專利名稱：：治療神經(jīng)病理性疼痛的組合物及方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及在哺乳動物中采用SIP30拮抗劑治療神經(jīng)病理性疼痛。
背景技術：
：神經(jīng)病理性疼痛是一種復雜的慢性疼痛狀態(tài)，通常伴有組織損傷。神經(jīng)病理性疼痛中，神經(jīng)纖維本身可能是受損的、功能有障礙的或者是損傷的。這些受損的神經(jīng)纖維將錯誤的信號發(fā)送給其它痛覺中心。神經(jīng)病理性疼痛的臨床病因非常廣泛，既包括外傷也包括疾病。例如，大腦或脊髓的外傷性神經(jīng)壓迫或神經(jīng)擠壓和外傷性損傷是神經(jīng)病理性疼痛的常見病因。此外，大多數(shù)外傷性神經(jīng)損傷還會引起神經(jīng)瘤的形成，此時，疼痛則是神經(jīng)異常再生的結(jié)果。另外，當腫瘤生長強烈壓迫到臨近的神經(jīng)(大腦或脊髓)時便會引發(fā)癌癥相關性神經(jīng)病理性疼痛。神經(jīng)病理性疼痛還和例如糖尿病或酒精中毒等疾病相關。遺憾的是，目前神經(jīng)病理性疼痛的的藥物治療方法常常不足以緩解需要此項治療的患者的疼痛。除此以外，目前的治療還有嚴重的副作用，包括，例如認知改變、鎮(zhèn)靜作用和惡心，在麻醉藥物治療時還會成癮。很多神經(jīng)病理性疼痛的患者都是老年人，或者正罹患其它疾病，這尤其限制其對目前藥物治療副作用的耐受力。為數(shù)眾多的抗炎藥、抗焦慮藥、麻醉劑，甚至抗驚厥藥物都被從業(yè)醫(yī)師用于治療神經(jīng)病理性疼痛但是療效甚微。目前的緩解神經(jīng)病理性疼痛的治療方法的不足急需新的組合物及方法來滿足患有這種疾患的病人的生理和社會需求。減輕神經(jīng)病理性疼痛的方法可以改善那些由外傷或疾病引起的神經(jīng)病理性疼痛的患者的生活質(zhì)量。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供治療由SIP30調(diào)控的神經(jīng)病理性疼痛的化合物、組合物、方法和系統(tǒng)滿足了前述需求。申請人出人意料地發(fā)現(xiàn)，SIP30拮抗劑能有效治療神經(jīng)病理性疼痛。本發(fā)明還提供了一種篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟提供包含至少部分SIP30多肽的樣品；將待測化合物加入到所述樣品的至少第一部分中；將來自于樣品至少第一部分的至少一個參數(shù)與來自于樣品至少第二部分的至少一個參數(shù)進行比較，其中樣品的至少第二部分不包括待測化合物。本申請還包括測定一種物質(zhì)與SIP30樣分子蛋白相互作用的能力，包括以下步驟a)提供一種SIP30樣分子多肽，該多肽包括選自從序列SEQIDBI到序列SEQIDB130中的任何一種序列的連續(xù)氨基酸序列；和幻測定所述物質(zhì)與SIP30樣分子相互作用的能力。圖I描述了接受慢性壓迫性損傷(chronicconstrictioninjury,CCI)手術的大鼠熱痛覺過敏和機械性痛覺異常的迅速發(fā)生，顯示慢性壓迫性坐骨神經(jīng)損傷后機械性痛覺異常(A)和熱痛覺過敏(B)發(fā)展的時間進程(和非CCI手術損傷腳爪相比P<O.05)。圖2描述了哺乳動物SIP30直系同源基因氨基酸的序列對比顯示高度序列同源性，暗示它們具有相似的功能。對公共數(shù)據(jù)庫中的所有哺乳動物SIP30的氨基酸序列進行了比對，序列比對的間隙顯示為空白區(qū)。與人類SIP30序列相同的氨基酸殘基表示為破折號(_)。下劃線代表假定卷曲螺旋結(jié)構域。每個物種的普通名、拉丁名和3字母縮寫如下人-Homosapiens-Hsa、黑猩猩-Pantroglodytes-Ptr、恒河猴-MacacaMulatta-Mml>犬-Canislupusfamiliaris_Cfa、豬-Susscrofa-Ssc、牛-Bostaurus-Bta、小鼠-Musmusculus-Mmu和大鼠-RattusNorvegicus-Rno。