專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞處理試劑盒及干細(xì)胞分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外分離人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血中干細(xì)胞的試劑盒及干細(xì)胞分離方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，用于人類(lèi)血液細(xì)胞分離的方法包括免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀法、血細(xì)胞分離機(jī)法和培養(yǎng)擴(kuò)增法等方法。免疫磁珠法將已知的抗體包被在磁珠微粒上，使磁珠微粒與人類(lèi)血液混合。呈抗原抗體陽(yáng)性的細(xì)胞粘附在磁珠上，通過(guò)一條磁性管道，磁珠被吸附在管壁上；其它沒(méi)有結(jié)合磁珠的細(xì)胞都流走后，去除管道磁性，搜集所有含有磁珠的細(xì)胞。存在問(wèn)題造價(jià)高，中低收入患者不適用。對(duì)細(xì)胞本身活性有損傷，影響細(xì)胞治療療效。流式細(xì)胞儀法分選原理流式細(xì)胞計(jì)的分選功能是由細(xì)胞分選器完成的?？偟倪^(guò)程由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過(guò)靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類(lèi)型的儀器也有采用捕獲管來(lái)進(jìn)行分選的。存在問(wèn)題，一臺(tái)流式細(xì)胞儀造價(jià)300-500萬(wàn)元，標(biāo)記用抗體 1500-5000元一支，造價(jià)高，標(biāo)記物有致癌性，應(yīng)用于臨床不安全，只能適用于科研。血細(xì)胞分離機(jī)法主要用于分離外周血，先給患者注射動(dòng)員劑，然后使患者外周血經(jīng)過(guò)血細(xì)胞分離機(jī)循環(huán)過(guò)濾，得到一定范圍直徑的細(xì)胞，用于細(xì)胞治療。存在問(wèn)題打動(dòng)員劑增加治療負(fù)擔(dān)， 分離后細(xì)胞液體積過(guò)大，患者承擔(dān)一定的生命危險(xiǎn)。培養(yǎng)擴(kuò)增法采集人類(lèi)血液后，加入試劑置于培養(yǎng)箱擴(kuò)增，1周后清洗使用。存在問(wèn)題污染率高，干細(xì)胞向未知方向分化為未知干細(xì)胞，時(shí)間長(zhǎng)?，F(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)公開(kāi)的涉及骨髓和血液分離專(zhuān)利文獻(xiàn)申請(qǐng)?zhí)?00510130326. 7，名稱(chēng)一種分離細(xì)胞的方法及專(zhuān)用細(xì)胞分離液。該分離細(xì)胞的方法缺點(diǎn)上述方法針對(duì)雞，牛，人血液需要做各種調(diào)整，準(zhǔn)確度堪憂，由于添加了表面活性劑，分離出的細(xì)胞未知，只能用于簡(jiǎn)單的細(xì)胞試驗(yàn)使用。申請(qǐng)?zhí)?00610035900. 5，名稱(chēng)一種干細(xì)胞分離液及其用于干細(xì)胞分離的方法。 該干細(xì)胞分離液和干細(xì)胞分離的方法的缺點(diǎn)需要配制工作液，需要調(diào)節(jié)密度，只能搜集密度在1.083g/ml范圍內(nèi)的細(xì)胞，即搜集到的細(xì)胞較雜，而可用于治療所需要的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量少，并且對(duì)于臍帶血來(lái)說(shuō)，使用該方法去除紅細(xì)胞不凈，最終臨床應(yīng)用的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生排異反應(yīng)。
申請(qǐng)?zhí)?00610114475. 9名稱(chēng)用于分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞的試劑盒使用該試劑盒的缺點(diǎn)使用該試劑盒直接分離血液中的干細(xì)胞，數(shù)量不足以臨床治療使用，所以該方法進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞污染率高，體外模擬體內(nèi)環(huán)境使細(xì)胞擴(kuò)增，導(dǎo)致培養(yǎng)出的細(xì)胞有形態(tài)沒(méi)功能，不能用于臨床治療。申請(qǐng)?zhí)?00610106875. 