專(zhuān)利名稱(chēng)：表達(dá)Th1特性和溶細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞的制作方法
表達(dá)Thi特性和溶細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞
背景技術(shù)：
治療性癌癥疫苗接種是一類(lèi)免疫療法。免疫療法是一種新的治療方式，其出現(xiàn)以使化學(xué)療法、放射療法和外科結(jié)合作為用于治療癌癥的一類(lèi)藥物。免疫治療方法試圖利用免疫系統(tǒng)的力量以治療疾病。治療性疫苗接種是這樣一種類(lèi)型的免疫療法，其是針對(duì)現(xiàn)有的腫瘤、病毒和細(xì)菌性病原體的潛在的治愈性療法。治療性疫苗一般由來(lái)源于目標(biāo)疾病的抗原源和旨在增強(qiáng)所需的免疫反應(yīng)的佐劑組成。在一些治療性疫苗治療方案中，活免疫細(xì)胞(來(lái)源于宿主(自體)，或來(lái)源于供體(同種異體))為治療性疫苗的組分。自體和同種異體的活免疫細(xì)胞(例如樹(shù)突細(xì)胞、NK細(xì)胞和T-細(xì)胞)也可在用于治療癌癥的免疫療法治療方案中使用。淋巴細(xì)胞是脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的一部分，且包括大顆粒淋巴細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞。大顆粒淋巴細(xì)胞包括天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)。小淋巴細(xì)胞由T-細(xì)胞和B細(xì)胞組成。NK細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的一部分，且在保護(hù)動(dòng)物免受腫瘤和受病毒感染細(xì)胞侵害中起重要作用。NK細(xì)胞可以通過(guò)多組織相容性復(fù)合物(multihistocompatibility complex) (MHC)I類(lèi)表面分子將受感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞與未感染的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。NK細(xì)胞響應(yīng)于細(xì)胞因子被激活，且在激活時(shí)釋放破壞受感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性顆粒，例如穿孔素和粒酶(granzyme) B。NK細(xì)胞以細(xì)胞表面標(biāo)記⑶16+和⑶56+為特征，但不表達(dá)⑶4。T-細(xì)胞和B-細(xì)胞是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的一部分，且識(shí)別非自身抗原。B-細(xì)胞通過(guò)抗體產(chǎn)生響應(yīng)非自身抗原。不同類(lèi)型的T-細(xì)胞以不同方式響應(yīng)非自身抗原。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)以標(biāo)記⑶3+、⑶8+和TCRa β為特征，而不表達(dá)⑶4。腫瘤特異性⑶8+CTL主要負(fù)責(zé)腫瘤消除。此外，CTL可以特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，而不攻擊相同組織的正常細(xì)胞。CTL產(chǎn)生毒性顆粒，毒性顆粒包含效力大的酶，效力大的酶包括粒酶B和穿孔素，其引起病變細(xì)胞或癌細(xì)胞死亡。T輔助細(xì)胞以細(xì)胞表面標(biāo)`記⑶3+、⑶4+和TCRa β為特征。T輔助細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子或其他分子，細(xì)胞因子或其他分子通過(guò)其他細(xì)胞或分子引導(dǎo)免疫反應(yīng)。還未知T輔助細(xì)胞直接介導(dǎo)細(xì)胞的殺死，因而通常不包含細(xì)胞毒性顆粒，例如粒酶B或穿孔素。T輔助細(xì)胞的子分類(lèi)為兩種類(lèi)型Τ輔助細(xì)胞I型(Thl)和T輔助細(xì)胞2型(Th2)。Thl細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫且對(duì)于免疫介導(dǎo)的腫瘤根除是關(guān)鍵的，而Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫或抗體免疫。Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞是反調(diào)節(jié)的，增加Thl細(xì)胞會(huì)下調(diào)Th2細(xì)胞，反之亦然。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種各樣的免疫治療方法和組合物，以增強(qiáng)或抑制患者的免疫反應(yīng)。細(xì)胞治療方法經(jīng)常包括離體操作，例如細(xì)胞的增殖、分化和/或激活以及將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移給向患者作為治療。過(guò)繼免疫療法(adoptive immunotherapy)包括從患者中除去淋巴細(xì)胞,增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的離體抗癌活性，將細(xì)胞生長(zhǎng)至大臨床相關(guān)數(shù)目，然后將細(xì)胞返回到患者。過(guò)繼免疫療法的最初實(shí)驗(yàn)包括從患者血液中分離出淋巴細(xì)胞，且在淋巴因子白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、免疫刺激物的存在下使淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)。然后將細(xì)胞返回到患者。這些淋巴細(xì)胞被稱(chēng)為淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)。
