專利名稱：用于檢測棉花纖維上攜帶的微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測棉花纖維上攜帶的微生物的方法。
背景技術(shù)：
棉花是我國重要的戰(zhàn)略物質(zhì)，它不僅涉及2-3億棉農(nóng)的切身利益，還關(guān)系到流通領(lǐng)域幾十萬人、紡織工業(yè)1900萬人的就業(yè)問題。但棉花病害是制約棉花生產(chǎn)和品質(zhì)的重要因素，我國常年因病害造成的損失達15% 20%。
引致棉花病害發(fā)生的病原物包括多種真菌、細菌、放線菌等，其中尤以真菌和細菌病原所致病害最重。一般認為棉花種子、病株殘體、棉鈴殼和棉籽餅等可攜帶多種微生物， 是傳播多種棉花病害的主要途徑，而忽略了棉花纖維是否帶菌的問題。
我國每年需進口 600多萬噸原棉以滿足國內(nèi)需求。如果棉花纖維上攜帶病原菌， 一些病原菌將通過原棉進口進入中國，對我國的棉花生產(chǎn)帶來巨大威脅。如棉花枯萎病、黃萎病均是由真菌弓丨起的病害。我國引起枯萎病的真菌生理小種和美國的生理小種有明顯差異，引起黃萎病的病原菌大麗輪枝菌致病力也存在較大差異，如美國的黃萎病病原菌分為落葉型T-1和非落葉型SS-4兩個生理小種，前一種的致病力比后一種強10倍。
因此建立棉花纖維上攜帶的微生物的檢測方法，對于加強病害檢疫、杜絕國外病原微生物的侵入，確保我國棉花生產(chǎn)安全具有重要意義。
我國現(xiàn)有的微生物檢測方法是對土壤微生物的檢測，該檢測方法包括培養(yǎng)基制備、微生物的分離計數(shù)、土壤懸液的制備、微生物培養(yǎng)和微生物數(shù)量的統(tǒng)計分析(見《土壤微生物研究法》第54-58頁記載的“稀釋平板法”，中國科學(xué)院南京土壤研究所微生物室編著，1985年，科學(xué)出版社出版)。在土壤懸液的制備方面具體操作為稱取IOg 土樣，放入 IOOml無菌水中，置于200rpm的搖床上震蕩·半個小時，得到KT1 土壤懸液。準確吸取Iml IO-1 土壤懸液注入9ml無菌水中并反復(fù)吹吸，得到10_2 土壤稀釋液，·照此方法依次稀釋制備 10_3-10_n稀釋度的土壤稀釋液。吸取Iml 10_4 土壤稀釋液接種細菌培養(yǎng)基、吸取Iml 10_2 土壤稀釋液接種放線菌培養(yǎng)基、吸取10_4 土壤稀釋液接種真菌培養(yǎng)基并各重復(fù)3次。但是該方法只適于制備土壤懸液，不能用于棉花纖維上攜帶的微生物的檢測，原因是(I) 土壤和棉花纖維的密度大小差距較大，土壤菌懸液制備時需要的土壤重量較大，而相同質(zhì)量的棉花纖維體積太大，具體操作起來不方便(我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，O. 5g棉花纖維就能完全吸干 IOml無菌水)；(2)對原始母液的稀釋倍數(shù)也不一樣，因為土壤的重量大，菌懸液的稀釋倍數(shù)可稍微高一些，而棉花纖維的重量小，如果稀釋倍數(shù)太高，其中某些含量較少的菌種會因不在菌落培養(yǎng)數(shù)之內(nèi)而造成誤差甚至出現(xiàn)錯誤，而如果稀釋倍數(shù)太小，相對重量而言，無菌水太少不能完全浸沒棉花纖維，引起棉花纖維上微生物不能完全脫離纖維，造成實驗錯誤。
我國對棉花纖維上攜帶的微生物的研究較少，檢測的方法尚屬空白。因此亟需建立棉花纖維上攜帶的微生物的檢測方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測棉花纖維上攜帶的微生物的方法。
本發(fā)明用于檢測棉花纖維上攜帶的微生物的方法包括以下步驟
(I)稱取一定量的待測棉花纖維樣品，計算所述棉花纖維樣品的樣品含水率；
(2)稱取與步驟(I)中的所述待測棉花纖維樣品等量的待測棉花纖維，并用無菌水浸泡，搖床培養(yǎng)1-3小時(優(yōu)選2小時)，得到浸泡液母液；
(3)取部分所述浸泡液母液，使用無菌水進行梯度稀釋得到稀釋液；
(4)分別將O. 1-0. 3ml (優(yōu)選O. 3ml)稀釋液接種在不同的選擇性培養(yǎng)+基上，并在 280C -30°C的溫度下進行培養(yǎng)；
(5)根據(jù)所述稀釋液在所述不同的選擇性培養(yǎng)基上的生長情況，鑒定所述棉花纖維上攜帶的微生物的種類；以及
(6)記錄選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，然后求平板上菌落數(shù)的平均值，并根據(jù)下式計算所述棉花纖維樣品的每克干樣中微生物的數(shù)量
權(quán)利要求
1.ー種用于檢測棉花纖維上攜帯的微生物的方法，所述方法包括以下步驟 (1)稱取一定量的待測棉花纖維樣品，計算所述棉花纖維樣品的樣品含水率； (2)稱取與步驟(I)中的所述待測棉花纖維樣品等量的待測棉花纖維，并用無菌水浸泡，搖床培養(yǎng)1-3小時，得到浸泡液母液； (3)取部分所述浸泡液母液，使用無菌水進行梯度稀釋得到稀釋液； (4)分別將0.1-0. 3ml稀釋液接種在不同的選擇性培養(yǎng)基上，并在28°C _30°C的溫度下進行培養(yǎng)； (5)根據(jù)所述稀釋液在所述不同的選擇性培養(yǎng)基上的生長情況，鑒定所述棉花纖維上攜帯的微生物的種類；以及 (6)記錄選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，然后求平板上菌落數(shù)的平均值，井根據(jù)下式計算所述棉花纖維樣品的每克干樣中微生物的數(shù)量
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(I)中的樣品含水率根據(jù)下式計算