5名稱(chēng)一種有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法。缺點(diǎn)此試劑盒及其應(yīng)用方法所用的HIST0PAGUE 1077為密度1. 077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液， 經(jīng)此分離后的細(xì)胞絕大多數(shù)為淋巴細(xì)胞，這樣導(dǎo)致細(xì)胞中能夠用于治療的干細(xì)胞占少數(shù)， 影響臨床療效。申請(qǐng)?zhí)?00710137781. 9名稱(chēng)骨髓臍帶血干細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法。缺點(diǎn)該試劑盒的使用中添加了 Iin抗體，導(dǎo)致成本大大提高，投入到臨床使用后，給中低收入患者造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致患者看不起病，接受不起細(xì)胞治療，并且使用了 Iin抗體對(duì)細(xì)胞清洗造成了較大負(fù)擔(dān)，此種物質(zhì)進(jìn)入人體后會(huì)發(fā)生何種變化還是未知數(shù)。
背景技術(shù)：
中需要解決的技術(shù)問(wèn)題治療成本高。完成細(xì)胞分離工作的儀器設(shè)備(如血細(xì)胞分離機(jī)及流式細(xì)胞儀)價(jià)格昂貴，導(dǎo)致治療成本升高，增加了患者的治療費(fèi)用，不利于項(xiàng)目的推廣和普及。細(xì)胞活性低。免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀法篩選出來(lái)的均是被標(biāo)記了的細(xì)胞，這些分選方法均存在篩選細(xì)胞范圍小、細(xì)胞負(fù)重后活性降低以及標(biāo)記物留在人體內(nèi)會(huì)變成什么還是未知等問(wèn)題。細(xì)胞液體積大。使用血細(xì)胞分離機(jī)分離的一般為外周血，且需要采集前打2-7天動(dòng)員劑，將骨髓中干細(xì)胞動(dòng)員到外周血里，經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)分離后篩選出的細(xì)胞液體積較大，一般都超過(guò) 50ml，且紅細(xì)胞去除不干凈。最后得到的細(xì)胞懸液體積大、質(zhì)量不佳，只能用于自體皮下注射。獲取細(xì)胞時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。培養(yǎng)擴(kuò)增一周后才能用于臨床治療，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)延誤治療的最佳時(shí)機(jī)，影響治療效果，培養(yǎng)期間造成污染率提高。傳統(tǒng)的分離方法僅限于實(shí)驗(yàn)室及科研使用。許多分離方法操作過(guò)程繁瑣，對(duì)人員的專(zhuān)業(yè)要求較高，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。從實(shí)驗(yàn)方法到臨床應(yīng)用還需要技術(shù)改進(jìn)。不能產(chǎn)業(yè)化。實(shí)驗(yàn)成本高、操作環(huán)節(jié)中污染機(jī)率大、細(xì)胞液的保存運(yùn)輸條件不備，導(dǎo)致提取的細(xì)胞液數(shù)量有限，滿(mǎn)足不了臨床治療的大量需求。以上專(zhuān)利文獻(xiàn)公開(kāi)的試劑盒或其使用方法存在的缺點(diǎn)。以上相關(guān)專(zhuān)利文獻(xiàn)公開(kāi)的試劑盒或方法存在原料來(lái)源復(fù)雜，配制繁瑣，對(duì)于分離哪種血液針對(duì)性不強(qiáng)(因?yàn)槿祟?lèi)血和動(dòng)物血細(xì)胞存在一定差異)，獲得的分離液用與治療難以控制等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血中干細(xì)胞分離試劑盒及使用試劑盒分離人類(lèi)骨髓干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞或外周血干細(xì)胞的方法，提高人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血中干細(xì)胞的分離數(shù)量和回收率，同時(shí)克服現(xiàn)有技術(shù)中造價(jià)高，有標(biāo)記物，需要打動(dòng)員劑造成患者痛苦，獲取時(shí)間長(zhǎng)，繁瑣不適用臨床等缺陷。為臨床治療提供干細(xì)胞分離效率更高的人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞分離試劑盒，提高骨髓、臍帶血或外周血的利用效率。