專利名稱：小麥背景中長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，根據(jù)植物重復(fù)序列信息設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從小麥_長穗偃麥草附加系中擴(kuò)增得到長穗偃麥草的特異片段并進(jìn)行測序，依據(jù)測序結(jié)果重新設(shè)計(jì)引物而獲得長穗偃麥草染色體特異的分子標(biāo)記。這些標(biāo)記可用于長穗偃麥草向小麥轉(zhuǎn)移染色體片段過程中的易位系鑒定，可用于小麥抗赤霉病和抗逆基因的連鎖分析，可用于小麥抗赤霉病和抗逆性育種中的分子標(biāo)記輔助選擇。
背景技術(shù)：
(1)小麥育種目標(biāo)和其野生近緣種小麥?zhǔn)鞘澜缈偖a(chǎn)量僅次于玉米的第二糧食作物。近半個(gè)世紀(jì)來，世界小麥的總產(chǎn)量已經(jīng)增加了兩倍多，其中，優(yōu)良的小麥品種對(duì)提高小麥產(chǎn)量發(fā)揮了決定性的作用。目前小麥育種研究主要集中在四個(gè)方面第一、提高小麥產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本；第二、分子標(biāo)記輔助育種；第三、小麥抗逆性育種；第四、小麥營養(yǎng)品質(zhì)。為完成以上育種目標(biāo)，小麥本身的遺傳資源已經(jīng)明顯不夠，而與小麥具有近緣關(guān)系的許多野生物種中卻存在著大量小麥中所沒有的有利遺傳資源。因此，利用小麥近緣野生種中的優(yōu)良基因資源培育小麥新品種已經(jīng)成為小麥育種的目標(biāo)之一。小麥(AABBDD，2n = 42)是異源六倍體植物，屬于禾本科小麥屬普通小麥種 (Triticum aestivum L.)，自然界中生長許多小麥的野生近緣物種，這些野生近緣種植物中蘊(yùn)含著大量優(yōu)良基因，是一個(gè)巨大的具有潛在利用價(jià)值的遺傳基因庫，該基因庫的優(yōu)良基因如得到利用，對(duì)小麥遺傳改良將具有重要的價(jià)值，不僅能提高其產(chǎn)量、改良品質(zhì)，更能將豐富的抗病，抗逆基因轉(zhuǎn)入小麥，改良小麥的抗病和抗逆性。目前已經(jīng)與小麥進(jìn)行雜交的種屬有黑麥屬、簇毛麥屬、偃麥草屬、山羊草屬、大麥屬等。這些遠(yuǎn)緣雜交的成功為近緣野生種的抗旱、耐鹽堿以及抗病蟲害的優(yōu)良基因向小麥基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)移奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，使得從小麥近緣種屬中尋找或開拓新的重要基因資源成為可能。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記與作物育種相結(jié)合，它不僅彌補(bǔ)了作物育種中傳統(tǒng)的選擇準(zhǔn)確率低的缺點(diǎn)，而且加快了育種進(jìn)程。(2)小麥赤霉病抗性和長穗偃麥草特異分子標(biāo)記小麥生產(chǎn)中倍受關(guān)注的病害為小麥赤霉病，它是全球性致使小麥產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降的小麥主要病害，也是影響中國小麥生產(chǎn)的主要病害。該病由多種鐮刀菌引起，病原菌侵染小麥籽粒后產(chǎn)生多種真菌毒素，這些毒素對(duì)人畜有害，嚴(yán)重威脅著人類和家畜的健康。 我國長江中下游冬麥區(qū)是小麥赤霉病的多發(fā)區(qū)和重災(zāi)區(qū)，近年來黃淮麥區(qū)和關(guān)中麥區(qū)小麥赤霉病發(fā)生也日趨嚴(yán)重，影響著國內(nèi)小麥主產(chǎn)區(qū)的糧食安全。多年的小麥抗赤霉病育種研究表明，小麥種內(nèi)抗赤霉病的資源很少，而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗性資源在小麥育種實(shí)際中也難以有效利用。從小麥近緣物種中開拓新的赤霉病抗源是小麥抗赤霉病育種中的重要策略，并且進(jìn)行了大量的相關(guān)研究。偃麥草屬(Thinopyrum) 是禾本科大麥族(Horseae)，小麥亞族(Triticeae)中的多年生草本植物，與普通小麥的親
3緣關(guān)系較近，世界范圍內(nèi)約有50種，主要分布在溫帶和寒帶地區(qū)。該屬適應(yīng)性和繁殖能力較強(qiáng)，并且具有許多優(yōu)良基因和性狀，如抗病、抗寒、抗旱、耐鹽堿和穗大多花等，是小麥遺傳改良中極具應(yīng)用價(jià)值的小麥近緣物種之一。自然界中存在3種類型的長穗偃麥草，即二倍體長穗偃麥草(Th. elongatum，2n = 14)、四倍體長穗偃麥草(Th. elongatum，2n = 28)和十倍體長穗偃麥草(Th. ponticum,2n = 70)。二倍體長穗偃麥草具有E染色體組，E染色體組是偃麥草屬多倍體物種的基本染色體組，許多抗病基因如抗大麥黃矮病基因和抗小麥銹病基因等都在偃麥草屬的E染色體組中存在。對(duì)小麥_長穗偃麥草二體附加系接種小麥赤霉病菌后發(fā)現(xiàn)，在長穗偃麥草IE上攜帶控制赤霉病抗性的主效基因，同時(shí)在3E、4E及6E 染色體上可能存在微效抗性基因。