專利名稱：一種利用檸檬酸發(fā)酵液為原料發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋果酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用檸檬酸發(fā)酵液為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。
背景技術(shù)：
L-蘋果酸是生物體糖代謝過程中產(chǎn)生的一種重要有機(jī)酸，廣泛存在于水果及蔬菜中，是一種優(yōu)良的酸味劑和保鮮劑，主要運(yùn)用于食品、化工、醫(yī)藥、日化及保健等，用其合成的尿素L-蘋果酸還可用于非線性光學(xué)有機(jī)材料。近年來，L-蘋果酸市場逐漸啟動，需要快速增加，已呈現(xiàn)嚴(yán)重供不應(yīng)求的局面。由于用天然產(chǎn)物提取或者化學(xué)合成的來生產(chǎn)蘋果酸的方法成本過高，因此用微生物的方法合成L-蘋果酸是今后大規(guī)模生產(chǎn)的趨勢。目前用微生物合成L-蘋果酸的菌種繁多，但大致可以分為四類1.由絲狀菌和酵母菌發(fā)酵，由多糖降解成L-蘋果酸。2.培養(yǎng)細(xì)菌，由菌體內(nèi)的延胡索酸酶將加入的延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸3.將含延胡索酸的菌體細(xì)胞固定化，或從細(xì)胞中提取出延胡索酸酶制成固定化酶之后，再將延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。4.先培養(yǎng)根酶將葡萄糖降解成延胡索酸，再接入普通變形桿菌混合培養(yǎng)，將延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸。其中，第2種方法是目前用于L-蘋果酸生產(chǎn)的主要方法。但由于延胡索酸酶的制備培養(yǎng)基通常以檸檬酸為碳源，而成品檸檬酸的價格較高，從而導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種利用檸檬酸發(fā)酵液為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其為以檸檬酸發(fā)酵液為碳源，發(fā)酵產(chǎn)延胡索酸酶菌株生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化富馬酸鈉生成蘋果酸。其中，所述的發(fā)酵產(chǎn)延胡索酸酶菌株的培養(yǎng)基為檸檬酸發(fā)酵液20 25wt%、 MgSO4O. 02 0. 05wt%、玉米菜 3. 5 4. 5wt%,KH2PO4O. 2 0. 4wt%,NH3 ·Η20 3 5wt%。其中，所述的檸檬酸發(fā)酵液中檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 15%。其中，可通過本領(lǐng)域公知的方法發(fā)酵黑曲霉，獲得檸檬酸發(fā)酵液。優(yōu)選可參看 CN101638675的方法發(fā)酵產(chǎn)程檸檬酸發(fā)酵液。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選當(dāng)延胡索酸酶的酶活力為21000 M000 μ mol/g·!!時，停止發(fā)酵產(chǎn)延胡索酸酶菌株。其中，優(yōu)選的發(fā)酵溫度為；34 36°C，發(fā)酵時間為20 40h。根據(jù)本發(fā)明，在產(chǎn)延胡索酸酶菌株發(fā)酵過程中，優(yōu)選的發(fā)酵液體積和無菌空氣的通氣量之比為1 0. 5-0. 9。根據(jù)本發(fā)明，可選用任何本領(lǐng)域公知的可發(fā)酵產(chǎn)生延胡索酸酶的菌株，可選自溫特曲霉、產(chǎn)氨短桿菌、普通變形桿菌、黃色短桿菌或其組合，優(yōu)選的菌株為產(chǎn)氨短桿菌菌株M13(保藏號為 CICC 10169)。根據(jù)本發(fā)明，將含有延胡索酸酶的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化富馬酸鈉，生成L-蘋果酸，其中含有延胡索酸酶的發(fā)酵液和富馬酸鈉的混合液中延胡索酸酶酶活為10500 13333 μ mol/ g · h，富馬酸鈉的濃度為0. 44 0. 83mol/L。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的轉(zhuǎn)化L-蘋果酸的溫度為37_40°C，轉(zhuǎn)化時間為20_26小時。本發(fā)明針對延胡索酸酶發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的成品檸檬酸價格較高的問題，采用按一定比例的檸檬酸發(fā)酵液來代替成品檸檬酸的添加，使得生產(chǎn)成本最低化，并建立了相應(yīng)的檸檬酸發(fā)酵液預(yù)處理辦法與酶發(fā)酵生產(chǎn)代謝控制技術(shù)；本發(fā)明利用檸檬酸發(fā)酵液為碳源，對其他培養(yǎng)基成分也進(jìn)行了優(yōu)化，并且對酶發(fā)酵過程和酶轉(zhuǎn)化工藝也做出了相應(yīng)的改進(jìn)，最后得到的較高的L-蘋果酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，對與L-蘋果酸的大規(guī)模生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)
眉、ο具體實(shí)施方法以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1按照CN101638675公開的方法，發(fā)酵黑曲霉獲得檸檬酸發(fā)酵液，發(fā)酵液中檸檬酸的含量為12%，將其經(jīng)板框過濾器進(jìn)行壓濾，除去發(fā)酵液中的菌絲等固態(tài)雜質(zhì)后，收集發(fā)酵液。實(shí)施例2先將延胡索酸酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)氨短桿菌Μ13(保藏號為CICC10169)(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)在通風(fēng)條件下培養(yǎng)40小時，以的接種量接種到IOm2發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在36°C，初始ρΗ為7. 3。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為實(shí)施例 1 制備的檸檬酸發(fā)酵液 20wt %, MgSO4O. 02wt%、玉米漿 3. 5wt%, KH2PO4O. 2wt%, NH3 · H2O 3wt%。經(jīng)發(fā)酵30小時后，當(dāng)產(chǎn)氨短桿菌OD66tlnm達(dá)到0. 48，生產(chǎn)得到的延胡索酸酶酶活為 22311 4!1101/^*11時結(jié)束發(fā)酵，之后將酶發(fā)酵液和1.411101/1的富馬酸納溶液按照1 0.8 的體積比混合加入生物反應(yīng)結(jié)晶器中，在常壓，PH為6. 