專利名稱：一種四聯(lián)菌片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌片及其制備方法，尤其是一種四聯(lián)菌片及其制備方法。屬于保健食品領(lǐng)域，具體涉及四聯(lián)菌片中長雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等益生菌四聯(lián)菌片及其制備方法。
背景技術(shù)：
健康有益的益生菌如嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌等被越來越多地添加到保健食品中，通過其中活菌的作用可以改善胃功能、調(diào)整腸道菌群、抑制病原菌的生長、提高蛋白質(zhì)和維生素的代謝、防止便秘、緩解乳糖不耐癥、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、 降低膽固醇等，從而促進(jìn)身體健康。為了確保此類益生菌能在體內(nèi)發(fā)揮正常的生理保健功能，一些世界性的食品組織已經(jīng)提出標(biāo)準(zhǔn)，要求在食品中雙歧桿菌等益生菌的最低值為 IO6 107CFU/g。本品采用粉末直接壓片工藝，解決了在傳統(tǒng)的先制粒后壓片技術(shù)中益生菌無法存活的問題，采用本技術(shù)生產(chǎn)出的產(chǎn)品具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)腸道功能，增強(qiáng)免疫力和預(yù)防便秘、腹瀉的療效。技術(shù)方案本發(fā)明的目的在于提供一種四聯(lián)菌片及其制備方法。本發(fā)明的一種四聯(lián)菌片，其中，菌粉占產(chǎn)品重量百分比為干酪乳桿菌菌粉1-3%長雙歧桿菌菌粉2-5%嗜酸乳桿菌菌粉1-3%嗜熱鏈球菌菌粉1-3%其它成份為輔料。上述的輔料為矯味劑、粘合劑和助流劑。上述的矯味劑為甜味劑和/或酸味劑。嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)菌種保藏號為CGMCC No. 4472，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時(shí)間為2010年12月14日。干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)菌種保藏號為CGMCC No. 1697，保藏單位為 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時(shí)間為2006年04月21日。嗜熱鏈球菌(Sti^ptococcusthermophilus)菌種保藏號為 CGMCC No. 4471，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時(shí)間為2010年12月14 曰。長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)菌種保藏號為CGMCC No. 4470，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時(shí)間為2010年12月14日。以四聯(lián)菌片為100份計(jì)。上述的輔料(重量份)優(yōu)選為葡萄糖25-30，低聚半乳糖 7-15，麥芽糊精18-25，赤蘚糖醇3-9，微晶纖維素5-10，羥丙基纖維素1-3，檸檬酸0. 3-0.8， 香精0. 1-0. 5，低聚異麥芽糖15-20，硬脂酸鎂0. 3-0. 8。
上述四聯(lián)菌片的制備方法，其中第一步分別將原輔料進(jìn)行過篩，規(guī)格為16-40目；第二步將步驟1中的原輔料除硬脂酸鎂外在混勻機(jī)上混勻10-15分鐘，再加入硬脂酸鎂混勻3-5分鐘；第三部將步驟 2中混合物進(jìn)行壓片，包裝。上述四聯(lián)菌片的制備方法，其中，本發(fā)明產(chǎn)品的片重為0.85g。;本發(fā)明產(chǎn)品的硬度約為40-100N，優(yōu)選發(fā)明產(chǎn)品的硬度約為80N。每天服用4片。本發(fā)明涉及菌種的分類學(xué)特征和其他形態(tài)學(xué)特征公開如下長雙歧桿菌(BB20071001)，為分離自內(nèi)蒙古地區(qū)健康人體腸道，篩選出適合人體之菌株，該長雙歧桿菌已于2010年12月14日在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定專利微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No. 4470。