2MCaC12至終濃度為20mM，混勻，置于37°C水浴鍋孵育兩小時(shí)，將已凝固的血漿，存于_20°C過夜；(2)將處理過的血漿從_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，過夜解凍，高速冷凍離心機(jī)在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，即是血漿來源的血清；(3)在4°C冷柜中，向血清中緩慢、均勻地加入NaCl，至終濃度為28/100ml，攪拌過夜；(4)高速冷凍離心機(jī)在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，將收集的上清用濾紙過濾掉懸浮的小顆粒；(5)將過濾的上清，裝入25KD的透析袋中，在冷的雙蒸水中攪拌透析2小時(shí)以上；(6)重復(fù)步驟(5)兩次；(7)將步驟6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培養(yǎng)基，攪拌透析過夜；(8)取出透析袋內(nèi)的溶液，以外部DMEM/F12培養(yǎng)基為對(duì)照，280nm測(cè)定蛋白濃度， O. 22 μ m過濾后，保存于4°C，此即為血漿的NaCl沉淀組分。上述步驟(I)中所述的林格液按如下方法配制JfNaCl O. 9g,KCl O. 042g, CaCl2 O. 0242g，溶于IOOml的雙蒸水，用O. 22 μ m的濾膜過濾備用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的進(jìn)
I K
少(I)制備成本低。本發(fā)明以胎盤為原材料制備人源化基質(zhì)，胎盤是一種富含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的人體組織，嬰兒出生后即被廢棄，因而具有來源廣泛，成本低廉等特點(diǎn)。(2)無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層。本發(fā)明應(yīng)用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法從胎盤組織中提取了能夠支持人胚胎干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白即人源化基質(zhì)，同時(shí)以人血漿為原料，以NaCl沉淀的方法獲得的組分配制成的人源化培養(yǎng)基，與人源化基質(zhì)共同構(gòu)成無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)系統(tǒng)。這一培養(yǎng)系統(tǒng)能夠長(zhǎng)期維持人胚胎干細(xì)胞的自我更新以及分化的潛能，同時(shí)無動(dòng)物源的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞細(xì)胞系也可在這一培養(yǎng)系統(tǒng)中建立，因此這一成本低廉，易于擴(kuò)大培養(yǎng)的無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)為多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。(3)促進(jìn)干細(xì)胞貼壁。與Matrigel的成分相似，本發(fā)明的細(xì)胞外基質(zhì)富含人IV 型膠原(Collagen IV)、纖維粘連蛋白(Fibronectin)和層粘連蛋白(Laminin)(見圖 2-A、B、C)。同時(shí)，本發(fā)明通過以人的血漿為原材料，比較陰離子交換柱層析、飽和硫酸銨沉淀和NaCl沉淀的方法，最后選定利用NaCl沉淀的方法從人血漿中提取制成了血漿抽提物，配制成人源化的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基富含纖維粘連蛋白(Fibronectin)和玻璃連接蛋白 (Vitronectin)(見圖2_D、E)，對(duì)促進(jìn)干細(xì)胞的貼壁有重要作用。(4)可長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞。通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的人源化細(xì)胞外基質(zhì)和人血漿抽提物，可長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過39代(約270天)的培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞仍然保持核型的穩(wěn)定(見圖3-B)，并且具有和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相似的形態(tài)學(xué)特征，干性相關(guān)基因的表達(dá)水平(見圖3-A、C、D)。