圖3描述了SIP30在正常大鼠中的表達模式。(A)SIP30在大鼠不同組織表達的Northern印跡分析兩千堿基(kb)大小的SIP30mRNA用箭頭標記，18S核糖體RNA作為上樣的內(nèi)對照；每個泳道RNA的組織來源在圖的上部標示(橫穿凝膠上部標示)。(B)SIP30在背根神經(jīng)節(jié)(dorfsalrootganglion,DRG)的表達。采用抗SIP30抗體(圖a)、IB4抗體(圖b)和降鈣素基因相關肽(CGRP)抗體(圖c)進行免疫染色。兩兩重疊組合圖像顯示SIP30和IB4重疊組合圖像(圖d)、SIP30和CGRP重疊組合圖像(圖e)以及IB4和CGRP重疊組合圖像(圖f)。白色箭頭標記的是雙染色的細胞。(C)SIP30在脊髓中的表達采用抗SIP30抗體(圖a)、抗P物質(zhì)抗體(圖b)和抗CGRP抗體(圖c)進行免疫染色。重疊組合圖像顯示如下SIP30和P物質(zhì)重疊組合圖像(圖d)、SIP30和CGRP(圖e)以及SIP30、P物質(zhì)和CGRP三種組分重疊組合圖像(圖f)。圖4顯示CCI過程上調(diào)了SIP30。(A)SIP30mRNA在脊髓的水平(圖上部分)和在DRG(圖下部分)的水平。實時PCR擴增結(jié)果顯示了和正常組動物平均水平相比的SIP30mRNA。收集非手術組(正常組)、假CCI手術組(shamCCI，假手術組)或CCI手術組(分別是術后3天和7天組)大鼠脊髓組織，從假手術組和CCI手術組同側(cè)和對側(cè)分離RNA進行實時PCR分析。CCI術后3天和7天，同側(cè)脊髓都能觀察到顯著性差異(和正常組或假手術組相比P<O.05)，但在對側(cè)沒有觀察到顯著性差異。DRG沒有觀察到顯著性差異。(B)脊髓中SIP30蛋白水平的Western印跡分析。收集假手術組或CCI手術組(術后3天)大鼠的脊髓組織，從假手術組或CCI手術組同側(cè)和對側(cè)分離蛋白進行Western印跡分析。圖上部分代表SIP30蛋白的Western帶。β-肌動蛋白作為內(nèi)對照。圖下部分是SIP30蛋白的定量結(jié)果，脊髓同側(cè)有顯著性差異(和假手術組相比P<O.05)。(C)DRG中SIP30蛋白水平的Western印跡分析。收集假手術組或CCI手術組大鼠的DRG組織(術后3天)，從假手術組或CCI手術組大鼠的同側(cè)和對側(cè)分離蛋白進行Western印跡分析。圖上部分代表SIP30蛋白的Western帶。β-肌動蛋白作為內(nèi)對照。圖下部分是SIP30蛋白的定量結(jié)果。DRG的同側(cè)和對側(cè)都沒有觀察到顯著性差異。(D)CCI術后同側(cè)脊髓背角SIP30蛋白水平增力口。圖(a):免疫熒光分析顯示正常大鼠(naiverats)中SIP30-IR細胞的本底表達；圖(b)和圖(b'):免疫熒光分析顯示CCI同側(cè)脊髓背角SIP30-IR細胞增加(b，5X;b'10X)；圖(C):SIP30在背角表層(I-II層)和深部(IV-V層)的表達水平定量(用30μm切片中SIP30-IR細胞的數(shù)目表示)(與對照組相比，P<O.05，n=5；ANOVA)。(E)SIP30在CCI脊髓的定位。圖(a):CCI手術3天后，SIP30(紅色)和NeuN(—種神經(jīng)元標記物，綠色)在脊髓背角共定位(20X)。圖(b):圖(a)框內(nèi)部分的放大圖像的疊加圖像(左圖)和未疊加的圖像(右上圖和右下圖)(40X)。圖(c):雙免疫熒光染色顯示，CCI術后3天，SIP30(紅色)與GFAP(綠色)在背角沒有共染色區(qū)域。圖(d):雙免疫熒光染色顯示，CCI術后3天，SIP30(紅色)與(OX-42)(綠色)在背角沒有共染色區(qū)域。SIP30與GFAP或OX-42的染色沒有重疊。