樣品的采集與保存內(nèi)蒙古錫盟西烏珠穆沁旗12名健康兒童，男女各6名，年齡 3 5歲，均無胃腸病史，采樣前兩周內(nèi)未服用任何抗菌類藥物。用無菌玻璃棒挑取自然排出的新鮮糞便5 10g，置入無菌平皿中，迅速放入?yún)捬豕拗校瑤Щ貙?shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。菌株篩選1、菌株的分離純化與保存取厭氧凍存的樣品3g加入有玻璃珠的三角瓶中，加入30mLPBS稀釋液搖床振蕩 (250rpm) 15min，然后吸取ImL便液加入一支裝有9mLPBS稀釋液的試管中，漩渦混勻，作為 ΙΟ"2稀釋液，同樣方法稀釋至10_4。取厭氧罐中充分預(yù)厭氧的TPY固體平板，將糞便原液、10_2稀釋液、10_3稀釋液、 10_4稀釋液各取0. lmL，均勻涂布平板，置厭氧罐中37°C厭氧培養(yǎng)Mh。在選擇性TPY培養(yǎng)基上，雙歧桿菌的菌落特征較為典型，易與其它菌落區(qū)分開來。 雙歧桿菌的菌落一般為光滑，凸圓，邊緣完整，顏色呈乳褐色或乳白色，直徑2-5mm，具有這些形態(tài)特征的菌落被認(rèn)為是雙歧桿菌可疑菌落，進(jìn)一步分離純化得到雙岐桿菌純菌株。將雙歧桿菌純菌株擴(kuò)培后用PBS溶液離心洗滌兩遍后，懸于保護(hù)劑(12%脫脂乳 +0.1%谷氨酸鈉)中，真空冷凍干燥，-18°c保存。2、雙歧桿菌的人工胃液耐受性篩選試驗(yàn)結(jié)果將供試菌株接入pH2. 0、pH2. 5、pH 3. 0人工胃液中，37°C厭氧培養(yǎng)池對其進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并計(jì)算存活率。結(jié)果看出，不同菌株在不同PH的人工胃液中耐受性有顯著差異(ρ < 0. 01)。菌株對人工胃液耐受性隨PH降低而降低，其中長雙歧桿菌對人工胃液耐受性最強(qiáng)，在pH2. 0人工胃液中37°C厭氧保溫池后存活率達(dá)到92. 4%，而其它10株菌在此條件下的存活率均小于31. 25%，說明這10株菌對模擬胃液特別敏感，沒有進(jìn)一步篩選的價(jià)值， 所以僅選擇具有良好耐酸特性的長雙歧桿菌作為進(jìn)一步試驗(yàn)的對象。3、長雙歧桿菌對pH8. 0人工腸液的耐受結(jié)果將具有良好耐酸特性的長雙歧桿菌在pH2. 0的人工胃液中厭氧消化池后，接入 PH8. 0的人工腸液中繼續(xù)37°C厭氧保溫消化，分別在不同時(shí)間取樣計(jì)數(shù)并計(jì)算其存活率， 結(jié)果可以看出，長雙歧桿菌在PH8.0的人工腸液中37°C厭氧保溫他后，活菌數(shù)與存活率均無明顯差異(P < 0. 05)，該菌株具有良好的耐受腸液特性。分離至兒童糞便中的雙歧桿菌的鑒定結(jié)果
1、形態(tài)及菌落特征G+，菌體長而彎曲，棍棒狀，膨脹或啞鈴形的桿菌可分叉，菌落一般為光滑，凸圓， 邊緣完整，顏色呈乳褐色或乳白色，直徑2-5mm。2、生理生化學(xué)特性，見表1。表1雙歧桿菌的生理生化鑒定結(jié)果
試驗(yàn)項(xiàng)目試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目試驗(yàn)結(jié)果D-核糖+甘露糖-L-阿拉伯糖+果唐+乳糖+半乳糖+纖維二糖-蔗糖+松三糖+麥芽糖+棉子糖+海藻湯-山梨醇-密二糖+淀粉-甘露醇+葡萄糖酸鈉-水楊素-木糖(+)注+表示待測菌株陽性(+)表示待測菌株弱陽性-表示待測菌株陰性根據(jù)上表試驗(yàn)結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，上述得到的該菌株為長雙歧桿菌。長雙歧桿菌的制備方法(以上為重量百分比)1、種子培養(yǎng)基牛肉膏0.25%、乳糖0.8%、酪蛋白胨1%、大豆蛋白胨0.2%、酵母粉0. 3 %、磷酸氫二鈉0. 20%、磷酸二氫鉀0. 25%、硫酸鎂0. 01%、L-半胱氨酸鹽酸鹽 0. 025%、吐溫-800. 02%、溶解后用25%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH7. 2-7. 4。(注硫酸鎂單獨(dú)溶解后加入)。