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人設(shè)計(jì)了多種方案，在進(jìn)行了大量的試驗(yàn)和對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析后，驚奇的發(fā)現(xiàn)在分離干細(xì)胞的過(guò)程中，加入適量腦蛋白水解物(市售) 有助于提高目標(biāo)干細(xì)胞的回收數(shù)量，而對(duì)目標(biāo)干細(xì)胞的存活率不產(chǎn)生不利影響。本發(fā)明提供的試劑盒及其使用方法能夠分離人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血中的干細(xì)胞，具體是將試劑盒中1號(hào)2號(hào)3號(hào)試劑組合應(yīng)用，體外分離人類(lèi)骨髓、人類(lèi)臍帶血或外周血，得到其中的干細(xì)胞。本發(fā)明的試劑盒由1號(hào)液、2號(hào)液和3號(hào)液組成，所述百分比(％ )均為重量百分比(W/W)，密度單位g/ml，1號(hào)液、2號(hào)液和3號(hào)液的溶劑均為水。1號(hào)液(稀釋劑)0. 1% -30%氯化鈉注射液或pH7-7. 5的磷酸鹽緩沖液(PBS) 液，分別加入0. 1% -20%的腦蛋白水解物，溶劑為水。2號(hào)液(沉淀劑)0· -30%羥乙基淀粉或0. 1% -30%甲基纖維素水溶液。3號(hào)液(分層液)由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 0-1. 2g/ml的分層液組成，配有500ml大容量培養(yǎng)液瓶，免除臨床現(xiàn)有少量多次分離干細(xì)胞的繁瑣過(guò)程，大大降低了污染機(jī)率。其中，上述1號(hào)液和2號(hào)液經(jīng)過(guò)100°C _130°C，10分鐘-50分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)毒素含量彡0. 5EU/ml，裝瓶。上述3號(hào)液經(jīng)過(guò)100°C -130°C, 10分鐘-50分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)毒素含量彡IEU/ ml,裝瓶。本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案為1號(hào)液0. 3-12%氯化鈉注射液或pH7. 1-7. 4的磷酸鹽緩沖液，分別加入0. 3-15% 的腦蛋白水解物形成的溶液。2號(hào)液0. 5-18%羥乙基淀粉或0. 2_8%甲基纖維素。3號(hào)液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 01-1. 088g/ml的分層液。本發(fā)明更加優(yōu)選的技術(shù)方案為1號(hào)液0. 5-2%氯化鈉注射液或pH7. 2_7. 4的磷酸鹽緩沖液，分別加入0. 8_6%的腦蛋白水解物形成的溶液；2號(hào)液1. 5-12%羥乙基淀粉或0. 3_5%甲基纖維素；3號(hào)液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 035-1. 080g/ml的分層液。本發(fā)明最優(yōu)選的技術(shù)方案為1號(hào)液0. 9%氯化鈉注射液或pH7. 4的磷酸鹽緩沖液，分別加入3%的腦蛋白水解物形成的溶液。2號(hào)液6%羥乙基淀粉或0. 5%甲基纖維素。
3號(hào)液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 075g/ml的分層液。本發(fā)明所述的人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞處理試劑盒的使用方法為將含有枸櫞酸鈉抗凝液的骨髓、臍帶血加入到含有1號(hào)液的大容量培養(yǎng)液瓶中，再加2號(hào)液混勻，靜置，待分層后吸取上層細(xì)胞液離心濃縮后鋪到3號(hào)液上層，然后離心分出干細(xì)胞層， 搜集干細(xì)胞層后用生理鹽水清洗，待用。從以上人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞分離試劑盒技術(shù)方案中可以看出，與現(xiàn)有技術(shù)中分離干細(xì)胞的方法不同，在本發(fā)明的技術(shù)方案中去除了人類(lèi)骨髓、人類(lèi)臍帶血或外周血中的紅細(xì)胞，血漿，血小板，血紅蛋白，粒細(xì)胞等，經(jīng)過(guò)本發(fā)明分離的干細(xì)胞回收率能夠達(dá)到85%以上。并且干細(xì)胞存活率檢測(cè)大于98%本項(xiàng)發(fā)明優(yōu)點(diǎn)1、分離血液針對(duì)性強(qiáng)只分離人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血。