專利名稱：一種檢測(cè)豬痢疾的pcr試劑盒及引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬痢疾的PCR試劑盒及引物，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬痢疾(Swine dysentery ；SD)的病原體是一種革蘭氏陰性的厭氧性螺旋體， 先后命名為是由豬痢疾密螺旋體(Treponema hyodysen teriae ； Τ. h )、豬痢疾蛇形螺旋體 QSerpulinahyodysen teriae ; S. h )?，F(xiàn)在統(tǒng)一命名為豬痢疾短螺旋體 iBrachyspira hyodysen teriae ；B. h),目前豬痢疾密螺旋體這一名稱由于歷史的原因還被廣泛使用。該病是豬的一種腸道傳染病，以黏液性或黏液出血性腹瀉為特征。在豬群中的發(fā)病率相當(dāng)高，病豬生長(zhǎng)發(fā)育受阻，耗料增加，給各地養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)病豬的飼料消耗率為正常豬的2倍，而增重率僅為正常豬的1/2。根據(jù)1983年Lyson的統(tǒng)計(jì)，為控制豬痢疾在飼料中添加的藥物，每頭豬花費(fèi)2. 5-2. 8美元。根據(jù)Wood等(1988)的計(jì)算，豬痢疾豬群的飼料消耗，每頭上市豬要多花12. 6美元，同時(shí)每頭豬還要多花費(fèi)2. 4美元。在美國(guó)估計(jì)每年由于豬痢疾而損失6400萬(wàn)美元。該病遍布五大洲50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。在我國(guó)，許多省、市都有該病的存在，并且一旦傳入豬群，若不采取嚴(yán)格的處理措施很難根除。1978年10月，上?？诎对趶拿绹?guó)進(jìn)口的451頭商品豬的檢疫中確診豬痢疾后， 1979年初又在我國(guó)豬只中確診豬痢疾，并從國(guó)內(nèi)豬只分離得到豬痢疾短螺旋體純培養(yǎng)，引起我國(guó)獸醫(yī)界的重視，并被列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境一、二類傳染病》。在進(jìn)出口的雙邊協(xié)議中美國(guó)、英國(guó)、澳大利亞、新西蘭、荷蘭、丹麥、愛(ài)爾蘭、及日本等國(guó)的進(jìn)口豬要求進(jìn)行豬痢疾短螺旋體的檢測(cè)?，F(xiàn)有檢測(cè)條件要求高(嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng))， 一般實(shí)驗(yàn)室很難滿足檢測(cè)的要求。到目前為止，該病還沒(méi)有滿意的簡(jiǎn)單可行的檢測(cè)方法。在入境檢測(cè)中采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1207-2003《豬痢疾短螺旋體分離培養(yǎng)操作規(guī)程》，檢驗(yàn)周期要兩周時(shí)間，并且要求嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)監(jiān)控，因此急需一種快速、敏感、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法以替代或者補(bǔ)充該規(guī)程。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(英文全稱Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱PCR，PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA，RNA的地方。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱PCR)又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì) 1.特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為 ①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對(duì)原則；
③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
④靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更尚。2.靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10_12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(μ g=i0_6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中， PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。3.簡(jiǎn)便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2 4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。本發(fā)明在我國(guó)首次將PCR技術(shù)應(yīng)用于豬痢疾檢測(cè)，提供了針對(duì)豬痢疾短/密螺旋體特異性引物序列、試劑盒和檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的病原分離方法相比具有快速、高效、簡(jiǎn)捷的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一組作為引物使用的、檢測(cè)豬痢疾的寡核苷酸序列。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異、靈敏、高效的檢測(cè)豬痢疾的試劑盒。為解決第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一組檢測(cè)豬痢疾的引物，為序列表SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的寡核苷酸序列，詳見(jiàn)表1。表1.引物序列
權(quán)利要求
1.一組檢測(cè)豬痢疾的引物，其特征在于，該引物序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :2所示，其中SEQ ID NO :1為檢測(cè)豬痢疾的引物I，SEQ ID NO :2為檢測(cè)豬痢疾的引物 II。
2.一種檢測(cè)豬痢疾的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成(1)DNA提取液I其配制方法為PEG 8000 20.74g，加NaCl 17.53 g，用三蒸水定容至 IOOmL ；(2)DNA 提取液 II 其配制方法為 1.0 mol/L Tris-Cl 2. OmL, 2. 0 mol/L KCl 5. OmL, 0. 5 mol/L EDTA 0. 5mL, NP-40 1. 0 mL,用三蒸水定容至 IOOmL ；(3)PCR反應(yīng)液，包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、引物I、引物II ；其中，引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 2所示；(4)Taq DNA 聚合酶；(5)無(wú)DNA酶的滅菌純化水；(6)陰性對(duì)照=DEPC水；(7)陽(yáng)性對(duì)照為豬痢疾短/密螺旋體tlyA基因片段，所述tlyA基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)豬痢疾的試劑盒，其特征在于所述PCR反應(yīng)液為 IXPCR 緩沖液、3. OmM MgCl2、0. 2mM dNTP、0. 4 μ M 引物 I、0. 4 μ M 引物 II。
4.一種檢測(cè)豬痢疾的PCR方法，其特征在于，包括如下步驟(1)提取樣品DNA；(2)對(duì)提取的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)反應(yīng)條件第一步92°C 3 min, 1個(gè)循環(huán)；第二步 92°C 10 sec, 46°C 30 sec, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)； 第三步 72 °C 7min ；第四步4°C 保存；(4)結(jié)果描述及判定①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照在470bp處有特異性擴(kuò)增條帶； 陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增條帶；②結(jié)果判斷陽(yáng)性在470bp處有特異性擴(kuò)增條帶； 陰性無(wú)特異性擴(kuò)增條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)豬痢疾的PCR試劑盒及引物。一組檢測(cè)豬痢疾的引物，為序列表SEQIDNo1和序列表SEQIDNo2所示的寡核苷酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是將PCR技術(shù)應(yīng)用于豬痢疾的檢測(cè)中與病原分離培養(yǎng)相比，1、PCR更快、更便捷，細(xì)菌分離培養(yǎng)方法至少需要10天且培養(yǎng)條件苛刻，需要嚴(yán)格的厭氧培養(yǎng)，而PCR僅需5小時(shí)左右就能完成；2、與病原分離相比PCR需要的設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，從技術(shù)層面上講更便于掌握和操作，更便于在條件不足的地區(qū)推廣應(yīng)用，更有利于對(duì)豬痢疾的診斷和監(jiān)控。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102373277SQ20111033068
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者喬彩霞, 凌鳳俊, 吳丹, 安健, 張偉, 張利峰, 張鶴曉, 李寧, 柏亞鐸, 汪琳, 蒲靜, 谷強(qiáng), 賴平安, 高志強(qiáng) 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局, 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 北京農(nóng)學(xué)院