2、發(fā)酵液培養(yǎng)基牛肉膏0.5%、乳糖1%、酪蛋白胨1%、大豆蛋白胨0.5%、酵母粉0. 5 %、磷酸氫二鈉0. 25 %、磷酸二氫鉀0. 25 %、硫酸鎂0. 01 %、L-半胱氨酸鹽酸鹽 0. 05%、吐溫-800. 025%、溶解后用25%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH7. 2-7. 4。(注硫酸鎂單獨(dú)溶解后加入)。121°C15分鐘滅菌。3、發(fā)酵及真空冷凍干燥一級、二級、三級種子接種量為1-7%，37°C進(jìn)行發(fā)酵，攪拌速度為60轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵液PH恒定在5. 8，0D_2. 0以上鏡檢長雙歧桿菌形態(tài)正常，無雜菌，終止發(fā)酵。得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分，要求上清液清澈，得到菌泥。再按照菌泥與保護(hù)劑為1 10 的比例進(jìn)行混合為上機(jī)液。保護(hù)劑配方各組份重量百分比為谷氨酸鈉1%、乳糖8%、海藻糖4%、脫脂奶粉10%、甘油0. 1 %，其余為水，115°C滅菌15分鐘后冷卻至10°C。上機(jī)液真空冷凍干燥工藝為干燥條件-60--40°C預(yù)凍1- 后進(jìn)行真空冷凍干燥，冷凍干燥溫度為_60°C，真空度為l_8pa，真空冷凍干燥1018h，再進(jìn)行粉碎、混合粉碎粒度為0.4mm，均可通過40目篩，混合均勻后包裝。嗜熱鏈球菌(QH10-4-1)，一種傳統(tǒng)酸奶中分離得到嗜熱鏈球菌，該嗜熱鏈球菌已于2010年12月14日，在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定專利微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCCNo.4471。菌株的分離純化1.樣品的采集2005年8月12日于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍(lán)旗賽音胡都嘎蘇木采集了 3份酸奶樣品，樣品均來自3個(gè)不同家庭。采集樣品時(shí)將做好的一桶酸奶，攪拌均勻， 用無菌移液器吸取5mL于滅菌離心管中，并封口，每個(gè)樣品取三份。將收集到的樣品立即放入冰盒內(nèi)，間隔一定時(shí)間更換冰袋，保持在較低的溫度下將樣品放入4°C冰箱保存，以進(jìn)行菌株的篩選。2.嗜熱鏈球菌的篩選將酸奶樣品進(jìn)行稀釋(10_4，ΙΟ"5,10_6)，在Elliker瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，37°C培養(yǎng)M-4 !。對于在Elliker瓊脂培養(yǎng)基上生長的不同菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果革蘭氏陽性菌并且細(xì)胞為球形的菌落。3.菌種分離純化用無菌接種針挑取單個(gè)菌落接種于Elliker液體培養(yǎng)基中，放入相應(yīng)的恒溫箱中37°C培養(yǎng)1 Mh。連續(xù)培養(yǎng)三代后，將菌液振蕩混勻，離心洗滌菌體 lOmin，棄上清液，在沉淀中加入5mL滅菌生理鹽水，振蕩混勻，如此重復(fù)兩次后即將菌液制成供試菌液。將供試菌液振蕩混勻，涂片，固定，革蘭氏染色，在顯微鏡下仔細(xì)觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)和細(xì)菌排列方式。菌落形態(tài)一樣、革蘭氏陽性、球菌分離株進(jìn)行保存。4.乳酸菌分離株的保存分離純化得到的5株菌在Elliker液體培養(yǎng)基中，37°C、 24h培養(yǎng)2代。4000rpm，離心10mir^4°C )，棄上清液，菌體中加入等量的滅菌生理鹽水，振蕩混勻，4000rpm離心10mir^4°C )離心洗滌菌體，反復(fù)3次，棄上清液，加菌體保護(hù)液(含 8%乳糖、1 % L-谷氨酰胺鈉、10%脫脂乳、1 % L-半胱氨酸)約2mL，充分混勻，分裝于凍存管中，封口 -40°C冷凍保存。5.