圖5顯示SIP30參與了外周神經(jīng)損傷誘導的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展和維持的調(diào)節(jié)。㈧鞘內(nèi)注射SIP30反義寡核苷酸(AS0DN)4天(從第O天到CCI術后第3天)，CCI同側(cè)腳爪("Ipsi.f")因CCI發(fā)生的機械性痛覺異常(圖a)和熱痛覺過敏(圖b)得以減少(和NS或麗組相比P<O.05)，而NS和麗ODN沒有效果。同樣處理后(圖c，d)，對側(cè)腳爪("Cont.")沒有任何變化。(B)鞘內(nèi)注射第二種SIP30AS0DN(SIP30ASII，靶向SIP30基因編碼區(qū)第143-162位核苷酸)4天后(從第O天到CCI術后第3天)，機械性痛覺異常(圖a)和熱痛覺過敏(圖b)在CCI同側(cè)腳爪減輕(和RD組相比P<O.05，p<O.01)，而隨機寡核苷酸(RD0DN)沒有效果。同樣處理后(圖c，d)，對側(cè)腳爪沒有變化。(C)產(chǎn)生機械性痛覺異常和熱痛覺過敏后，鞘內(nèi)注射SIP30ASODN4天(從CCI術后第3天到第7天)能顯著抑制CCI同側(cè)腳爪的機械性痛覺異常和熱痛覺過敏(和NS組或麗組相t匕，P<O.05)，而NS組和麗ODN組則沒有效果。同樣處理后(圖c，d)，對側(cè)腳爪沒有變化。(D)在正常大鼠(naiverats)鞘內(nèi)注射SIP30ASODN4天對于雙側(cè)腳爪對VonFrey刺激(圖a)或熱刺激(圖b)的基礎反應都沒有影響。圖6顯示用抗-SIP30的反義寡核苷酸敲降SIP30和SNAP25水平。(A)CCI術后SIP30mRNA增加，這種增加可以被反義寡核苷酸(ODN)削弱。鞘內(nèi)注射SIP30反義寡核苷酸(AS)或錯義(MM)ODN4次后，最后一次注射6小時后，處死大鼠切下腰髓。實時PCR擴增顯示，接受SIP30ASODN的CCI大鼠和接受麗ODN的CCI大鼠相比同側(cè)脊髓SIP30mRNA顯著降低(P<O.05)。虛線顯示假CCI手術組大鼠的mRNA水平。(B)Western印跡顯示，接受SIP30ASODN的CCI大鼠和接受麗ODN或NS的CCI大鼠相比，同側(cè)脊髓SIP30蛋白顯著降低。圖上部分表示SIP30蛋白的Western帶。β-肌動蛋白作為內(nèi)對照。圖下部分是SIP30蛋白定量結(jié)果。虛線顯示假手術組的蛋白水平。(AS組，感覺這里應該說*是指AS組與NS或麗組相比差異顯著)和NS組或麗組相比有顯著性差異(P<O.05)。縮略語NS，生理鹽水；AS0DN，反義寡核苷酸；麗，錯義；0-3天，大鼠從第O天(CCI術前6小時)到CCI術后第3天鞘內(nèi)注射AS、麗或NS；4-7天，大鼠從CCI術后第4天開始到CCI術后第7天鞘內(nèi)注射AS、麗或NS。(C)實時PCR擴增顯示SNAP25mRNA在CCI術后同側(cè)脊髓顯著升高(和假手術組相比P<O.05)。鞘內(nèi)注射SIP30ASODN(每24小時一次X4次)導致CCI大鼠同側(cè)脊髓SNAP25mRNA有降低的趨勢(雖然沒有達到統(tǒng)計學顯著性差異)。(D)實時PCR擴增顯示CCI術后同側(cè)脊髓PSD95mRNA顯著升高(和假手術組相比p<O.05)。鞘內(nèi)注射SIP30ASODN(每24小時一次X4次)對PSD95mRNA水平?jīng)]有影響。圖7顯示，和對照組小鼠相比，在試驗的第4、6和8天，A組和B組SIP30小鼠腳爪回縮閾值和對照組相比顯著改變(*表示和對照組相比有顯著性差異，P<O.05，).具體實施例方式為了有助于理解本發(fā)明，提供了以下非限制性的定義術語"痛覺異常"是指對通常的非痛覺刺激的疼痛反應，可以是靜態(tài)的，也可以是機械性的。"痛覺異常"的病理生理學被認為不同于提及的疼痛，但可能發(fā)生在刺激區(qū)域之外。術語“基因”是指包含生產(chǎn)多肽或其前體所必需的包括控制序列及編碼序列的DNA序列。所述多肽可以由完整長度的編碼序列(可以是基因組DNA或cDNA)編碼或由能保留預期活性的編碼序列的任何部分編碼。