Jauhar等報(bào)道長穗偃麥草IE染色體跟赤霉病的抗性有關(guān)，并且已經(jīng)建立了 IE的特異染色體標(biāo)記，可以用來篩選抗病雜交種。Somers等報(bào)道長穗偃麥草的7E染色體帶有赤霉病抗性基因。多個(gè)研究也認(rèn)為7E染色體具有抗赤霉病基因并將該抗性基因初步定位于7E染色體長臂上。對(duì)于赤霉病抗性的鑒定，研究者使用的方法和表示參數(shù)各不相同，而且抗性鑒定結(jié)果受環(huán)境條件的影響比較大，建立穩(wěn)定可靠的赤霉病接種方法和鑒定標(biāo)準(zhǔn)是評(píng)價(jià)品種抗病性最關(guān)鍵的問題。為了使抗性鑒定更加準(zhǔn)確，研究者將目標(biāo)轉(zhuǎn)移到分子標(biāo)記。分子標(biāo)記輔助選擇(Marker Assisted Selection,MAS)是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物品種改良過程中進(jìn)行選擇的一種輔助手段(Ribaut et al，1998)。其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或表現(xiàn)共分離的分子標(biāo)記對(duì)選擇個(gè)體進(jìn)行目標(biāo)以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個(gè)體，達(dá)到提高育種效率的目的。在不同植物中利用不同的方法發(fā)展分子標(biāo)記是分子標(biāo)記輔助選擇和傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行作物遺傳改良的重要研究內(nèi)容。赤霉病抗性比較復(fù)雜，人工鑒定結(jié)果受環(huán)境的影響較大，因此利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇將是有效途徑。在長穗偃麥草向小麥轉(zhuǎn)移優(yōu)良的抗赤霉病基因的研究中，已有部分研究進(jìn)行了長穗偃麥草染色體特異分子標(biāo)記研究。到目前為止，通過RAPD，AFLP, SSR等分子標(biāo)記發(fā)展技術(shù)獲得了部分染色體特異標(biāo)記，但發(fā)展的長穗偃麥草染色體特異分子標(biāo)記不但數(shù)量少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了小麥抗性育種實(shí)際的需要，而且染色體特異性及穩(wěn)定性還不理想，發(fā)展更多的覆蓋相關(guān)染色體的分子標(biāo)記，進(jìn)一步研究這些分子標(biāo)記與抗病，抗逆基因的連鎖關(guān)系，在小麥抗逆、抗病育種實(shí)際中利用這些標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇是非常重要和迫切需要的。(3)長穗偃麥草染色體特異分子標(biāo)記的發(fā)展植物基因組存在大量的簡單重復(fù)序列(Simple Sequence R印eat，SSR)，也稱微衛(wèi)星DNA，是一類由1-6個(gè)堿基組成的基序(motif)串聯(lián)重復(fù)序列，其中最常見是雙核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)，如(CA)n, (AT)n, (TG)n, (GGC)n, (GAT)n等。每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目一般為10-60，它們廣泛分布于絕大多數(shù)真核生物基因組中，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)重復(fù)數(shù)目的不同。微衛(wèi)星序列兩側(cè)一般是相對(duì)保守的單拷貝序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，由于核心序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠擴(kuò)增出不同長度的PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定多態(tài)性。而采用SSR技術(shù)發(fā)展分子標(biāo)記的前提條件是必須知道重復(fù)序列兩端的DNA序列的信息，如不能直接從DNA數(shù)據(jù)庫查尋則首先必須對(duì)其進(jìn)行測序。因此，傳統(tǒng)的SSR分子標(biāo)記開發(fā)方法工作量大，需花費(fèi)大量人力、物力，而且效率較低。由于沒有長穗偃麥草基因