使用從腫瘤本身分離出的淋巴細(xì)胞獲得針對(duì)腫瘤細(xì)胞的更強(qiáng)的反應(yīng)。使這些腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)在IL-2的存在下生長(zhǎng)，且返回到身體以攻擊腫瘤。過(guò)繼免疫療法是一種形式的免疫療法，其中離體處理的細(xì)胞被引入身體內(nèi)。臨床前研究表明，抗腫瘤活性可以通過(guò)使用白細(xì)胞介素-2以及離體激活和擴(kuò)增的自體淋巴細(xì)胞而增強(qiáng)。并且，高劑量藥團(tuán)(bolus)白細(xì)胞介素-2療法的第一目標(biāo)反應(yīng)在接受白細(xì)胞介素2以及LAK細(xì)胞的患者中被觀(guān)察到,其中LAK細(xì)胞是通過(guò)體外激活經(jīng)淋巴去除術(shù)(Iymphopheresis)收獲的自體外周血淋巴細(xì)胞制備的,且最初,似乎白細(xì)胞介素-2/LAK的組合比僅白細(xì)胞介素-2活性更高。IL-2是由Thl輔助細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。在臨床研究未能證明向IL-2添加激活的LAK或TIL細(xì)胞比僅IL-2更有效之后，采用過(guò)繼免疫療法的興趣下降了。⑶4+T(Th)細(xì)胞對(duì)于激活和調(diào)節(jié)宿主針對(duì)感染的防御的大多數(shù)方面是至關(guān)重要的，且對(duì)于細(xì)胞毒性CD8+淋巴細(xì)胞(CTL)的充分作用是至關(guān)重要的。大部分腫瘤免疫學(xué)的研究已經(jīng)集中于天然存在的自體腫瘤特異性T細(xì)胞，天然存在的自體腫瘤特異性T細(xì)胞主要是CD8+且可以從黑色素瘤和其他一些腫瘤分離出。這些細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增和再輸入。這種類(lèi)型的過(guò)繼免疫療法已經(jīng)導(dǎo)致在一些患者中的目標(biāo)腫瘤反應(yīng)和長(zhǎng)期生存，這些患者的疾病對(duì)于其他干預(yù)措施是難治的。雖然有使用CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞作為過(guò)繼免疫療法的豐富臨床經(jīng)驗(yàn)，臨床反應(yīng)不佳強(qiáng)調(diào)需要提高這些療法，以達(dá)到更高比例的患者中的腫瘤排斥。由于缺乏⑶4+T細(xì)胞的輔助，⑶8+淋巴細(xì)胞可能在很大程度上未能保持體內(nèi)功能。在體外，CD8+細(xì)胞在暴露于MHC相容的細(xì)胞系時(shí)釋放出大量的干擾素-Y (IFN-Y)，且溶解自體抗原陽(yáng)性和MHC I類(lèi)-陽(yáng)性腫瘤。然而，腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性時(shí)常導(dǎo)致處理和呈現(xiàn)內(nèi)源性抗原的能力的損失，內(nèi)源性抗原使得腫瘤成為CD8+溶細(xì)胞T細(xì)胞的固有不可靠的目標(biāo)。此外，CD8+T細(xì)胞似乎缺乏協(xié)調(diào)廣大抗腫瘤反應(yīng)的內(nèi)在能力，其似乎是一些CD4+T細(xì)胞亞群固有的。雖然CTL過(guò)繼轉(zhuǎn)移的免疫療法已在許多動(dòng)物模型中證明有希望，這些結(jié)果對(duì)人類(lèi)的翻譯已經(jīng)證明是困難的和難取得`的。CD4+細(xì)胞(尤其是Thl亞型)將是有吸引力的可用免疫療法醫(yī)療設(shè)備的附加物，以為過(guò)繼轉(zhuǎn)移的CD8+殺傷細(xì)胞提供天然的“幫助”。然而，在利用天然存在的腫瘤特異性CD4+細(xì)胞進(jìn)行處理方面存在重大障礙。在任何給定患者人群中與CD4+輔助細(xì)胞結(jié)合的II類(lèi)HLA的遺傳多樣性比在CD8+溶細(xì)胞(殺傷)T-細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的I類(lèi)HLA的情況復(fù)雜得多，使識(shí)別表位和TCR更有問(wèn)題。此外，⑶4+T-細(xì)胞比⑶8+細(xì)胞在體外擴(kuò)增更差，且培養(yǎng)條件顯著影響它們的特性。最后，缺乏基于腫瘤特異性CD4+細(xì)胞的現(xiàn)實(shí)的動(dòng)物模型。這些因素已經(jīng)限制使用⑶4+T細(xì)胞的翻譯研究，且已經(jīng)限制其臨床應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了一種用于生產(chǎn)臨床相關(guān)數(shù)目⑶4+細(xì)胞的方法，⑶4+細(xì)胞也含有溶細(xì)胞顆粒粒酶B和穿孔素，且都作為T(mén)hl細(xì)胞(產(chǎn)生IFN-Y而不產(chǎn)生IL-4)起作用，且具有用于治療性癌癥疫苗和過(guò)繼免疫細(xì)胞治療方案的NK樣活性(識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞而不識(shí)別和殺傷正常細(xì)胞)。

發(fā)明內(nèi)容
基于細(xì)胞的治療性癌癥疫苗(細(xì)胞免疫療法)有希望作為新的毒性最小的用于治療癌癥的方法。這種方法的希望已在動(dòng)物模型中被證明，但將這種希望翻譯到臨床是困難的(Bodey，Bodey等，2000)。最近FDA批準(zhǔn)第一個(gè)細(xì)胞免疫治療藥物，Provenge (sipuleucel-T)，用于治療無(wú)癥狀或癥狀最輕的轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌的自體樹(shù)突細(xì)胞免疫療法(Kantoff，Higano等)，已經(jīng)恢復(fù)了開(kāi)發(fā)改善的用于臨床應(yīng)用的細(xì)胞治療產(chǎn)品的熱情。因?yàn)?成功地翻譯在動(dòng)物中開(kāi)發(fā)的細(xì)胞免疫治療策略的免疫介導(dǎo)的抗腫瘤機(jī)制已證明是困難的，代替地我們集中于翻譯已經(jīng)已知引起顯著的臨床抗腫瘤效應(yīng)的抗腫瘤免疫機(jī)制。有爭(zhēng)議的是，人類(lèi)有史以來(lái)曾經(jīng)描述的效力最大和最有效的免疫介導(dǎo)的抗腫瘤機(jī)制是在非清髓性調(diào)節(jié)和移植HLA配對(duì)的干細(xì)胞之后發(fā)生的移植物抗腫瘤(GVT)效應(yīng)(Barrett和 Childs2000 ；Childs 2000 ;Resnick，Shapira 等 2005)。不幸的是，這些 GVT 效應(yīng)經(jīng)常伴隨有慢性移植物抗宿主病(GVHD)毒性。慢性GVHD與顯著的發(fā)病率相關(guān)聯(lián)，且是同種異體造血干細(xì)胞移植之后的晚期死亡率的主要原因(Lee，Klein等2002)，顯著地限制了 GVT機(jī)制的臨床應(yīng)用。將有益的GVT效應(yīng)與有害的GVHD效應(yīng)分離開(kāi)是困難的，因?yàn)檫@些效應(yīng)是相互關(guān)聯(lián)的和成比例的，因?yàn)橐种艷VHD的操作也降低GVT效應(yīng)(Li，Giver等2009)。通過(guò)分析已知的相互關(guān)聯(lián)的GVT和GVHD效應(yīng)的免疫介導(dǎo)機(jī)制，假設(shè)可能可以開(kāi)發(fā)同種異體細(xì)胞免疫療法代替分離GVT效應(yīng)/GVHD效應(yīng)，這將通過(guò)將移植物-到-宿主逆轉(zhuǎn)至宿主-到-移植物而保持免疫機(jī)制的相互關(guān)系(Har-Noy和Slavin 2008)。效應(yīng)方向的成功逆轉(zhuǎn)將導(dǎo)致與無(wú)毒的宿主抗移植物(HVG)排斥效應(yīng)結(jié)合的宿主抗腫瘤(HVT)效應(yīng)。