專利名稱：一種應用rapd-pcr確定飲用水源水遺傳毒性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種確定水體遺傳毒性的方法，更具體的說是一種應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法。
背景技術：
遺傳標記是生物遺傳分析的 基礎和遺傳分析方法。遺傳標記(Genetic marker)是指那些表現(xiàn)變異性，且遵循簡單遺傳方式的性狀或物質，是任何遺傳分析所不可缺少的工具。它是進行遺傳分析、群體遺傳學研究、遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化與分類研究中不可缺少的工具。RAPD是以PCR技術為基礎的分子標記技術的一種，是1990年Williams和Welsh 等各自獨立地首先運用隨機引物擴增尋找多態(tài)性DNA片段作為分子標記，并將這一方法命名為隨機擴增多態(tài)性 DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)。RAPD 標記技術是建立于聚合酶鏈式反應(PCR)基礎之上，用寡核苷酸序列為引物，通過專門的PCR反應擴增獲得長度不同的多態(tài)性DNA片段。不同物種的基因組中與某一引物相匹配的堿基序列的空間位置和數(shù)目都可能不同，因而擴增產(chǎn)物的大小和數(shù)量也可能不同，用適當選擇的一系列人工合成的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物，以目標基因組 DNA或RNA反轉錄生成的cDNA為模板進行PCR擴增。RAPD標記技術具有以下優(yōu)點(1)無需預先知道研究對象的基因組核苷酸序列， 無需專門設計的擴增引物，一套商售的引物即可滿足RAPD分析的要求；(2) RAPD分析直接以基因組DNA為分析對象，無需像RFLP那樣進行預備性工作一克隆制備和篩選、同位素標記、Southern印記和分子雜交等步驟，方法簡便易行；(3)RAPD分析適用于自動化程序分析，結果較為準確可靠。目前，RAPD由于其自身特點而得到廣泛應用，比如，在物種分類和進化和污染物的遺傳毒性分析研究領域。但是，目前RAPD在遺傳毒性方面僅發(fā)揮了很小的一部分的作用，只要和合適的分析工具、嚴格的標準化試驗條件相結合，RAPD技術將會是一種可靠、靈敏、重復性強的分析方法，并可探測出DNA的多種損傷，包括DNA加合物、DNA損傷、突變等，其在遺傳毒性領域必將大有可為。

發(fā)明內容
1、本發(fā)明的目的是提供一種應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，更好的評價飲用水源水的遺傳毒性，為各類水質評價提供生物信息學參考。2、技術方案
本發(fā)明的技術方案如下
一種應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，其步驟為 (1)采用待分析飲用水源水飼喂小鼠，并分別以純凈水與一定濃度的毒性物質溶液飼喂的小鼠作為陰性對照與陽性對照；(2)提取小鼠DNA，選用RAPD分子標記技術進行遺傳分析，分別以隨機引物對小鼠的肝臟細胞基因組進行RAPD擴增，并對擴增條帶進行多態(tài)性分析。步驟(2)采用電泳并拍照后獲得電泳圖片條帶進行所述的多態(tài)性分析。RAPD 的反應體系為 50ngDNA 模板，10Xbuffer2. 5 μ 1，dNTP200 μ mol/L, Mg2+2. 5mmol/L，引物0. 8 μ mol/L, Taq酶2U ；用滅菌雙蒸水將體積補至25 μ 1。 RAPD擴增程序為94°C預變性5min ；94°C變性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸 2min，40個循環(huán)后72°C延伸lOmin。通過以上技術方案擬解決以下問題通過對不同處理組小鼠的遺傳分析，證實水源對小鼠肝臟基因組是否存在遺傳毒性及遺傳毒性的大??；根據(jù)獲得的基因組多態(tài)性結果，預測水源水對人類基因組的影響，并初步評價水源水的遺傳毒性，為水源水的水質評價提供生物信息學參考。3、有益效果
本發(fā)明提供了一種應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，可以確定飲用水源水對小鼠基因組DNA的影響，從整體評價和預警其可能產(chǎn)生的遺傳毒性，同時，證實了 RAPD技術在遺傳毒性研究領域應用的優(yōu)越性和可行性。本發(fā)明為飲用水源水的質量控制以及沿岸治理提供依據(jù)。


圖1為部分引物擴增得到的RAPD圖譜，其中A:水源水組，B =CK組，C =Bap組，0 空白組(以滅菌雙蒸水代替DNA模板所配成的體系)。圖2為UPGMA法對9只小鼠進行聚類分析。圖3為UPGMA法對Nei，s遺傳距離分類聚態(tài)圖。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。1實驗設計