耐酸耐膽鹽菌株的篩選向Elliker培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 3%的膽鹽，并調(diào)PH值至3.0，將活化好的菌種按5%接種量接于加膽鹽的培養(yǎng)基中；同時(shí)，用不加膽鹽、不調(diào)PH值的Elliker培養(yǎng)基作對照，培養(yǎng)24h后，涂于Elliker固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，挑出單個(gè)菌落接于斜面上備用。表2耐酸耐膽鹽菌株的篩選結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種四聯(lián)菌片，其特征在于菌粉占產(chǎn)品重量百分比為 干酪乳桿菌菌粉 1_3%， 長雙歧桿菌菌粉 2-5%， 嗜酸乳桿菌菌粉 1_3%， 嗜熱鏈球菌菌粉 1_3%， 其它成份為輔料。
2.如權(quán)利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于 干酪乳桿菌菌種保藏號為CGMCC No. 1697，保藏單位為會普通微生物中心，保藏時(shí)間為2006年04月21日。
3.如權(quán)利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于 長雙歧桿菌菌種保藏號為CGMCC No. 4470，保藏單位為會普通微生物中心，保藏時(shí)間為2010年12月14日。
4.如權(quán)利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于 嗜酸乳桿菌菌種保藏號為CGMCC No. 4472，保藏單位為會普通微生物中心，保藏時(shí)間為2010年12月14日。
5.如權(quán)利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于 嗜熱鏈球菌菌菌種保藏號為CGMCC No. 4471，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時(shí)間為2010年12月14日。
6.如權(quán)利要求1所述的四聯(lián)菌片，其特征在于所述的輔料為矯味劑、粘合劑和助流劑，其中，優(yōu)選矯味劑為甜味劑和/或酸味劑。
7.如權(quán)利要求6所述的四聯(lián)菌片，其特征在于在100重量份的四聯(lián)菌片中，所述輔料的重量份為葡萄糖25-30，低聚半乳糖 7-15， 麥芽糊精 18-25， 赤蘚糖醇 3-9， 微晶纖維素 5-10， 羥丙基纖維素1-3， 檸檬酸0. 3-0. 8，香精0. 1-0. 5，低聚異麥芽糖15-20， 硬脂酸鎂 0.3-0.8。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述四聯(lián)菌片的制備方法，其特征在于第一步，分別將原輔料進(jìn)行過篩，規(guī)格為16-40目；第二步，將步驟1中的原輔料除硬脂酸鎂外在混勻機(jī)上混合10-15分鐘，再加入硬脂酸鎂混合3-5分鐘；第三步，將步驟2中混合物進(jìn)行壓片，包裝。
9.如權(quán)利要求8所述四聯(lián)菌片的制備方法，其特征在于所述的四聯(lián)菌片的單位片重為 0. 85g。
10.如權(quán)利要求8所述四聯(lián)菌片的制備方法，其特征在于所述的四聯(lián)菌片的硬度約為中國微生物菌種保藏管理委員 中國微生物菌種保藏管理委員 中國微生物菌種保藏管理委員40-100N，優(yōu)選硬度約為80N。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種四聯(lián)菌片及其制備方法，屬于保健食品領(lǐng)域，具體涉及四聯(lián)菌片中長雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等益生菌四聯(lián)菌片及其制備方法；該四聯(lián)菌片中，干酪乳桿菌菌粉1-3％、長雙歧桿菌菌粉2-5％、嗜酸乳桿菌菌粉1-3％、嗜熱鏈球菌菌粉1-3％、其它成份為輔料；由于雙歧桿菌和乳酸菌被認(rèn)為對人體有很多有益的影響，所以通過添加低聚半乳糖和低聚異麥芽糖等益生元物質(zhì)促進(jìn)益生菌在人體內(nèi)的增殖。
文檔編號A23L1/29GK102204679SQ20111016135
公開日2011年10月5日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者劉偉學(xué), 孫潔宇, 李巖巖, 梁春梅, 王瀟瀟, 王秋實(shí), 高杰, 高鵬飛 申請人:高杰