假設(shè)表達(dá)高密度⑶40L且產(chǎn)生大量干擾素(IFN)-Y的故意錯(cuò)配對(duì)的、激活的、同種異體Thl細(xì)胞將能夠引起結(jié)合的HVT/HVG效應(yīng)。在化學(xué)療法難治性B細(xì)胞白血病/淋巴瘤的動(dòng)物模型中試驗(yàn)這種假設(shè)(Har-Noy, Zeira等2008)。這些研究證明，只有當(dāng)連接至抗-⑶3/抗-⑶28-包被的微珠子的Thl細(xì)胞被激活且給藥時(shí)，顯著的HVT/HVG活性才可能由離體分化同種異體Thl細(xì)胞引起。另外的研究表明，這些同種異體⑶3/⑶28-交聯(lián)的Thl細(xì)胞具有能夠?qū)⑷硇哉純?yōu)勢(shì)的Th2免疫轉(zhuǎn)換到占優(yōu)勢(shì)的Thl免疫的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)；以及用于促進(jìn)Thl特異性免疫發(fā)展和腫瘤免疫避免(immunoavoidance)機(jī)制失調(diào)的輔助效應(yīng)(Har-Noy, Zeira等2009)。鑒于這些數(shù)據(jù)，為了將這種實(shí)驗(yàn)方法翻譯到臨床的可能性對(duì)人類(lèi)版本的Thl移植物進(jìn)行研究。有顯著的與同種異體Thl細(xì)胞的離體分化和擴(kuò)增相關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)的和邏輯的關(guān)心，其需要被克服以便使用這些細(xì)胞用于人類(lèi)臨床研究。一個(gè)這樣的問(wèn)題是，小鼠版本的同種異體Thl細(xì)胞需要使用外源細(xì)胞因子、IL-2、IL-12和抗-1L-4mAb，以引起小鼠Thl細(xì)胞的離體分化。本發(fā)明公開(kāi)了用于生產(chǎn)人類(lèi)同種異體Thl細(xì)胞的符合GMP要求的方法的成功發(fā)展，無(wú)需使用外源細(xì)胞因子，導(dǎo)致批與批之間的一致相同和為了作為人類(lèi)生物藥物分類(lèi)的功能特性。在表征所產(chǎn)生的同種異體移植細(xì)胞時(shí)，人類(lèi)的生產(chǎn)方法導(dǎo)致一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)。由本文所描述的方法產(chǎn)生的同種異體Thl細(xì)胞不僅發(fā)展了 Thl特性，而且發(fā)展了 NK樣特性。具有Thl活性和NK樣活性的組合的同種異體移植物是獨(dú)特的，而在正常的血液循環(huán)中沒(méi)有描述。本發(fā)明的方法包括純化的、休止的具有混合記憶和幼稚表型(分別為CD45RA和⑶45R0)的(⑶25-)，⑶4+T-細(xì)胞的離體培養(yǎng)。該細(xì)胞在沒(méi)有外源細(xì)胞因子的情況下利用固定化的抗-⑶3/抗-⑶28mAb被激活多次。9天之后該細(xì)胞擴(kuò)增25至100倍，且分化為⑶4+、⑶45R0+、⑶25+、⑶62hi細(xì)胞。該中間細(xì)胞可以?xún)?chǔ)存于液氮中多年。當(dāng)需要用于患者給藥時(shí)，前體細(xì)胞利用CD3/CD28mAb包被的微珠子孵育4h。在這最后4小時(shí)孵育的過(guò)程中，前體細(xì)胞進(jìn)一步分化，以減少表達(dá)⑶62L和增加表達(dá)⑶40L和CD25。最后的⑶4+、⑶45R0+、CD40Lh1、CD62L1(\CD25+細(xì)胞產(chǎn)生> 1000pg/106IFN_ Y 細(xì)胞和< 50pg/106IL_4 細(xì)胞(Thl 表型)，且表達(dá)粒酶B和穿孔素的溶細(xì)胞顆粒，且表現(xiàn)出NK樣活性和溶解腫瘤細(xì)胞而不溶解正常細(xì)胞的能力。


圖1A和圖1B是分別說(shuō)明CD4+選擇之前和之后的細(xì)胞表型的來(lái)自CD4表面抗原的免疫染色的流式細(xì)胞儀圖。圖2A是說(shuō)明具有休止的⑶4幼稚(⑶4、⑶45RA)細(xì)胞的源細(xì)胞的表型的一系列流式細(xì)胞儀圖。圖2B是說(shuō)明培養(yǎng)成激活的⑶4記憶細(xì)胞(⑶4、⑶45R0和⑶25)之后表型的變化`的一系列流式細(xì)胞儀圖。圖3是說(shuō)明⑶62L在激活之前CAC中和在激活之后CFB中從高到低的表達(dá)的變化的流式細(xì)胞儀圖。圖4A至圖4C是說(shuō)明在CFB中的增加表達(dá)的分別在⑶4+細(xì)胞、CAC和CFB中的⑶40L表達(dá)譜的圖。圖5是直接殺傷試驗(yàn)的曲線(xiàn)圖且說(shuō)明了 CFB可以殺死來(lái)自腫瘤細(xì)胞系、ARH77的細(xì)胞。圖6A是粒酶B由CAC表達(dá)的圖。圖6B粒酶B由CFB表達(dá)的圖。圖6C是示出在CFB中檢測(cè)出穿孔素的蛋白質(zhì)印跡圖片。圖7是在有EGTA的情況下和在沒(méi)有EGTA的情況下穿孔素-粒酶B活性的曲線(xiàn)圖。
具體實(shí)施例方式本公開(kāi)涉及包括具有獨(dú)特特性的細(xì)胞的組合物。該組合物包括具有Thl輔助細(xì)胞性質(zhì)以及溶細(xì)胞顆粒和NK活性的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞。具有Thl特性和NK特性的組合的CD4+T-細(xì)胞可以為具有各種各樣的疾病的患者提供實(shí)質(zhì)治療能力。Thl特性可以包括，例如，產(chǎn)生IFN-Y而不產(chǎn)生IL-4。NK特性可以包括利用粒酶B和穿孔素的表達(dá)殺死腫瘤細(xì)胞但不殺死正常細(xì)胞。本發(fā)明包括使這種新細(xì)胞類(lèi)型分化和擴(kuò)增至用于過(guò)繼免疫療法的臨床相關(guān)數(shù)目的方法。用于獲得新細(xì)胞的方法可以包括使T-細(xì)胞，特別是CD4+T-細(xì)胞從外周血或其他T-細(xì)胞源分離出。這些CD4+T-細(xì)胞可以根據(jù)本文描述的方法分化和擴(kuò)增至臨床相關(guān)數(shù)目且用于免疫療法。出人意料地，根據(jù)這些方法制備的CD4+T-細(xì)胞可以表現(xiàn)出與一般在NK/CTL細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的溶細(xì)胞活性類(lèi)似的溶細(xì)胞活性，且還可以表現(xiàn)出Thl特性和活性。一般地，T輔助細(xì)胞不直接表現(xiàn)出溶細(xì)胞活性，而是產(chǎn)生細(xì)胞因子和其他因子，細(xì)胞因子和其他因子然后引出例如NK細(xì)胞和CTL的其他細(xì)胞以滅活或殺死病變細(xì)胞。在本組合物中的CD4+T-細(xì)胞可以直接殺死病變細(xì)胞且產(chǎn)生細(xì)胞因子以刺激例如NK細(xì)胞的其他細(xì)胞，其他細(xì)胞然后實(shí)現(xiàn)溶細(xì)胞活性。這些CD4+T-細(xì)胞的溶細(xì)胞活性通過(guò)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞或受感染細(xì)胞的殺死的粒酶B和穿孔素介導(dǎo)。