本實驗采用雄性小鼠(Mus musculus, ICR)作為實驗對象，小鼠3 4周齡，體重18 士 lg。實驗動物隨機分為3組(飲用水源水組、CK組和Bap組)，每組20只。飲用水源水組小鼠給予水源水。CK組小鼠給予未檢測出EPA25種優(yōu)先控制污染物的清潔水(農(nóng)夫山泉水)作為陰性對照，Bap組小鼠給予3. 8 ug/L苯并(a)芘飽和溶液作為陽性對照。實驗動物染毒時間為90天，實驗周期的第一個月每周稱一次體重，此后每兩周稱一次體重。實驗周期結束后，一次性將實驗動物全部處死，解剖。分離主要器官稱重(包括心、肝、脾、肺、腎、睪丸和附睪)，并進行后續(xù)分析。2實驗方法 (I)DNA提取
分別從三組小鼠肝臟中取大約IOOmg肝臟，在液氮中研磨成粉末，均分成4份，每份大約20mg，使用UNIQ-10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒進行DNA抽提，操作方法完全按照試劑盒使用說明進行。得到DNA溶液后，紫外分光光度計測樣品OD26tl和OD28tl,計算DNA(2) RAPD-PCR反應條件及擴增程序
RAPD 的反應體系為50ngDNA 模板，10Xbuffer2. 5μ 1，dNTP200 μ mol/L，Mg2+2. 5mmol/ L，引物0. 8 μ mol/L, Taq酶2U。用滅菌雙蒸水將體積補至25 μ 1。擴增程序為94°C預變性 5min ；94°C變性 lmin，35°C退火 lmin，72°C延伸 2min，40 個循環(huán)后72°C延伸IOmin。每條引物每次PCR時均需設一空白組，即以滅菌雙蒸水代替DNA模板，其他條件均不變所配成的體系。(3)電泳
基因組DNA和RAPD-PCR產(chǎn)物電泳配制0. 7%的瓊脂糖凝膠300ml，煮沸溶解，并加 20μ l(10mg/ml)溴化乙錠，然后10 μ 1樣品與載樣液混勻加樣，電壓為3V/cm，電泳0. 5_2h。 緩沖液為1XTAE。3分析與結論
對于RAPD-PCR獲得的產(chǎn)物，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳并拍照后會獲得一系列電泳圖片條帶。部分引物擴增后的RAPD圖譜見圖1。通過RAPD-PCR試驗，對實驗對象進行下述分析
(1)條帶多態(tài)性分析
從40條引物中共篩選出條帶清晰、易于分析的20條引物對12只小鼠進行檢測，共檢測到189個位點，其中多態(tài)性位點為151個(見表1)。由表1中可知，20條引物中，除PlO和 P30外，其他引物均具有較高的多態(tài)位點比(57. 14% 100%)，平均多態(tài)性位點比將近80%， 說明這批受試小鼠遺傳多樣性較為豐富。表1 20條RAPD引物擴增的總帶數(shù)和多態(tài)帶數(shù)_
權利要求
1.一種應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，其步驟為(1)采用待分析飲用水源水飼喂小鼠，并分別以純凈水與一定濃度的毒性物質溶液飼喂的小鼠作為陰性對照與陽性對照；(2)提取小鼠DNA，選用RAPD分子標記技術進行遺傳分析，分別以隨機引物對小鼠的肝臟細胞基因組進行RAPD擴增，并對擴增條帶進行多態(tài)性分析。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，其特征在于步驟(2)中采用電泳并拍照后獲得電泳圖片條帶進行所述的多態(tài)性分析。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，其特征在于所述的 RAPD 的反應體系為 50ngDNA 模板，10 X buffer2. 5 μ 1，dNTP200 μ mol/L, Mg2+2. 5mmol/L，引物0. 8 μ mol/L, Taq酶2U ；用滅菌雙蒸水將體積補至25 μ 1。
4.根據(jù)權利要求1所述的應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法，其特征在于所述的RAPD擴增程序為94°C預變性5min ；94°C變性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸2min， 40個循環(huán)后72°C延伸IOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了應用RAPD-PCR確定飲用水源水遺傳毒性的方法。其步驟為采用待分析飲用水源水飼喂小鼠，并分別以純凈水與一定濃度的毒性物質溶液飼喂的小鼠作為陰性對照與陽性對照；提取小鼠DNA，選用RAPD分子標記技術進行遺傳分析，分別以隨機引物對小鼠的肝臟細胞基因組進行RAPD擴增，并對擴增條帶進行多態(tài)性分析。本發(fā)明可以確定飲用水源水對小鼠基因組DNA的影響，從整體評價和預警其可能產(chǎn)生的遺傳毒性，同時，證實了RAPD技術在遺傳毒性研究領域應用的優(yōu)越性和可行性。
文檔編號C12Q1/68GK102154486SQ20111004356
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權日2011年2月23日
發(fā)明者劉寧, 吳以中, 夏晶, 戴明忠, 朱沁園, 陸根法 申請人:南京大學