4組序列，使得在長穗偃麥草中發(fā)展SSR標(biāo)記難以進(jìn)行。f^mj^PjlKll] (inter-simple sequence repeat, ISSR) ^ Zietkeiwitcz ^ 于1994年提出的一種以微衛(wèi)星為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，它檢測的是兩個(gè)SSR之間的一段短DNA 序列上的多態(tài)性。由于SSR序列廣泛分布于高等生物的基因組中，所以ISSR具有很強(qiáng)的多態(tài)性。ISSR引物的開發(fā)不需要獲得SSR兩側(cè)的單拷貝序列，開發(fā)費(fèi)用降低，而且ISSR引物可以在不同的物種間通用，揭示的多態(tài)性較高，檢測非常方便，是一種非常有發(fā)展前途的分子標(biāo)記。目前，ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于多種植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性等研究中，但在長穗偃麥草中沒有進(jìn)行研究。植物基因組中還存在可以移到的DNA片段，即轉(zhuǎn)座子。其中以RNA為媒介反轉(zhuǎn)錄為DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)座的成分為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是目前植物基因組中所知的數(shù)量最大的一類可移動(dòng)成分(Grandbastien et al，1998)。由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因組中的復(fù)制與轉(zhuǎn)座造成基因組的多樣性，使植物的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子很容易作為一種分子標(biāo)記應(yīng)用于遺傳變異的研究中。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)間多態(tài)性的分子標(biāo)記(inter-retrotransposon amplified polymorphism, I RAP)的原理是根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中LTR的保守序列設(shè)計(jì)引物，這些引物在 PCR過程中可以與LTR序列退火，從而擴(kuò)增出相鄰的同一家族的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子成員間的片段。也可以根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶基因的相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。目前，IRAP分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于大麥、柑橘、網(wǎng)茅、馬鈴薯等植物的遺傳研究中。該技術(shù)在長穗偃麥草中沒有進(jìn)行研究。Jx. ^ it Jl M Γ ±1 ^ (retrotransposon microsatellite amplified polymorphism, REMAP)也是一種基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的標(biāo)記技術(shù)。REMAP技術(shù)原理是根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LTR保守序列和微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，然后進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與鄰近的微衛(wèi)星間的片段，從而檢測出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與鄰近簡單重復(fù)序列之間的多態(tài)性。該技術(shù)在長穗偃麥草中也沒有進(jìn)行研究。利用特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆回收擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測序來發(fā)展分子標(biāo)記，其中方法之一是根據(jù)序列結(jié)果，將這些擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)換為序列特異性擴(kuò)增區(qū)標(biāo)記 (Sequence-characterized Amplified Region, SCAR)。SCAR 標(biāo)記對(duì)待檢 DNA 間的差異可直接通過有無擴(kuò)增產(chǎn)物來顯示，一般表現(xiàn)為擴(kuò)增片段的有無，為顯性標(biāo)記。SCAR標(biāo)記方便， 不需要酶切、連接、PAGE電泳、銀染顯色、放射顯影等過程，只需簡單的PCR和瓊脂糖凝膠電泳就可以快速檢測大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。本發(fā)明利用ISSR/IRAP/REMAP技術(shù)，獲得長穗偃麥草染色體特異的DNA片段，并將其轉(zhuǎn)化成染色體特異SCAR標(biāo)記。利用這些長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記不但可以檢測小麥背景中的長穗偃麥草染色質(zhì)，為小麥育種中外源染色質(zhì)的快速便捷檢測提供新途徑，而且可以用于長穗偃麥草抗赤霉病基因的連鎖定位，為抗赤霉病基因的克隆和小麥抗赤霉病育種的分子標(biāo)記輔助選擇提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明所用ISSR/IRAP/REMAP技術(shù)在沒有序列信息的長穗偃麥草中發(fā)展分子標(biāo)記比其他的分子標(biāo)記技術(shù)的效率高，可以用于沒有序列信息的植物中發(fā)展分子標(biāo)記