2、原料簡(jiǎn)單易得，成本低廉，并且加入了簡(jiǎn)單易得的腦蛋白水解物提高干細(xì)胞分離回收數(shù)量。3、干細(xì)胞得率高，完全滿(mǎn)足臨床需求。4、干細(xì)胞處理試劑盒內(nèi)1號(hào)，2號(hào)和3號(hào)液內(nèi)毒素均符合臨床使用要求，不會(huì)造成患者發(fā)熱等現(xiàn)象。5、在最低的價(jià)格，最簡(jiǎn)便的分離方法下分離出治療所需要的干細(xì)胞。6、對(duì)環(huán)境及干細(xì)胞本身不會(huì)造成任何污染，是臨床上迫切需要的一種分離干細(xì)胞的試劑盒及方法。是目前分離提取方法中可操作性強(qiáng)、臨床安全性高、便于臨床推廣的最好技術(shù)方案；同時(shí)本試劑盒易于存儲(chǔ)運(yùn)輸、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、使用方便快捷。經(jīng)由本發(fā)明人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞處理試劑盒分離的干細(xì)胞具有造價(jià)低，保留原有干細(xì)胞活性，干細(xì)胞液體積小，干細(xì)胞種類(lèi)齊全，分離操作時(shí)間短1小時(shí)左右即可完成，干細(xì)胞數(shù)量能夠滿(mǎn)足臨床治療的需要等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是使用本發(fā)明的干細(xì)胞處理試劑盒，分離人類(lèi)骨髓得到的干細(xì)胞的顯微照片；圖2是使用本發(fā)明的干細(xì)胞處理試劑盒，分離人類(lèi)臍帶血得到的干細(xì)胞的顯微照片；圖3是使用本發(fā)明的干細(xì)胞處理試劑盒，分離人類(lèi)外周血得到的干細(xì)胞的顯微照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 分離人類(lèi)臍帶血試劑盒組成1號(hào)液稀釋劑PBS液氯化鈉4g，氯化鉀0. Ig, 12水磷酸氫二鈉1. 445g，磷酸二氫鉀0. Ig先用少量水溶解上述試劑，然后加水至500ml，即得，用前用5. 6%碳酸鈉調(diào)節(jié)PH至7-7. 5。加入3%腦蛋白水解物(市售，配制成3%的水溶液)。2號(hào)液沉淀劑6%羥乙基淀粉(市售)3號(hào)液分離液將聚蔗糖與泛影葡胺制成密度1. 075g/ml的分離液。上述1號(hào)液和2號(hào)液經(jīng)過(guò)100°C _130°C，10分鐘-50分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)毒素含量彡0. 5EU/ml，裝瓶。上述3號(hào)液經(jīng)過(guò)100°C _130°C，10分鐘-50分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)毒素含量彡lEU/ml，裝瓶。操作方法將含有枸櫞酸鈉抗凝液的實(shí)驗(yàn)用人類(lèi)臍帶血(ml數(shù)見(jiàn)表1)平均分成兩份，取其中一份加入到含有20-350ml的1號(hào)液中，再加入4_200ml2號(hào)液，搖勻1_8分鐘，放置3分鐘-3小時(shí)，待分層后吸取上層細(xì)胞液，分裝至50ml離心管中，以500-4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1-20分鐘，搜集下層細(xì)胞液，用生理鹽水稀釋后鋪在號(hào)液3液上，以500-4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1-60分鐘，收集中間干細(xì)胞層后，用生理鹽水清洗1-5次，再用生理鹽水稀釋至臨床使用體積即得，甲組數(shù)據(jù)。取實(shí)驗(yàn)用另一半臍帶血，按照市售分離試劑說(shuō)明書(shū)提供的方法分離，得到乙組，如下表所示甲組為本發(fā)明設(shè)計(jì)的干細(xì)胞處理試劑盒組，乙組為市售分離試劑組，從數(shù)據(jù)上顯示，甲組數(shù)量明顯高于乙組。表1 人類(lèi)臍帶血使用本發(fā)明干細(xì)胞處理試劑盒及市售分離試劑分離出的干細(xì)胞數(shù)量比較
權(quán)利要求