本文提到的溶細(xì)胞活性涉及通過(guò)祀腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系的效應(yīng)細(xì)胞的直接殺死，當(dāng)它們與靶細(xì)胞相互作用時(shí)。直接殺死可以通過(guò)僅存在效應(yīng)物和靶細(xì)胞而不存在其他細(xì)胞類(lèi)型而發(fā)生。本發(fā)明中描述的新細(xì)胞類(lèi)型本文被稱(chēng)為T(mén)hl/殺傷細(xì)胞(Thl/killer cells)。Thl/殺傷細(xì)胞可以表現(xiàn)出Thl特性、殺死腫瘤細(xì)胞而不殺死正常細(xì)胞以及通過(guò)粒酶B和穿孔素表達(dá)機(jī)制的NK活性表達(dá)的組合。本文提到的臨床相關(guān)數(shù)目細(xì)胞涉及足夠數(shù)目Thl/殺傷細(xì)胞以直接或間接引起抗腫瘤效應(yīng)。一般給藥的Thl/殺傷細(xì)胞的數(shù)目在單個(gè)劑量中為至少I(mǎi)xlO6個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選至少I(mǎi)xlO7數(shù)目細(xì)胞，且更優(yōu)選至少約IxlO8數(shù)目細(xì)胞。具有更大量細(xì)胞的劑量也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選地足夠量細(xì)胞從單個(gè)血液供體生產(chǎn)，以產(chǎn)生用于多個(gè)患者的足夠劑量。臨床相關(guān)數(shù)目包括用于至少一個(gè)患者的足夠細(xì)胞，更優(yōu)選用于高達(dá)10個(gè)患者的足夠細(xì)胞，且最優(yōu)選用于100個(gè)以上患者的足夠細(xì)胞。本發(fā)明的組合物可以向具有各種各樣的病變細(xì)胞的患者給藥?；颊呖梢允莿?dòng)物、人或其他哺乳動(dòng)物。病變細(xì)胞可以是癌細(xì)胞或來(lái)自受感染組織的細(xì)胞。病變細(xì)胞可以是被病毒和/或細(xì)菌性病原體感染的。組合物可以向具有實(shí)體瘤的患者給藥，實(shí)體瘤為例如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌等等。組合物也可以向具有血液系統(tǒng)惡性腫瘤(例如，慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤)或病毒感染性疾病(例如，乙型或丙型肝炎、皰疹、HIV)和其他障礙的患者給藥。本文描述的組合物是活細(xì)胞?；罴?xì)胞是指當(dāng)通過(guò)適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)技術(shù)(例如臺(tái)盼藍(lán)排除法、MTT或ATP水平的生物發(fā)光 檢測(cè))測(cè)定時(shí)> 70%的細(xì)胞是能存活的，以便該細(xì)胞能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下離體操作，例如擴(kuò)增、分化和/或激活。然而，組合物可以包括一些滅活的細(xì)胞、輻射的細(xì)胞和/或不能存活的細(xì)胞和無(wú)生命組分。該組合物一般包括最初例如從供體的血液獲得的⑶4+細(xì)胞。供體可以是無(wú)疾病的或正常的。CD4+可以本文描述的方式被處理，然后被配制用于輸注到相同的供體或有關(guān)或無(wú)關(guān)的受體。⑶4+源細(xì)胞優(yōu)選從外周血純化。⑶4細(xì)胞可以各種各樣的方式純化。一般地，⑶4+細(xì)胞通過(guò)正向選擇從外周血的血沉棕黃層(buffy coat)純化。⑶4+從血沉棕黃層的正向選擇可以例如通過(guò)使用從Miltenyi Biotec (奧本,加州)獲得的磁性珠子和柱子而進(jìn)行。這可以導(dǎo)致細(xì)胞組合物，該細(xì)胞組合物比約90%純⑶4+細(xì)胞更大，優(yōu)選比約95%純⑶4+細(xì)胞更大，且更優(yōu)選比約98 %純CD4+細(xì)胞更大。從血沉棕黃層分離出且作為用于生產(chǎn)Thl/殺傷細(xì)胞的源材料的⑶4+細(xì)胞可以許多細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)為特征。從外周血的血沉棕黃層純化的CD4+細(xì)胞的種群可以具有⑶45RA/⑶45R0標(biāo)記的混合種群。⑶4+T-細(xì)胞一般主要是⑶25_。優(yōu)選地，源⑶4+細(xì)胞大部分是幼稚的(表達(dá)⑶45RA而不表達(dá)⑶45R0)。也可以根據(jù)⑶62L表達(dá)和⑶40L表達(dá)對(duì)源⑶4+T-細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。一般地，源⑶4+T-細(xì)胞表達(dá)非常低量的⑶40L。⑶62L的表達(dá)可以是雙峰的(高的和低的)平均熒光強(qiáng)度(MFI)峰。源CD4+細(xì)胞優(yōu)選具有高CD62L表達(dá)。源⑶4+T-細(xì)胞可以被處理以通過(guò)多個(gè)激活步驟分化成Thl/殺傷細(xì)胞。優(yōu)選地，⑶4+細(xì)胞在9天內(nèi)每三天被激活。這些⑶4+細(xì)胞優(yōu)選通過(guò)⑶3和⑶28細(xì)胞表面分子的交聯(lián)而被激活，⑶3和⑶28的交聯(lián)可以通過(guò)加入固定化的抗-⑶3和⑶28單克隆抗體而實(shí)現(xiàn)。一般地，Thl/殺傷細(xì)胞通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物中的分化和擴(kuò)增而獲得。多次激活的CD4+細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)物收獲且冷凍儲(chǔ)存在液氮中。向患者給藥之前，細(xì)胞最后一次被激活。使激活劑與細(xì)胞結(jié)合。連接有激活劑的細(xì)胞在裝置中被配制，裝置為例如注射器，適合用于輸注或注射。本文使用的“激活”是指細(xì)胞表面分子被例如單克隆抗體的試劑結(jié)合以及這些試劑被交聯(lián)劑交聯(lián)。這種類(lèi)型的激活例如在美國(guó)專(zhuān)利No. 7，435，592和美國(guó)專(zhuān)利No. 7，402，431中被描述，這兩者都通過(guò)引用并入本文。⑶4+T-細(xì)胞可以 各種各樣的方式被激活，各種各樣的方式包括通過(guò)使用固定化的對(duì)于T-細(xì)胞表面分子特異性的單克隆抗體。適當(dāng)?shù)募せ畹腡-細(xì)胞例如在美國(guó)專(zhuān)利No. 7，435，592中被描述。細(xì)胞優(yōu)選具有細(xì)胞表面部分，細(xì)胞表面部分被單克隆抗體或其他結(jié)合劑結(jié)合，單克隆抗體或其他結(jié)合劑然后被交聯(lián)。這些單克隆抗體和/或結(jié)合劑優(yōu)選被例如固定在固體表面以激活T-細(xì)胞的試劑交聯(lián)。