為了檢測(cè)在該人源化系統(tǒng)中，干細(xì)胞是否能保持三胚層分化的全能性，發(fā)明人分別檢測(cè)了其在體外、體內(nèi)分化的能力(圖4-A、B)。體外的EBs和體內(nèi)畸胎瘤都檢測(cè)到三胚層的代表標(biāo)記。(5)支持誘導(dǎo)產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。更進(jìn)一步，通過進(jìn)行人多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的人源化干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠支持誘導(dǎo)人皮膚細(xì)胞去分化成為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能表達(dá)多能性相關(guān)的蛋白(圖5-A)以及相似的RNA表達(dá)水平(圖5-B)。由于重編程的另一個(gè)主要特征是表觀遺傳的改變，發(fā)明人檢測(cè)了 0ct4與 Nanog基因啟動(dòng)子的甲基化水平，結(jié)果顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的甲基化水平與人真皮成纖維細(xì)胞相比大大降低，與干細(xì)胞的水平相近。這說明其形成確實(shí)經(jīng)歷了表觀水平的變化(圖 5-C)，且誘導(dǎo)的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有體外、體內(nèi)的朝三胚層分化的潛能(圖6-A、B)。


通過下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行的描述，本發(fā)明的技術(shù)方案及其技術(shù)效果將變得更加清楚，且更加易于理解。其中圖I示出了本發(fā)明的人源化基質(zhì)制備流程圖。圖2示出了人源化基質(zhì)(FCF matrix)及培養(yǎng)基(XF medium)大分子成分的電泳圖。Western blot 顯不人源化基質(zhì)中富含 Collagen IV、Fibronectin 和 Laminin(A、B、C)， 而培養(yǎng)基中富含F(xiàn)ibronectin以及Vitronectin等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(D、E)。圖3示出了培養(yǎng)在本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)中的hESCs具有正常核型以及表達(dá)多能性相關(guān)的蛋白。(A)明場(chǎng)中培養(yǎng)在傳統(tǒng)MEF-CM/MG系統(tǒng)(左)以及無動(dòng)物源無飼養(yǎng)層(XF/FCF)系統(tǒng)的H7細(xì)胞的形態(tài)；⑶在XF/FCF中培養(yǎng)39代后，H7細(xì)胞的G-帶染色結(jié)果；(C)FACS分析不同培養(yǎng)條件下，表達(dá)多能性相關(guān)的蛋白0ct4，SSEA4，TRA-1-60 and TRA-1-81的H7細(xì)胞的百分比；兩者之間沒有明顯區(qū)別。(D)定量RT-PCR分析不同培養(yǎng)系統(tǒng)中，H7細(xì)胞0ct4， Sox2 and Nanog的表達(dá)量(基因的表達(dá)水平以GAPDH的表達(dá)量歸一)，兩者之間沒有明顯區(qū)別。圖4示出了培養(yǎng)在XF/FCF的H7體內(nèi)體外均具有向三胚層細(xì)胞分化的潛能。(A) RT-PCR分析由MEF-CM/MG(左)以及XF/FCF(右)培養(yǎng)的H7分化形成的EBs基因表達(dá)情況； (B)H7在XF/FCF培養(yǎng)14代后在N0D/SCID小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤，對(duì)畸胎瘤進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。箭頭指示來源于三胚層的典型結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺，100 μ m。圖5示出了形成的hiPSCs表達(dá)多能性相關(guān)蛋白同時(shí)具有與胚胎干細(xì)胞hESCs相似的甲基化水平。(A)iPS細(xì)胞表達(dá)0ct4，SSEA4，TRA-l-60以及TRA-1-81等蛋白的免疫熒光染色，標(biāo)尺，100 μ m ; (B)定量RT-PCR分析H7與iPS細(xì)胞內(nèi)0ct4，Sox2以及Nanog的表達(dá)量，基因的表達(dá)水平以GAPDH的表達(dá)量歸一 ；(C)重亞硫酸鹽測(cè)序分析H7，HDFs以及iPS 細(xì)胞內(nèi)，0ct4與Nanog啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，空圈代表未甲基化的CpGs，黑圈代表甲基化的 CpGs。