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(2)的具體操作為 將與步驟(I)中所述待測棉花纖維樣品等量的待測棉花纖維置于一定量的無菌水中，手動搖晃至待測棉花纖維全部浸濕，置于轉(zhuǎn)速為100-150rpm/min的搖床上培養(yǎng)1_3小時，得到浸泡液母液；待測棉花纖維與無菌水的用量比例為0.1-0. 3g 10ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述待測棉花纖維與無菌水的用量比例為0.1g : 10ml。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(3)中的梯度稀釋的倍數(shù)由以下預(yù)實驗步驟確定，所述預(yù)實驗步驟包括 (i)稱取一定量的待測棉花纖維，用無菌水將所述待測棉花纖維浸泡，其中所述待測棉花纖維與無菌水的用量比例為0.1-0. 3g 10ml，搖床培養(yǎng)1-3小時，得到浸泡液母液，然后使用無菌水對所述浸泡液母液進行梯度稀釋，分別得到不同稀釋倍數(shù)的稀釋液； (ii)將每ー種所述不同稀釋倍數(shù)的稀釋液分別接種于不同的選擇性培養(yǎng)基上，并在280C -30°C的溫度下進行培養(yǎng)； (iii)計數(shù)不同的選擇性培養(yǎng)基上的菌落數(shù)；以及 (iv)選擇腐生好氧性細菌的選擇性培養(yǎng)基、腐生厭氧性細菌的選擇性培養(yǎng)基、放線菌的選擇性培養(yǎng)基、好氧性纖維素分解菌的選擇性培養(yǎng)基或厭氧性纖維素分解菌的選擇性培養(yǎng)基上菌落數(shù)在20-200之間，真菌的選擇性培養(yǎng)基上菌落數(shù)在10-100之間的稀釋倍數(shù)用于本發(fā)明所述方法的步驟(3)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述預(yù)實驗步驟(i)中所述不同稀釋倍數(shù)為100倍、1000 倍或 10000 倍。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述預(yù)實驗步驟(ii)中的培養(yǎng)時間根據(jù)不同的選擇性培養(yǎng)基而不同，對腐生好氧性細菌和腐生厭氧性細菌的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)為3-5天；對真菌的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)為5-7天；對放線菌的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)為7-10天；對好氧性纖維素分解菌和厭氧性纖維素分解菌的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)為5-7天。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(4)中對不同的選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的時間根據(jù)不同的選擇性培養(yǎng)基而不同，對腐生好氧性細菌和腐生厭氧性細菌的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)為3-5天；對真菌的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)為5-7天；對放線菌的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)為7-10天；對好氧性纖維素分解菌和厭氧性纖維素分解菌的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)為5-7天。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(5)的鑒定方法為根據(jù)不同微生物菌落特征進行鑒定。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(6)的計數(shù)方法為平板計數(shù)法，即肉眼觀察，記錄整個平板上的菌落數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測棉花纖維上攜帶的微生物的方法。該方法是將一定重量的棉花纖維浸入一定體積的無菌水中，在合適轉(zhuǎn)速條件下?lián)u床培養(yǎng)一段時間得到浸泡液母液，使用無菌水進行梯度稀釋得到相應(yīng)濃度的稀釋液，將該稀釋液分別接種在不同的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)稀釋液在選擇性培養(yǎng)基上的生長情況，鑒定棉花纖維上攜帶的微生物的種類，并計算微生物的數(shù)量。該方法具有較強的操作性和實用性，簡單易行。
文檔編號C12Q1/06GK103045714SQ201110309038
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月12日
發(fā)明者雒珺瑜, 崔金杰, 馬艷, 黃群, 王春義, 張帥, 呂麗敏, 辛惠江, 李春花, 吳冬梅 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所