這些在本文被稱(chēng)為在培養(yǎng)物中激活的細(xì)胞(CAC)。這些離體制備的可以被冷凍用于將來(lái)使用或被配制用于輸注。CAC例如可以被等分且冷凍在液氮罐的氣相中。CAC能夠始終滿(mǎn)足預(yù)先定義的標(biāo)識(shí)和功能釋放標(biāo)準(zhǔn)，如以下所描述的。建立過(guò)程和最終質(zhì)量控制試驗(yàn)，以保證無(wú)菌和無(wú)內(nèi)毒素狀態(tài)。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，CD4+T-細(xì)胞在從Invitrogen，卡爾斯巴德，加州獲得的⑶3/⑶28 ClinEx Vivo Dynal珠子的存在下培養(yǎng)9天。細(xì)胞在生命細(xì)胞培養(yǎng)瓶(BaxterScientific，迪爾菲爾德，伊利諾斯州)中在37°C和5% CO2下生長(zhǎng)且在培養(yǎng)的3天和6天利用珠子再刺激。在培養(yǎng)物中9天之后，可以除去珠子且細(xì)胞可以被稱(chēng)為CAC。為了激活培養(yǎng)細(xì)胞的其他方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，離體制備的CAC冷凍儲(chǔ)存，直到需要用于患者給藥或其他用途。向患者給藥之前，CAC被解凍(如果必要的話(huà))，洗滌且通過(guò)交聯(lián)例如⑶3和⑶28的細(xì)胞表面結(jié)合部分而在營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中再激活，如例如在美國(guó)專(zhuān)利No. 7，402，431中描述的。CAC，與激活劑和交聯(lián)劑一起，然后可以被洗滌且轉(zhuǎn)移到無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液，例如配制品緩沖液。在配制品緩沖液中的再激活的細(xì)胞在本文被稱(chēng)為配制品緩沖液中的細(xì)胞(CFB)。CFB在本文也可以被稱(chēng)為T(mén)hl/殺傷細(xì)胞。CFB和Thl/殺傷細(xì)胞可以在本文可互換地使用。Thl/殺傷細(xì)胞可以被包裝在注射器或其他適當(dāng)?shù)娜萜髦?，且轉(zhuǎn)移到床旁檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)，如果需要的話(huà)。Thl/殺傷細(xì)胞然后可以向患者給藥用于治療目的。Thl/殺傷細(xì)胞可以被靜脈內(nèi)給藥，腹膜內(nèi)給藥，皮內(nèi)給藥，或通過(guò)其他適當(dāng)?shù)姆椒ńo藥。Thl/殺傷細(xì)胞，一旦轉(zhuǎn)移到無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液，具有有限的保存期限。細(xì)胞可以每毫升至少約IO6個(gè)細(xì)胞、優(yōu)選每毫升約IO7個(gè)細(xì)胞或更高的密度被配制。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞可以每毫升約IO8個(gè)細(xì)胞或更高的密度被配制。細(xì)胞的特定濃度可由細(xì)胞的特定用途和治療方案確定。除了 Thl/殺傷細(xì)胞之外，該組合物還可以包括許多其他組分。這些組分可以包括，例如，將細(xì)胞保持在所需的激活狀態(tài)的試劑。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，該組合物可以包括將T-細(xì)胞保持在激活狀態(tài)的試劑,例如以下在示例中描述的Dynabeads ClinExVivo ?！愕?，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到適合輸注到患者的無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液。細(xì)胞可以在各種各樣的無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液中。本文提到的無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液是缺乏支持細(xì)胞增殖和/或擴(kuò)增的適當(dāng)組分的任何類(lèi)型的介質(zhì)、緩沖液或其他液體。
無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液一般是等滲的，USP無(wú)菌的，無(wú)熱原的，且含有保持活細(xì)胞完整的適當(dāng)?shù)慕M分和/或緩沖體系，且許可用于人類(lèi)胃腸外使用。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液是配制品緩沖液，配制品緩沖液是具有1%人血清白蛋白的Plasmalyte A (BaxterScientific,迪爾菲爾德,伊利諾斯州)。(McKesson,舊金山，加州)在Thl/殺傷細(xì)胞的實(shí)施例中，對(duì)于細(xì)胞的激活信號(hào)被保持，甚至當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液。例如，在細(xì)胞通過(guò)交聯(lián)細(xì)胞表面結(jié)合部分而被激活的實(shí)施例中，交聯(lián)優(yōu)選保持在無(wú)營(yíng)養(yǎng)緩沖液中。在儲(chǔ)存過(guò)程中交聯(lián)的保持可能對(duì)于解除儲(chǔ)存之后恢復(fù)該組合物的是關(guān)鍵的。該組合物中的Thl/殺傷細(xì)胞可以表現(xiàn)出功能特性的新組合。這些功能包括Thl特性和與NK功能類(lèi)似的溶細(xì)胞功能。Thl/殺傷細(xì)胞一般生產(chǎn)IFN- Y，且實(shí)質(zhì)減少生產(chǎn)或不生產(chǎn)IL-4。優(yōu)選地，IL-4生產(chǎn)量為低于50pg/106細(xì)胞，而IFN- Y生產(chǎn)量為大于1000pg/106細(xì)胞。Thl/殺傷細(xì)胞的另外的功能特性可以包括，例如，表達(dá)功能分子，例如⑶40L、FasL、穿孔素和粒酶B，共刺激分子4-1BBL、⑶28、CTLA4，和TNF-相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE), TWEAK, PD-1, Β7族，粘附分子例如整聯(lián)蛋白、鈣粘著蛋白和選擇素；以及分泌各種各樣的細(xì)胞因子和趨化因子；以及表達(dá)這些細(xì)胞因子和趨化因子的受體。Thl/殺傷細(xì)胞可以產(chǎn)生和分泌大量細(xì)胞因子。產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以是，例如，IFNa ,GM-CSF和TNF-a，僅分泌殘留IL4。本文所描述的Thl/殺傷細(xì)胞也可以表現(xiàn)出溶細(xì)胞活性。溶細(xì)胞活性與CTL/NK細(xì)胞的特性類(lèi)似。