圖6示出了形成的hiPSCs體內(nèi)體外均具有向三胚層細(xì)胞分化的潛能。(A)RT-PCR 分析由iPS (右)與H7 (左)分化形成的EBs基因表達(dá)情況；(B) Cl-OSN在XF/FCF培養(yǎng)7代后在N0D/SCID小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤，對(duì)畸胎瘤進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。箭頭指示來源于三胚層的典型結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺，100 μ m。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的新型無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要包含二個(gè)主要的方面1)干細(xì)胞賴以貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)(FCF matrix) ；2)維持胚胎干細(xì)胞自我更新的細(xì)胞培養(yǎng)基(XF medium)。I、人源化基質(zhì)的提取我們通過對(duì)Matrigel提取方法的優(yōu)化，發(fā)展出了一種簡(jiǎn)單易行的從胎盤中提取細(xì)胞外基質(zhì)的方法。首先，我們從醫(yī)院取得乙肝、艾滋病、梅毒等檢測(cè)陰性的健康產(chǎn)婦的胎盤。根據(jù)人源化基質(zhì)提取過程主要分為四部分(圖I)，首先將胎盤組織剪碎，其次去除血液蛋白與細(xì)胞蛋白，再次提取細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的組分，最后除菌以及透析到TBS溶液中。I、I準(zhǔn)備試劑(I) 2M Tris 緩沖液，pH 7. 5242. 28g Tris 堿溶于 800ml Milli-Q 水中，調(diào)節(jié) pH 至 7. 5，加 Milli-Q 水補(bǔ)齊至 1L。(2) IM NaCl 緩沖液，pH 7. 558. 5g NaCl與25ml 2M Tris緩沖液，溶于Milli-Q水中，調(diào)節(jié)pH至7. 5補(bǔ)齊至 1L。(3) 2M尿素緩沖液240. Og 尿素，12. Ig Tris 堿，18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，濃 HCl 調(diào)節(jié) pH 至7. 4，Milli-Q水補(bǔ)齊至2L。(4) TBS 緩沖液12. Ig Tris 堿，18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，濃 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7. 4， Milli-Q水補(bǔ)齊至2L。
(5) 75% 乙醇溶液。所有溶液儲(chǔ)存于4°C。1、2準(zhǔn)備胎盤(I)取回的新鮮胎盤儲(chǔ)存于冰盒內(nèi)。(2)去掉羊膜與臍帶后，將胎盤剪成大概5X5cm的組織塊，_80°C保存。(3)提取基質(zhì)時(shí)，將胎盤組織塊取出，室溫解凍。(4)以解剖剪剪成不超過O. 3X0. 3X0. 3cm大小的組織塊，稱取重量。1、3實(shí)驗(yàn)步驟(I)以2L左右的冷水將組織塊懸起，4°C攪拌，1 1后，用ImmX Imm的篩網(wǎng)過濾。將截留的組織仍用2L冷水懸起。(2)以冷水洗2天，每12h換水一次。(3)第三次過濾時(shí)，將截留的組織用2L冷的IM NaCl緩沖液懸起，4°C攪拌。(4)以冷的IM NaCl緩沖液洗4天，每12h換液一次。(5)第八次更換NaCl緩沖液時(shí)，ImmX Imm的篩網(wǎng)過濾，將截留的組織用冷的O. 5M
醋酸溶液懸起，4 °C攪拌。(6)以冷的O. 5M醋酸溶液洗3天，每1此換液一次。(7)第六次換O. 5M醋酸溶液時(shí)，ImmX Imm的篩網(wǎng)過濾，將截留的組織稱重。以胃蛋白酶組織為I : 400的質(zhì)量比加入胃蛋白酶(P印sin)，同時(shí)以200g/L將酶與組織塊懸起于O. 5M醋酸溶液中。4°C攪拌24h。(8)7100g，4°C離心，lh。去掉上清，收集沉淀并稱重。(9)以質(zhì)量體積比為I : I的條件加入2M尿素溶液。4°C攪拌24h。(10) 13000rpm,4°C離心 30min。保留上清。(11)上清裝入25KD的透析袋中，以TBS+0. 5%氯仿為周圍溶液透析，4°C，2h。(12)徹底清洗燒杯與透析袋外表面后，以冷的TBS為周圍溶液，繼續(xù)透析，4°C。(13)每2h換TBS —次，共換3次，最后一次透析時(shí)，4°C，過夜。(14)將透析好的液體，即為FCF matrix，在超凈臺(tái)內(nèi)小心分裝于I. 5ml EP管內(nèi)，