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的保守序列和簡單重復(fù)序列，利用ISSR/IRAP/REMAP技術(shù)，合成11條引物共組成35個(gè)引物組合對(duì)普通小麥中國春、長穗偃麥草和中國春-長穗偃麥草二體附加系材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選具有染色體特異片段擴(kuò)增的引物組合，共篩選出8 個(gè)組合可擴(kuò)增染色體特異片段，分布于長穗偃麥草除2E外的1E、3E、4E、5E、6E、7E染色體。本發(fā)明將這些特異片段進(jìn)行克隆和測序，測序結(jié)果在NCBI GenBank中與小麥基因組進(jìn)行同源比對(duì)。對(duì)非小麥同源序列的片段設(shè)計(jì)PCR引物，分別對(duì)普通小麥中國春、 長穗偃麥草、中國春-長穗偃麥草二體附加系和相應(yīng)代換系進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增，其中編號(hào)為 Z34-1E·、Z29-3E674、Z8_4E374、Z2_5E3(i4、Z17_6E199 和 Z31_7E215 Z21_7E329，Z12-7E105 的擴(kuò)增片段只出現(xiàn)在長穗偃麥草、中國春-長穗偃麥草相對(duì)應(yīng)染色體的二體附加系及代換系，大小與理論值相一致，表明位于IE染色體(Z34-1E200)、3E染色體(Z29-3E674)、4E染色體(Z8-4E374)、5E 染色體(Z2-5E304)、6E 染色體(Z17_6E199)以及 7E 染色體(Z31_7E215， Z21-7E329，Z12-7E105)上的6個(gè)E染色體特異的片段能夠被轉(zhuǎn)換為相對(duì)應(yīng)染色體的特異SCAR 標(biāo)記。本發(fā)明利用標(biāo)記Z31-7E215進(jìn)一步擴(kuò)增7ES和7EL的端體附加系，又能將這個(gè)標(biāo)記進(jìn)一步定位到7E染色體臂。結(jié)果顯示引物Z31-7E215只在7EL端體附加系中擴(kuò)增出條帶， 即7E染色體長臂特異的SCAR標(biāo)記。本發(fā)明所述一種長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記，它是下列8對(duì)引物之一第1 對(duì)L5' -GATGTCACCAAGCCCTAC-3，(SEQ ID NO. 12)R 5' -TCCTACGAAACACCCAAG-3，(SEQ ID NO. 13)；第2 對(duì)L5' -TCGCTCGCCCACTAC-3，(SEQ ID NO. 14)R 5' -GGTTCGGCCCATGTCTAT-3，(SEQ ID NO. 15)；第3 對(duì)L5' -TGTTGCCAGTGGAGGAAG-3，(SEQ ID NO. 16)R5' -TTGAACTACTGAACCGAAT-3，(SEQ ID N0. 17)；第4 對(duì)L :5’ -ACAGTGAGCCCGAAGGAA-3，(SEQID N0. 18)R :5，-AACACCAGCGGACAAAGC-3，(SEQID N0. 19)；第5 對(duì)L:5’ -ATTGCTCTTAGGGCATAT-3，(SEQID N0. 20)R :5’ -CTCTGTCTCGGTTGTTTC-3，(SEQID N0. 21)；第6 對(duì)L:5’ -TGTCAACTCACGCCTACT-3，(SEQID N0. 22)R :5，-CCCTGGGAATCTAATGTG-3，(SEQID N0. 23)；第7 對(duì)L5' -GGTAACACCTAGATGGCACT-3，(SEQ ID N0. 24；R 5' -GGCACCCTAAACCCTAAT-3，(SEQ ID N0. 25)；第8 對(duì)
L 5' -TCCTTCAACTGCATTCCCTA-3，(SEQ ID NO. 26)R 5' -ATTGCTCGATTTCGGTGT-3，(SEQ ID NO. 27) 本發(fā)明還公開了上述長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記在小麥抗赤霉病和抗逆性育種中的應(yīng)用。本發(fā)明所獲染色體特異標(biāo)記可跟蹤長穗偃麥草的染色體或染色質(zhì)，可用于抗赤霉病基因的連鎖分析，可用于分子標(biāo)記輔助選擇，提高小麥抗赤霉病和抗逆性育種的效率。本發(fā)明利用中國春-長穗偃麥草7E代換系(DS7E/7A)與普通小麥品種揚(yáng)麥16 分別進(jìn)行正交和反交，然后以Fl代自交獲得F2代。