一般地，CTL/NK細(xì)胞以及Thl/殺傷細(xì)胞的溶細(xì)胞活性對(duì)于腫瘤細(xì)胞或病變細(xì)胞是特異性的，但不是對(duì)于正常細(xì)胞特異性的。換言之，Thl/殺傷細(xì)胞可以殺死病變細(xì)胞，但不殺死正常細(xì)胞。溶細(xì)胞活性可以通過(guò)各種各樣的機(jī)制發(fā)生。溶細(xì)胞活性例如可以通過(guò)粒酶B-穿孔素機(jī)制發(fā)生。溶細(xì)胞活性可以通過(guò)細(xì)胞溶解或細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞破壞。Thl/殺傷細(xì)胞的溶細(xì)胞活性可以被EGTA阻止。例如約ImM的EGTA的濃度可以降低激活的Thl細(xì)胞的溶細(xì)胞活性。 本發(fā)明的Thl/殺傷細(xì)胞可以表達(dá)分子粒酶B和穿孔素。無(wú)論是幼稚的或通過(guò)分化、激活等等成熟之后，粒酶B和穿孔素一般不在CD4+T-細(xì)胞中被表達(dá)。激活的Thl細(xì)胞中的粒酶B和穿孔素的量可以變化。一般地，被表達(dá)的粒酶B和穿孔素的量足以破壞病變細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明包括組合物，該組合物包括Thl/殺傷細(xì)胞。這些Thl/殺傷細(xì)胞可以滅活包括骨髓瘤腫瘤細(xì)胞系的各種各樣的腫瘤細(xì)胞，例如ARH77細(xì)胞。病變細(xì)胞的滅活可以通過(guò)對(duì)EGTA敏感的機(jī)制實(shí)現(xiàn)。效應(yīng)細(xì)胞(Thl/殺傷細(xì)胞)與靶細(xì)胞(病變細(xì)胞)的比可以變化。效應(yīng)物與靶細(xì)胞的比可以為至少1: 9，優(yōu)選至少1: 5，更優(yōu)選至少1:1。本發(fā)明包括一種用于破壞病變細(xì)胞的方法。病變細(xì)胞可以在患者中?；颊呃缈梢跃哂邪┌Y或包含由于受病毒感染的受感染組織?；颊呖梢跃哂袑?shí)體瘤或血液系統(tǒng)惡性腫瘤。該方法可以包括向患者給藥包括本文描述的Thl/殺傷細(xì)胞的組合物。Thl/殺傷細(xì)胞優(yōu)選對(duì)于患者是同種異體的。同種異體細(xì)胞可以來(lái)自一個(gè)正常的同種異體供體。可選地，同種異體細(xì)胞可以從多個(gè)供體獲得且組合成治療性組合物。優(yōu)選地，患者與同種異體細(xì)胞之間的組織相容性適配被最大化?；颊吲c同種異體細(xì)胞之間的某些組織相容性可以耐受，且仍然可以導(dǎo)致所需的效應(yīng)。Thl/殺傷細(xì)胞可以包括皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)等等的各種各樣的途徑向患者給藥?；颊呖梢越o藥一個(gè)劑量或多個(gè)劑量。向患者給藥的細(xì)胞的數(shù)目可以變化，且可能取決于特定的疾病、患者、激活方法和其他因素。一般地，向患者給藥至少I(mǎi)O7個(gè)激活的Thl細(xì)胞，優(yōu)選至少I(mǎi)O8個(gè)細(xì)胞，且更優(yōu)選至少約IO9個(gè)細(xì)胞。本發(fā)明還包括一種通過(guò)給藥包括Thl/殺傷細(xì)胞的組合物治療患者的方法?；颊呖梢越邮芤粋€(gè)或多個(gè)劑量的Thl/殺傷細(xì)胞。劑量的量和頻率可以變化，且可以取決于特定的疾病。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，Thl/殺傷細(xì)胞對(duì)于患者是同種異體的，且向患者給藥Thl/殺傷細(xì)胞引起隨同宿主抗移植物效應(yīng)一起的宿主抗腫瘤效應(yīng)，而沒(méi)有移植物抗宿主疾病。示例材料PE-綴合的OMOLUBeckman Coulter,Brea,加州購(gòu)買(mǎi)。7_氨基-放線(xiàn)菌素D (7-AAD) (IOOOx)從Cayman Chemical Co.,安阿伯，密歇根州購(gòu)買(mǎi)。PlasmaLyte A從BaxterScientific,迪爾菲爾德,伊利諾斯州購(gòu)買(mǎi)。人血清白蛋白(HAS)從McKesson,舊金山，加州購(gòu)買(mǎi)。FcR結(jié)合抑制劑從eBioscience,圣地亞哥,加州購(gòu)買(mǎi)。Dynabeads ClinExVivo 從Invitrogen,卡爾斯巴德,加州購(gòu)買(mǎi)。在培養(yǎng)物中激活的細(xì)胞(CAC)的制備-⑶4+T-細(xì)胞在從Invitrogen獲得的⑶3/⑶28ClinEx Vivo Dynal珠子的存在下培養(yǎng)9天。(位置)。細(xì)胞在生命細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Baxter)中在37°C和5% CO2下生長(zhǎng)且在培養(yǎng)的3天和6天利用珠子再刺激。在培養(yǎng)物中9天之后，可以除去珠子且這些細(xì)胞被稱(chēng)為CAC。配制品緩沖液 中的細(xì)胞(CFB)的制備-將CAC放置到cRPMI介質(zhì)中用于洗滌。記錄時(shí)間以表示配制方案的開(kāi)始。將cRPMI中的細(xì)胞離心，除去上清液，且細(xì)胞再懸浮在cRPMI緩沖液中。細(xì)胞活力通過(guò)使用臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)而測(cè)定。使用活細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)目和濃度來(lái)確定能存活的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。如果樣品具有大于80%的細(xì)胞活力，那么步驟繼續(xù)進(jìn)行用于再激活和配制細(xì)胞。CAC細(xì)胞以IxlO7個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度再懸浮。再激活以IxlO7個(gè)細(xì)胞/毫升的活細(xì)胞濃度進(jìn)行。根據(jù)體積，再激活在24孔板、6孔板或75cm3燒瓶中進(jìn)行。加入DynabeadsClinExVivo CD3/CD28以再激活細(xì)胞且在36°C至38°C和5% CO2下孵育4小時(shí)。孵育約4小時(shí)之后，然后將細(xì)胞除去且轉(zhuǎn)移到具有最終配制品緩沖液(FFB)的50毫升管。FFB是具有I % HAS的PlasmaLyte A。將再激活的細(xì)胞離心，除去上清液，且再懸浮在FFB中。這些被稱(chēng)為配制品緩沖液中的細(xì)胞(CFB)。將CFB以每毫升IO7個(gè)細(xì)胞的濃度再懸浮在FFB中。將CFB再懸浮用于ID、IT或IV給藥。將I毫升細(xì)胞懸浮液作為ID配制品加入3毫升注射器中。IT和IV配制品分別為3毫升和5毫升。將具有適當(dāng)?shù)呐渲破返淖⑸淦鲀?chǔ)存在具有約4°C的平均溫度的制冷條件下。儲(chǔ)存之后樣品的收獲-在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和上清液。