盡量避免溫度升高。保存于_20°C。與Matrigel的成分相似,本發(fā)明制備的人源化基質(zhì)富含人IV型膠原(Collagen IV)、纖維粘連蛋白(Fibronectin)和層粘連蛋白(Laminin)(見圖2-A、B、C)。2、人源化培養(yǎng)基的制備2、I準(zhǔn)備試劑(I)Ringer solution NaCl :0. 9g, KCl :0. 042g, CaCl2 :0. 0242g,溶于 100ml 的 ddH20,用 O. 22um 的濾膜
過濾備用。(2) 2M CaCl2 CaCl2 :11. lg，溶于 50ml 的 ddH20,用 O. 22um 的濾膜過濾備用。2、2血漿處理(I)將經(jīng)過安全檢測(cè)的四種血型的血漿，以等體積比例混合，分裝成36ml/BD管。 每管加入6ml的Ringer solution,混合均勻。再加入2M CaCl2至終濃度為20mM,混勻，置于37 °C水浴鍋孵育兩小時(shí)。
(2)將已凝固的血漿，存于_20°C過夜。
2、3實(shí)驗(yàn)步驟
(I)將處理過的血漿從_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，過夜解凍。
(2)高速冷凍離心機(jī)在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，即是血漿來源的血清。
(3)在4°C冷柜中，緩慢、均勻的加入NaCl，至終濃度為28g/100ml，攪拌過夜。
(4)高速冷凍離心機(jī)在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，將收集的上清用濾紙過濾掉懸浮的小顆粒。
(5)將過濾的上清，裝入25KD的透析袋中，在冷的ddH20中攪拌透析2小時(shí)以上。
(6)重復(fù)步驟(5)兩次。
(7)將步驟6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12，攪拌透析過夜。
(8)取出透析袋內(nèi)的溶液，以外部DMEM/F12為對(duì)照，280nm測(cè)定蛋白濃度，O. 22 μ m過濾后，保存于4°C，此即為血漿的NaCl沉淀組分。
2、3人源化培養(yǎng)基配制
(I)微量元素的配制
MiIIi-Q水以濃HCl調(diào)節(jié)pH值至O. 9-1.0。稱取下列藥品
權(quán)利要求
1.一種新型的無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于包括支持人多能干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的人源化基質(zhì)和人源化培養(yǎng)基，所述的人源化基質(zhì)富含人IV型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白，所述的人源化培養(yǎng)基富含纖維粘連蛋白和玻璃連接蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述的人源化基質(zhì)按如下步驟制備而成(1)新鮮胎盤去掉羊膜與臍帶后，剪成不超過0.3X0. 3X0. 3cm大小的組織塊，以冷水將組織塊懸起，4°C攪拌，12h后，用1_X Imm的篩網(wǎng)過濾，將截留的組織仍用冷水懸起，以冷水洗2天，每12h換水一次，第三次過濾后，將截留的組織用冷的IM NaCl緩沖液懸起， 4°C攪拌；其中所述的NaCl緩沖液按如下方法配制58. 5g NaCl與25ml Tris緩沖液，溶于Milli-Q水中，調(diào)節(jié)pH至7. 5，定容至IL ;所述的Tris緩沖液按如下方法配制242. 28g Tris堿溶于800ml Milli-Q水中，調(diào)節(jié)pH至7. 5，加Milli-Q水定容至IL ；(2)以冷的IMNaCl緩沖液洗4天，每12h換液一次，第八次更換NaCl緩沖液時(shí)，用 ImmXlmm的篩網(wǎng)過濾，將截留的組織用冷的0. 5M醋酸溶液懸起，4°C攪拌；(3)以冷的0.5M醋酸溶液洗3天，每12h換液一次，第六次換0. 5M醋酸溶液時(shí)，用 ImmXlmm的篩網(wǎng)過濾，將截留的組織稱重；以胃蛋白酶組織為I : 400的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，同時(shí)以200g/L將酶與組織塊懸起于0. 