選擇了 7E染色體上的一個(gè)分子標(biāo)記 Z31-7E215對(duì)雜交Fl代、F2代、中國春、長穗偃麥草等材料進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明雜交Fl代無論是正交還是反交都能擴(kuò)增出特異條帶，而在F2代中，部分單株有擴(kuò)增條帶結(jié)果，部分單株沒有，符合預(yù)期的孟德爾遺傳的3 1分離。此結(jié)果表明所獲長穗偃麥草特異染色體 SCAR標(biāo)記在世代間的表現(xiàn)也是穩(wěn)定的，可利用這些分子標(biāo)記對(duì)長穗偃麥草染色體或染色體片段在世代間進(jìn)行跟蹤檢測，為小麥染色體工程中外源偃麥草染色質(zhì)的檢測提供了便捷的分子標(biāo)記。本發(fā)明的分子標(biāo)記重復(fù)性好，擴(kuò)增穩(wěn)定，操作簡便，成本低廉，不僅在不同材料中表現(xiàn)出優(yōu)越的穩(wěn)定性，在不同世代間也表現(xiàn)出良好的性能，為分子標(biāo)記輔助育種提供了優(yōu)良的標(biāo)記資源。1.本發(fā)明利用ISSR/IRAP/REMAP技術(shù)，獲得長穗偃麥草染色體特異的分子標(biāo)記。2本發(fā)明所獲長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記在不同材料和不同世代間表現(xiàn)穩(wěn)定，可用于小麥背景中長穗偃麥草染色質(zhì)的鑒定，可用于抗性基因的連鎖分析，也可作為特異分子標(biāo)記用于小麥抗赤霉病育種中進(jìn)行輔助選擇。


圖1 小麥背景中PCR擴(kuò)增的長穗偃麥草特異片段聚丙烯酰胺凝膠的原始圖。箭頭所示為擴(kuò)增的4E染色體片段；1-7 附加系(DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E、DA7E) ；8 中國春小麥；9 長穗偃麥草(2X)。圖2 小麥背景中PCR擴(kuò)增的長穗偃麥草各引物組合擴(kuò)增的E染色體特異片段。各引物組合擴(kuò)增的E染色體特異片段1 =IE特異片段、3 :3E特異片段、4 :4E特異片段、5 :5E特異片段、6 :6E特異片段、 7:7E特異片段；1-7 附加系(DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E、DA7E) ；8 中國春小麥；9 長穗偃麥草(2X)。圖3 長穗偃麥草聚丙烯酰胺凝膠上染色體4E的特異片段。IE =IE附加系，2E :2E附加系，3E :3E附加系，4E :4E附加系，5E :5E附加系，6E :6E 附加系，7E :7E附加系，CS 中國春，EE 長穗偃麥草圖4 長穗偃麥草特異擴(kuò)增片段的回收及菌落PCR1-10 :4E特異片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌后菌落PCR結(jié)果M :DL2000標(biāo)記.圖5 長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記M :DL2000 標(biāo)記；1-7 附加系(DA1E, DA2E, DA3E, DA4E, DA5E, DA6E, DA7E) ；8-14 代換系(DS1E/1D，DS2E/2D, DS3E/3D, DS4E/4D, DS5E/5D, DS6E/6D, DS7E/7D) ；15 中國春小麥；16 長穗偃麥草；17-18 :7E端體附加系(DA7ES，DA7EL)圖6 長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記正交檢測穩(wěn)定性M :DL2000標(biāo)記1 二倍體長穗偃麥草；2 中國春小麥；3 :DS7E/7DX揚(yáng)麥16F1 ； 4-42 :DS7E/7DX 揚(yáng)麥 16F2 單株圖7 長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記反交檢測穩(wěn)定性M :DL2000標(biāo)記1 二倍體長穗偃麥草；2 中國春小麥；3 :DS7E/7DX揚(yáng)麥16F1 ； 4-42 :DS7E/7DX 揚(yáng)麥 16F2 單株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1植物材料和PCR弓丨物序列(1)植物材料本發(fā)明所用材料包括7份中國春小麥-長穗偃麥草二體附加系(Triticum aestivum cv. Chinese Spring-Thinopyrum elongatum disomic additional lines,DA1E, DA2E，DA3E，DA4E，DA5E，DA6E，DA7E，)、2份中國春小麥-長穗偃麥草7E長臂和7E短臂附加系(DA7ES，DA7EL)，19份中國春小麥-長穗偃麥草二體代換系(Triticum aestivum cv. Chinese Spring-Thinopyrum elongatum disomic substitutional lines,如DS1E/1A, DS2E/2A, DS3E/3A 至 DS3E/19A、1 份小麥中國春(Triticum aestivum)和 1 份二倍體長穗偃麥草。