時(shí)間點(diǎn)如下0(初始)；在室溫(RT)下2小時(shí)；在4°C下48小時(shí)；以及在4°C下48小時(shí)，接著是在RT下2小時(shí)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收集100微升細(xì)胞懸浮液且將細(xì)胞以400g在4°C下旋轉(zhuǎn)5min。然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一管用于隨后使用ELISA檢測(cè)IFN- Y。將細(xì)胞再懸浮在150微升染色緩沖液中用于流式細(xì)胞術(shù)。在一些實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞再懸浮在100微升cRPMI介質(zhì)中且在培養(yǎng)箱中在37 °C下用5% CO2培養(yǎng)24h。24h孵育之后取出上清液且通過(guò)ELISA檢測(cè)IFN-Y。流式 細(xì)胞術(shù)(⑶40L和7-AAD)-將來(lái)自上面(150微升)的50微升細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到3個(gè)微量離心管中，分別以未染色的、CD40L和7-AAD標(biāo)記。將未染色的管在冰上孵育20min。對(duì)于CD40L管，將細(xì)胞用FcR結(jié)合抑制劑根據(jù)制造廠(chǎng)家的說(shuō)明書(shū)在冰上預(yù)孵育20分鐘。然后將40微升染色緩沖液(PBS+1 % FBS)和10微升PE-⑶40L抗體加入細(xì)胞懸浮液中且在冰上在黑暗中孵育另外20min。通過(guò)7-AAD的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試細(xì)胞活力。7-AAD插入死亡或受損的細(xì)胞的DNA中，因而陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定是細(xì)胞活力的指示物。對(duì)于7-AAD管，將該管以400g在6C下離心5min。除去上清液之后，將細(xì)胞沉底再懸浮在100微升Ix7-AAD溶液中。將該管在冰上在黑暗中孵育15min。將Iml的染色緩沖液加入⑶40L管，然后將3個(gè)管一起離心。丟棄上清液之后，將細(xì)胞沉淀再懸浮在O. 4毫升染色緩沖液中且使FACS進(jìn)行。示例1-⑶4+細(xì)胞的純化和細(xì)胞表型。獲得正常供體外周血且來(lái)自血沉棕黃層的⑶4+細(xì)胞使用從Mitenyi Biotec (奧本，加州)獲得的磁性珠子和柱子純化。圖1是側(cè)向散射(細(xì)胞的測(cè)量尺寸和密度)對(duì)CD4的流式細(xì)胞儀圖。圖1說(shuō)明CD4+細(xì)胞為總種群的約46% (N = 22)。對(duì)于CD4+細(xì)胞正向選擇之后，結(jié)果是98. 69%純CD4+細(xì)胞(N = 22)。如可以從圖1B看到的，過(guò)柱之后CD4+的種群含有淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。因?yàn)槊颗鷱牟煌w生產(chǎn)，在生產(chǎn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)測(cè)試抗原標(biāo)記。測(cè)試⑶4+細(xì)胞(圖2A)對(duì)在培養(yǎng)物中激活的細(xì)胞(CAC)(圖2B)的細(xì)胞表型。結(jié)果說(shuō)明從幼稚CD4+表型(⑶45RA+)到記憶表型(⑶45R0+)的非常一致的變化。圖2A示出⑶4+細(xì)胞分別對(duì)于CD45RA、CD45R0和CD25的表型。圖2B示出為了分別表面表達(dá)CD45RA、CD45R0和CD25進(jìn)行9天培養(yǎng)和分析之后CAC的表型。從混合CD45RA/CD45R0種群，獲得CD45RA陰性CD45R0陽(yáng)性種群。在擴(kuò)增過(guò)程開(kāi)始時(shí)⑶25+細(xì)胞為大約10%。在9天時(shí)，⑶25+為大約85%。這與細(xì)胞的激活狀態(tài)一致。圖2A示出柱之后的⑶4+細(xì)胞顯示出⑶45RA+細(xì)胞(平均值=44. 76% η = 29), CD45R0+ (平均值=53. 44% η = 29)和 CD25+ (平均值=10. 83% η =29)的幼稚表型。圖2Β說(shuō)明在培養(yǎng)物中連續(xù)刺激9天之后，表型變化為T(mén)h記憶樣細(xì)胞。CD45RA激烈下降(平均值=4. 22% η = 29)，CD45R0+上升到97. 8的平均值(η = 29)，且⑶25+也上升到90. 03%的平均值(η = 29)。⑶62L表達(dá)譜-圖3說(shuō)明在O天，⑶4+種子細(xì)胞表現(xiàn)出具有在大約IO3處的最大峰的雙峰⑶62L平均熒光強(qiáng)度(MFI)(平均算術(shù)平均值為541η = 17)。MFI在9天之后在培養(yǎng)物中增加至1541的平均算術(shù)平均值(CAC)，然后在最后4小時(shí)激活之后變得顯著更低(190. 3的平均算術(shù)平均值)(CFB)。⑶40L表達(dá)譜一⑶40L在CAC上表達(dá)的密度在利用⑶3/⑶28珠子激活4小時(shí)之后在CAC的表面上不斷增加。圖4示出比較在O天的⑶4+(圖4Α)、最后激活之前9天收獲的CAC (圖4Β)以及4小時(shí)激活之后、CFB (圖4C)的代表性批的⑶40L表達(dá)的算術(shù)平均值和百分?jǐn)?shù)的變化。如可以看到的，未激活的細(xì)胞與激活的細(xì)胞之間的差異在CD40L+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)方面不大，而在算術(shù)平均值方面較大(對(duì)于CAC平均值A(chǔ)M為20 (η = 29)而對(duì)于CFB平均值為 112 (η = 29)。
在最后激活過(guò)程中細(xì)胞因子的分泌-將來(lái)自每個(gè)生產(chǎn)批的9天收獲的樣品利用CD3/CD28珠子激活4小時(shí)，且將上清液收集和測(cè)試用于使用ELISA試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞因子生產(chǎn)(IFNy , IL-4，IL-8，TNFa和GM-CSF)。表I示出這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。表I

權(quán)利要求
1.一種組合物，包括Thl/殺傷細(xì)胞，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞具有Thl特性和溶細(xì)胞活性。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述溶細(xì)胞活性包括NK特性。
3.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞表達(dá)粒酶B和穿孔素。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞表達(dá)IFN-Y。