1.一種人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞處理試劑盒，所述的干細(xì)胞處理試劑盒由1 號(hào)液、2號(hào)液和3號(hào)液組成，所述百分比(％)均為重量百分比(W/W)，密度單位g/ml，l號(hào)液、2號(hào)液和3號(hào)液的溶劑均為水；1號(hào)液0. 1% -30%氯化鈉注射液或PH7-7. 5的磷酸鹽緩沖液，分別加入0. 1% -20% 的腦蛋白水解物形成的溶液；2號(hào)液0. 1% -30%羥乙基淀粉或0. 1% -30%甲基纖維素； 3號(hào)液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 0-1. 2g/ml的分層液組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞處理試劑盒，其特征在于1號(hào)液0. 3-12%氯化鈉注射液或pH7. 1-7. 4的磷酸鹽緩沖液，分別加入0. 3-15%的腦蛋白水解物形成的溶液；2號(hào)液0. 5-18%羥乙基淀粉或0. 2-8%甲基纖維素； 3號(hào)液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 01-1. 088g/ml的分層液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞處理試劑盒，其特征在于1號(hào)液0. 5-2%氯化鈉注射液或pH7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液，分別加入0. 8_6%的腦蛋白水解物形成的溶液；2號(hào)液1. 5-12%羥乙基淀粉或0. 3-5%甲基纖維素； 3號(hào)液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 035-1. 080g/ml的分層液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞處理試劑盒，其特征在于1號(hào)液0. 9%氯化鈉注射液或pH7. 4的磷酸鹽緩沖液，分別加入3%的腦蛋白水解物形成的溶液；2號(hào)液6%羥乙基淀粉或0. 5%甲基纖維素； 3號(hào)液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 075g/ml的分層液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的干細(xì)胞處理試劑盒，其特征在于其中，所述的1號(hào)液到3號(hào)液是經(jīng)過(guò)溫度為100°C -130°C，時(shí)間為10分鐘-50分鐘滅菌的液體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的干細(xì)胞處理試劑盒，其特征在于其中，所述的1號(hào)液到3號(hào)液是經(jīng)過(guò)溫度為105°C -120°C，時(shí)間為15分鐘-20分鐘滅菌的液體。
7.一種人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞處理的方法，所述方法包括將骨髓、臍帶血或外周血樣品加入到含有1號(hào)液的大容量培養(yǎng)液瓶中，再加2號(hào)液混勻，靜置，待分層后吸取上層細(xì)胞液離心濃縮后鋪到3號(hào)液上層，然后離心分出干細(xì)胞層。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞分離的方法，其特征在于離心分離的離心機(jī)轉(zhuǎn)速為500-4000轉(zhuǎn)/分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血中干細(xì)胞處理試劑盒及干細(xì)胞分離方法，所述試劑盒由1號(hào)液、2號(hào)液和3號(hào)液組成，在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明在1號(hào)液中加入了腦蛋白水解物，有效提高了處理樣品的干細(xì)胞回收數(shù)量。使用本發(fā)明的試劑盒分離人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血針對(duì)臍帶血樣品，分離后細(xì)胞回收總數(shù)提高了5.9-15.8％，分離后CD34干細(xì)胞回收總數(shù)提高了5.0-8.8％；針對(duì)骨髓樣品，分離后細(xì)胞回收總數(shù)提高了8.7-21％，分離后CD34干細(xì)胞回收總數(shù)提高了8.4-11％。針對(duì)外周血樣品，分離后細(xì)胞回收總數(shù)提高了23.1-46.7％，分離后CD34干細(xì)胞回收總數(shù)提高了10.8-25.6％，目標(biāo)干細(xì)胞分離回收率的提高，可以有效節(jié)約人類(lèi)骨髓、臍帶血或外周血樣品，提高樣品的使用效率。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK102154201SQ201110026680
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者唐明淇 申請(qǐng)人:唐明淇