5M醋酸溶液中，4°C攪拌24h ；(4)7100g，4°C離心lh，去掉上清，收集沉淀并稱重，以質(zhì)量體積比為I: I的條件加入 2M尿素緩沖液，4°C攪拌24h ;其中所述的尿素緩沖液按如下方法配制240. Og尿素、12. Ig Tris 堿、18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q水中，濃HCl 調(diào)節(jié) pH至 7. 4，Milli_Q水定容至 2L ；(5)13000rpm，4°C離心30min，上清液裝入25KD的透析袋中，以TBS緩沖液+0. 5%氯仿為周圍溶液于4°C透析2h，然后徹底清洗燒杯與透析袋外表面后，以冷的TBS緩沖液為周圍溶液，繼續(xù)4°C透析，每2h換TBS緩沖液一次，共換3次，最后一次透析時(shí)，4°C，過夜，透析好的液體，即為人源化基質(zhì)；其中所述的TBS緩沖液按如下方法配制12. Ig Tris堿，18. Og NaCl溶于I. 8L Milli-Q水中，濃HCl調(diào)節(jié)pH至7. 4，Milli-Q水補(bǔ)齊至2L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述的人源化培養(yǎng)基含有人血漿的NaCl沉淀組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述的人血漿的NaCl 沉淀組分按如下步驟制備而成(1)將經(jīng)過安全檢測(cè)的四種血型的血漿，以等體積比例混合，分裝成36ml/BD管，每管加入6ml的林格液，混合均勻后再加入2M CaCl2至終濃度為20mM，混勻，置于37°C水浴鍋孵育兩小時(shí)，將已凝固的血漿，存于-20 V過夜；(2)將處理過的血漿從_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，過夜解凍，高速冷凍離心機(jī)在 4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，即是血漿來源的血清；(3)在4°C冷柜中，向血清中緩慢、均勻地加入NaCl，至終濃度為28g/100ml，攪拌過夜；(4)高速冷凍離心機(jī)在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，將收集的上清用濾紙過濾掉懸浮的小顆粒；(5)將過濾的上清，裝入25KD的透析袋中，在冷的雙蒸水中攪拌透析2小時(shí)以上；(6)重復(fù)步驟(5)兩次；(7)將步驟6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培養(yǎng)基，攪拌透析過夜；(8)取出透析袋內(nèi)的溶液，以外部DMEM/F12培養(yǎng)基為對(duì)照，280nm測(cè)定蛋白濃度，0.22 um過濾后，保存于4°C，此即為血漿的NaCl沉淀組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于步驟(I)中所述的林格液按如下方法配制JfNaCl 0. 9g，KCl 0. 042g，CaC12 0. 0242g，溶于IOOml的雙蒸水，用0.22um的濾膜過濾備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型的無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，應(yīng)用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法從胎盤組織中提取了能夠支持人胚胎干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白即人源化基質(zhì)，同時(shí)以人血漿為原料，以NaCl沉淀的方法獲得的組分配制成的人源化培養(yǎng)基，與人源化基質(zhì)共同構(gòu)成無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)系統(tǒng)。這一培養(yǎng)系統(tǒng)能夠長(zhǎng)期維持人胚胎干細(xì)胞的自我更新以及分化的潛能，同時(shí)無動(dòng)物源的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞細(xì)胞系也可在這一培養(yǎng)系統(tǒng)中建立，因此這一成本低廉，易于擴(kuò)大培養(yǎng)的無動(dòng)物源、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)為多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102586176SQ201210007010
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者牟曉寧, 王奇慧, 馬躍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所