5.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞實(shí)質(zhì)降低地表達(dá)或不表達(dá)IL-4。
6.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞為CD4+細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的組合物，其中利用針對(duì)CD3和CD28的交聯(lián)劑配制所述Thl/殺傷細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞來(lái)源于正常供體外周血。
9.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包括臨床相關(guān)數(shù)目的所述Thl/殺傷細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述組合物包括至少約IxlO7個(gè)細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述組合物包括至少約IxlO8個(gè)細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞的溶細(xì)胞活性特異性滅活病變細(xì)胞，而不滅活正常細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述病變細(xì)胞包括癌細(xì)胞、受感染細(xì)胞或其組合。
14.一種組合物，包括Thl/殺傷細(xì)胞，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞為⑶4+細(xì)胞，所述⑶4+細(xì)胞具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞系的溶細(xì)胞活性。
15.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞包括Thl特性。
16.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞表達(dá)粒酶B和穿孔素。
17.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞表達(dá)IFN-Y。
18.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述腫瘤細(xì)胞系為ARH77。
19.權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞不滅活正常細(xì)胞。
20.一種用于破壞病變細(xì)胞的方法，包括使所述病變細(xì)胞與包括同種異體Thl/殺傷細(xì)胞的組合物接觸，其中所述病變細(xì)胞與所述Thl/殺傷細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致所述病變細(xì)胞的破壞。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞為CD4+細(xì)胞。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞表達(dá)Thl特性和溶細(xì)胞活性。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞的溶細(xì)胞活性包括表達(dá)粒酶B-穿孔素。
24.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述Thl特性包括表達(dá)IFN-Y。
25.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞不表達(dá)IL-4。
26.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞是通過(guò)利用交聯(lián)的抗-CD3/ 抗-⑶28單克隆抗體激活⑶4+T-細(xì)胞而獲得的。
27.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述病變細(xì)胞包括癌細(xì)胞、受感染細(xì)胞或其組合。
28.—種治療患者的方法,包括給藥包括臨床相關(guān)數(shù)目Thl/殺傷細(xì)胞的組合物。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞為CD4+細(xì)胞。
30.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞表達(dá)Thl特性和溶細(xì)胞活性。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中用連接至抗-⑶3/抗-⑶28單克隆抗體的珠子激活且交聯(lián)所述Thl/殺傷細(xì)胞。
32.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞是從正常供體的外周血獲得的。
33.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述Thl/殺傷細(xì)胞對(duì)于所述患者是同種異體的。
34.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述細(xì)胞的臨床相關(guān)數(shù)目為至少lxlO8。
全文摘要
已經(jīng)產(chǎn)生具有Th1特性和溶細(xì)胞活性的新細(xì)胞類(lèi)型。這些Th1/殺傷細(xì)胞為CD4+細(xì)胞，CD4+細(xì)胞從外周血純化且被操作以具有Th1特性，例如類(lèi)似于細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(CTL)的、結(jié)合溶細(xì)胞活性的產(chǎn)生IFN-γ的。CTL活性以病變細(xì)胞為目標(biāo)，而不以正常細(xì)胞為目標(biāo)。Th1/殺傷細(xì)胞的溶細(xì)胞活性通過(guò)粒酶B-穿孔素機(jī)制介導(dǎo)且導(dǎo)致病變細(xì)胞的凋亡性死亡。生產(chǎn)和使用這些Th1/殺傷細(xì)胞的方法包括從外周血分離出CD4+細(xì)胞，激活CD4+T-細(xì)胞以形成Th1/殺傷細(xì)胞，以及向患者給藥具有溶細(xì)胞活性的Th1/殺傷細(xì)胞，其中Th1/殺傷細(xì)胞對(duì)于該患者是同種異體的。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK103068973SQ201180040232
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者邁克爾·哈-諾伊 申請(qǐng)人:免疫創(chuàng)新治療有限公司