8，溫度為37°C下進(jìn)行酶反應(yīng)，經(jīng)過 24小時轉(zhuǎn)化，使L-蘋果酸含量達(dá)到81g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 82.2%。實(shí)施例3先將延胡索酸酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)氨短桿菌M13在通風(fēng)條件下培養(yǎng)40小時，以1 %的接種量接種到50m2發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在36°C，初始pH為7. 5。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為實(shí)施例1制備的檸檬酸發(fā)酵液25wt%、MgSO4O. 05wt%、玉米漿4. 5wt%, KH2PO4O. 4wt %、NH3 · H2O 5wt %。經(jīng)發(fā)酵28小時后，當(dāng)產(chǎn)氨短桿菌OD66tlnm達(dá)到0. 51，生產(chǎn)得到的延胡索酸酶酶活為 23712 μ mol/g · h時結(jié)束發(fā)酵，之后將酶發(fā)酵液和1. 5mol/L的富馬酸納溶液按照1 1的體積比混合加入生物反應(yīng)結(jié)晶器中，在常壓，PH為6. 8，溫度為37°C下進(jìn)行酶反應(yīng)，經(jīng)過M 小時轉(zhuǎn)化，使L-蘋果酸含量達(dá)到83g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 83. 9 %。實(shí)施例4先將延胡索酸酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)氨短桿菌M13在通風(fēng)條件下培養(yǎng)40小時，以的接種量接種到80m2發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在36°C，初始pH為7. 5。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為實(shí)施例1制備的檸檬酸發(fā)酵液22wt%、MgSO4O. (Mwt %、玉米漿4. Owt KH2PO4O. 3wt %、NH3 · H2O 4wt %。經(jīng)發(fā)酵33小時后，當(dāng)產(chǎn)氨短桿菌OD66tlnm達(dá)到0. 47，生產(chǎn)得到的延胡索酸酶酶活為 21890 μ mol/g · h時結(jié)束發(fā)酵，之后將酶發(fā)酵液和lmol/L的富馬酸納溶液按照1 0. 8的體積比混合加入生物反應(yīng)結(jié)晶器中，在常壓，PH為6. 8，溫度為37°C下進(jìn)行酶反應(yīng)，經(jīng)過25 小時轉(zhuǎn)化，使L-蘋果酸含量達(dá)到79. 5g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 81. 3%。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種利用檸檬酸發(fā)酵液為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，其特征在于，以檸檬酸發(fā)酵液為碳源，發(fā)酵生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的發(fā)酵液，通過酶轉(zhuǎn)化的方法，使富馬酸鈉生成L-蘋果酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)延胡索酸酶菌株的培養(yǎng)基為檸檬酸發(fā)酵液 20 25wt%、MgS040. 02 0. 05wt %、玉米漿 3. 5 4. 5wt%、ΚΗ2Ρ040. 2 0. 4wt%,NH3 · H203 5wt%，pH 為 7· 2 7· 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的檸檬酸發(fā)酵液中檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 15%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵產(chǎn)延胡索酸酶菌株生成延胡索酸酶的酶活力為21000 24000 μ mol/g · h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述產(chǎn)延胡索酸酶菌株的發(fā)酵溫度為 34 36°C，發(fā)酵時間為20 40h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述產(chǎn)延胡索酸酶菌株發(fā)酵的發(fā)酵液體積和無菌空氣的通氣量之比為1 0. 5 0. 9。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的產(chǎn)延胡索酸酶菌株為產(chǎn)氨短桿菌Ml3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的延胡索酸酶的發(fā)酵液與富馬酸鈉的混合溶液中延胡索酸酶酶活為10500 13333 μ mol/g · h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的延胡索酸酶的發(fā)酵液與富馬酸鈉的混合溶液中富馬酸鈉的濃度為0. 44 0. 83mol/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化L-蘋果酸的溫度為37 40°C，轉(zhuǎn)化時間為20 沈小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用檸檬酸發(fā)酵液為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的方法，以檸檬酸發(fā)酵液為碳源，發(fā)酵生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的發(fā)酵液，通過酶轉(zhuǎn)化的方法，使富馬酸鈉生成L-蘋果酸。經(jīng)過20～26小時轉(zhuǎn)化，蘋果酸含量可達(dá)到78-85g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了81.2％～85.5％。本發(fā)明工藝簡單，能耗少，原料便宜，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P7/46GK102242160SQ20111012235
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月11日
發(fā)明者唐浩, 李維理, 李榮杰, 穆曉玲 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司