在某些方面，術語“基因”還指能編碼所述多肽或其前體的mRNA序列或其一部分。術語“轉(zhuǎn)染”是指細胞對外源DNA的攝取。當外源(異體)DNA被引入細胞膜內(nèi)時細胞被“轉(zhuǎn)染”。轉(zhuǎn)染可以是瞬時的(即引入的DNA停留在染色體之外并在細胞分裂時被稀釋)或穩(wěn)定的(即引入的DNA整合到細胞基因組中或維持為穩(wěn)定的染色體外單元)。術語“共轉(zhuǎn)染”指兩個或更多的載體同時或順序進入某一個細胞。術語“啟動子元件”或“啟動子”是指能與細胞中的RNA聚合酶結(jié)合(例如，直接結(jié)合或通過其他啟動子結(jié)合蛋白或啟動子結(jié)合物質(zhì)結(jié)合)并啟動編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。通常，啟動子序列的3’末端由轉(zhuǎn)錄起始位點界定，然后向上游延伸(5，方向)以包括在任何水平啟動轉(zhuǎn)錄必需的最少數(shù)量的堿基或元件。在啟動子序列中可能會發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點(例如，可用核酶SI圖譜來方便確定)以及負責結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)(一致序列)。啟動子可以可操作地與其他表達調(diào)控序列(包括增強子或抑制子)結(jié)合。術語“可操作地結(jié)合”，“以可操作的順序”或“可操作地連接”是指該核酸序列的連接方式使得能指導某一特定基因轉(zhuǎn)錄和/或某一目標蛋白合成的核酸分子能夠產(chǎn)生。該術語還指氨基酸序列以能產(chǎn)生功能蛋白的方式連接。術語“載體”是指能將基因序列轉(zhuǎn)移到靶細胞中的核酸組裝體(如病毒載體、非病毒載體、微粒載體和脂質(zhì)體)。術語“表達載體”是指含有能指導目的序列或基因在細胞中表達的啟動子的核酸組裝體。載體通常含有編碼選擇標記物的核酸序列，以選擇那些被載體轉(zhuǎn)染的細胞。通常，“載體構建”、“表達載體”和“基因轉(zhuǎn)移載體”是指任何能指導目的基因表達并能將基因序列轉(zhuǎn)移到靶細胞的核酸構建體。因此，該術語除了包括病毒載體還包括克隆和表達載體。術語“抗體”是指完整的抗體(包括多克隆抗體和單克隆抗體)或其片段(例如，F(xiàn)(ab)2、Fab、FV、VH或VK片段、單鏈抗體、多亞基單特異性抗體或其片段、雙特異性/多異性抗體或其片段。該術語還包括人源化抗體和嵌和抗體。術語“SIP30”是指編碼一個與266個氨基酸的與SNAP25蛋白質(zhì)相互作用的30kDa的蛋白質(zhì)的核酸序列。SIP30在神經(jīng)組織中表達非常豐富，在睪丸和腎也有少量表達。術語“SIP30相關”是指從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130所列的任何核酸序列。術語“SIP30拮抗劑”是指任何單獨或聯(lián)合作用能阻止、抑制、減少或中和SIP30的表達或其活性，直接或間接調(diào)控誘導神經(jīng)病理性疼痛的中間體神經(jīng)垂體素II(“NPII”)活性的物質(zhì)、化合物和組合物，合成的或天然的，包括但不限于反義核酸序列、siRNA、抗體和小分子實體。術語“SNAREs”是指一種類型的NPII，它是可溶性N-乙基馬來酰亞胺-敏感因子附著蛋白受體，對于神經(jīng)傳遞中突觸小泡的胞吐作用的調(diào)控起著關鍵作用，包括但不限于25kDa的突觸相關蛋白(SNAP25)、突觸融合蛋白、突觸小泡-相關膜蛋白(VAMP)。術語“治療”疾病或疾病的“治療”是指實施一種方案，該方案可以包括給人類或其他患者使用一種或多種藥物，以期減弱該疾病的癥狀或體征。減弱可以發(fā)生在疾病的癥狀或體征出現(xiàn)之后也可以發(fā)生在疾病的癥狀或體征出現(xiàn)之前。