以上材料由加拿大農(nóng)業(yè)部的Dr. Fedax惠贈(zèng)并保存在揚(yáng)州大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院分子細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室。(2) PCR擴(kuò)增引物根據(jù)大麥(Hordeumvulgare)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 BARE-1 (Accessing Number Z17327) 從309bp-2137bp的LTR序列設(shè)計(jì)2條引物，yr_l和yr_2 ；根據(jù)文獻(xiàn)合成7條引物，yr_3、 yr-4、yr-5、s-l、s-2、s-3和s_4 ；根據(jù)水稻反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RIRE-I的反轉(zhuǎn)錄酶中心序列設(shè)計(jì)引物2條引物，PLl和PRl。yr-l、yr-2、yr-3、yr-4、yr-5、PLl和PRl為依據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子設(shè)計(jì)的引物，S-U s-2、s-3和s-4為微衛(wèi)星引物。利用11條基礎(chǔ)引物組合了 35個(gè)引物組合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇出8個(gè)具有長穗偃麥草特異擴(kuò)增的引物組合，這些引物組合分別屬于ISSR/IRAP/REMAP 3類分子標(biāo)記?；A(chǔ)引物的序列和具有長穗偃麥草特異片段擴(kuò)增的引物組合分別見表1和表2。上述引物保存在揚(yáng)州大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院分子細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室。表111條基礎(chǔ)引物的序列
權(quán)利要求
1.一種長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記，它是下列8對(duì)引物之一 第1對(duì)L: 5，- GATGTCACCAAGCCCTAC -3，(SEQ ID NO. 12) R: 5，- TCCTACGAAACACCCAAG -3，(SEQ ID NO. 13)； 第2對(duì)L: 5，-TCGCTCGCCCACTAC-3，(SEQ ID NO. 14) R: 5，-GGTTCGGCCCATGTCTAT-3，(SEQ ID NO. 15)； 第3對(duì)L: 5，- TGTTGCCAGTGGAGGAAG -3，(SEQ ID NO. 16) R: 5，- TTGAACTACTGAACCGAAT -3，(SEQ ID NO. 17)；第4對(duì)L: 5，-ACAGTGAGCCCGAAGGAA-3，(SEQ ID NO. 18) R: 5，-AACACCAGCGGACAAAGC-3，(SEQ ID NO. 19)； 第5對(duì)L: 5，- ATTGCTCTTAGGGCATAT -3，(SEQ ID NO. 20) R: 5，- CTCTGTCTCGGTTGTTTC -3，(SEQ ID NO. 21)； 第6對(duì)L:5，-TGTCAACTCACGCCTACT-3，(SEQ ID NO. 22) R:5，-CCCTGGGAATCTAATGTG-3，(SEQ ID NO. 23)； 第7對(duì)L:5，-GGTAACACCTAGATGGCACT-3，(SEQ ID NO. 24) R: 5，-GGCACCCTAAACCCTAAT-3，(SEQ ID NO. 25)； 第8對(duì)L: 5，-TCCTTCAACTGCATTCCCTA-3，(SEQ ID NO. 26) R: 5，-ATTGCTCGATTTCGGTGT-3，(SEQ ID NO. 27)。
2.權(quán)利要求1所述長穗偃麥草染色體特異標(biāo)記在小麥抗赤霉病和抗逆性育種中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體為根據(jù)植物重復(fù)序列信息設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從小麥-長穗偃麥草附加系中擴(kuò)增得到長穗偃麥草的特異DNA片段并進(jìn)行測序，依據(jù)與小麥無同源性的序列重新設(shè)計(jì)引物而獲得長穗偃麥草染色體特異的分子標(biāo)記。所說的分子標(biāo)記是本發(fā)明提出的8對(duì)引物之一。這些標(biāo)記可用于長穗偃麥草向小麥轉(zhuǎn)移染色體片段過程中的易位系鑒定，可用于抗赤霉病基因的連鎖分析，可作為特異分子標(biāo)記鑒定長穗偃麥草染色質(zhì)而用于小麥抗赤霉病和抗逆性育種中。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102352354SQ201110324880
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者張超, 朱雪, 葛江燕, 陳士強(qiáng), 陳建民, 高勇 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)