因此，“治療”疾病或疾病的“治療”包括“預防”疾病或疾病的“預防”，“治療”疾病或疾病的“治療”不需要完全消除癥狀或體征，不需要治愈，并且特別地包括對患者只有微小效果的方案。術語“患者”是指可以對其進行治療的生物系統(tǒng)。該生物系統(tǒng)可能包括例如單個細胞、一組細胞(如細胞培養(yǎng)物)、器官、組織或多細胞生命體?；颊呖梢灾溉祟惢颊呋蚍侨祟惢颊摺Ｐg語“痛覺過敏”是指對疼痛敏感性增加，可能是由于傷害性感受器或外周神經(jīng)的損傷引起。本發(fā)明旨在提供治療由SIP30調(diào)控的神經(jīng)病理性疼痛的化合物、組合物、方法和系統(tǒng)。申請人出人意料地發(fā)現(xiàn)SIP30拮抗劑可以有效治療神經(jīng)病理性疼痛。申請人發(fā)現(xiàn)SIP30拮抗劑，包括但不限于核苷酸、小干擾RNA(SiRNA)分子、與至少部分SIP30核酸序列反應的天然的或人工合成的化合物，能直接或間接通過調(diào)節(jié)NPII活性有效抑制SIP30表達從而提供了一種治療SIP30引起的疼痛的方法。本發(fā)明另一方面，提供能改變SIP30依賴性中間體蛋白的構象從而拮抗SIP30表達的小分子。在本發(fā)明的另一個實施方式中，拮抗劑的效果可以通過具有特異性底物結(jié)合位點(該位點與一個或多個靶核酸區(qū)域或靶RNA的一部分互補(即可形成堿基對))的siRNA來實現(xiàn)。優(yōu)選地，這種互補是100%，然而如果需要，這種互補可以更低，諸如可以是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。因此，本發(fā)明的一個方面提供了DNA片段、多肽、化合物及其組合物在患病區(qū)拮抗SIP30表達和/或活性的用途。本發(fā)明的另一方面在于提供能拮抗NPII活性的人工合成的或天然的化合物。而本發(fā)明的另外一個方面旨在提供將適合的分子遞送到引發(fā)神經(jīng)病理性疼痛的目標區(qū)域的植入儲庫。本發(fā)明的至少一個方面旨在提供與至少部分誘導神經(jīng)病理性疼痛的核酸序列反應的、能抑制NPII或任何誘導相關的疼痛的細胞因子在細胞中表達的核酸分子。本發(fā)明的另一方面在于使得本領域的普通技術人員應用設計的分子實體、組合物和/或其他能通過抑制、中和或減少SIP30在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)作中的級聯(lián)作用從而減弱神經(jīng)病理性疼痛的治療方式。本發(fā)明的另一方面，發(fā)明人提出了治療神經(jīng)病理性疼痛的治療方法，所述神經(jīng)病理性疼痛包括脊髓介導的疼痛、外周神經(jīng)損傷相關的疼痛、椎間盤脫出相關疼痛、腕管綜合征(Carpeltunnelsyndrome)、多發(fā)性硬化癥、纖維肌痛、帶狀皰疫、HIV-相關神經(jīng)病理性疼痛、疼痛性創(chuàng)傷性單神經(jīng)病變、疼痛性多神經(jīng)病變(尤其是糖尿病引起的)、中樞疼痛綜合征(可能由神經(jīng)系統(tǒng)的任何水平的病灶引起)、術后疼痛綜合征(如乳腺切除術后綜合征、開胸手術后綜合癥和幻覺痛)，以及復雜的區(qū)域性疼痛綜合征(反射性交感神經(jīng)萎縮癥和灼性神經(jīng)痛)。本發(fā)明的另一方面是提供一種表達載體，該表達載體包含至少一個編碼與至少部分SIP30核酸序列反應的、能抑制疼痛介質(zhì)在細胞中表達的siRNA分子的DNA序列，該DNA序列可操作地連接到能指導所述siRNA分子在宿主細胞中表達的遺傳控制元件。本發(fā)明的另一方面是提供一種治療患有神經(jīng)病理性疼痛的機體的方法，該方法包括給所述機體施用選自以下一組化合物中的至少一種化合物:與SIP30核酸序列和/或SIP30蛋白的至少一部分反應并能拮抗其活性的反義序列、siRNA分子、多肽和小分子。本發(fā)明的另一方面旨在提供一種治療患有神經(jīng)病理性疼痛的患者的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括至少一種反義或siRNA分子、多肽或小分子，可以單獨使用或聯(lián)合使用，或進一步與其他神經(jīng)病理性疼痛治療方法或形式合用，以及最終將所述化合物導入患者靶組織的工具。本發(fā)明的另一方面提供了候選化合物，包括與SIP30核酸序列的至少一部分反應并能通過注射、泵或儲庫導入靶組織的反義序列、siRNA分子。本發(fā)明的在應用時，可以在機體靶位點或其附近植入儲庫植入物。這些位點的非限制性的例子包括發(fā)炎的神經(jīng)、大腦或脊髓中受壓迫的神經(jīng)位點或其周圍的軟組織。在本發(fā)明的另一實施方式中，在患病位置放置了siRNA儲庫植入物。在本發(fā)明的其它實施方式中，可在患者的肩部、髖部、其它關節(jié)或脊柱中放置藥物儲庫植入物。在一種實施方式中，為了方便起見，采用導管作為一種或多種SIP30拮抗劑分子的靶向給藥系統(tǒng)。在另一種實施方式中，采用注射針管作為靶向給藥系統(tǒng)。本發(fā)明的一個方法中，靶向給藥系統(tǒng)包括藥物儲庫植入系統(tǒng)通過在靶位點或其附近插入導管局部給藥，所述導管具有一個近端和一個遠端，所述的遠端具有用于SIP30拮抗劑原位遞送給藥的開口，所述近端通過液體連接到藥物給藥泵。例如，所述導管的近端可以在靶位點10厘米范圍內(nèi)用于分子給藥，尤其是可以在靶位點5厘米范圍內(nèi)給藥。本發(fā)明的藥物儲庫植入物的一種實施方式中，SIP30拮抗劑可抑制由TNF-α、IL-UIL-6和其他誘導疼痛的細胞因子介導的其他疼痛介質(zhì)。在本發(fā)明的一種實施方式中，適合的化合物還進一步包括改變釋放途徑的藥物組合物。該系統(tǒng)可以進一步包括兩種或更多的分子組合。在另一種實施方式中，采用導管而不是儲庫。在這種實施方式中，所述導管具有一個近端和一個遠端，所述的遠端具有用于SIP30拮抗劑原位給藥的開口，所述近端通過液體連接到藥物給藥泵。為了更好理解本發(fā)明的原理，在最優(yōu)選的實施方式中使用了參考文獻和特定的語言進行描述。然而不能因此理解為意欲限制本發(fā)明的范圍，這些變化和本發(fā)明進一步的改進，以及本發(fā)明所描述的原理的其它應用，對于本發(fā)明相關
技術領域：
普通技術人員來講都當理解為正常的。本發(fā)明特別指向了治療疼痛的組合物和方法，這是源于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抑制SIP30能減輕神經(jīng)病理性疼痛。在某些優(yōu)選的實施方式中，SIP30拮抗劑或相關分子可對在中央或局部引發(fā)神經(jīng)病理性疼痛的神經(jīng)直接給藥，或其附近的組織位點給藥?；诒景l(fā)明，本領域的技術人員可以推導出，能抑制SIP30的分子可以造成神經(jīng)病理性疼痛痛覺的減弱。因此，本發(fā)明的疼痛治療適用于神經(jīng)病理性疼痛，包括脊髓介導的疼痛、壓迫性損傷、外周神經(jīng)損傷相關的疼痛、椎間盤脫出相關疼痛、腕管綜合征(Carpeltunnelsyndrome)、多發(fā)性硬化癥、纖維肌痛、帶狀皰疹、HIV-相關神經(jīng)病理性疼痛、疼痛性創(chuàng)傷性單神經(jīng)病變、疼痛性多神經(jīng)病變(尤其是糖尿病引起的)、中樞疼痛綜合征(可能由神經(jīng)系統(tǒng)的任何水平的病灶引起)、術后疼痛綜合征(如乳腺切除術后綜合征、開胸手術后綜合癥和幻覺痛)，以及復雜的區(qū)域性疼痛綜合征(反射性交感神經(jīng)萎縮癥和灼性神經(jīng)痛)。在某些實施方式中，拮抗SIP30或其相關分子的物質(zhì)可以直接向神經(jīng)或在神經(jīng)附近的組織處給藥。本發(fā)明通過以下非限制性的實施例進行更充分描述。所引用的所有參考文獻在此以其全文并入本文作為參考。以下實施例中的數(shù)據(jù)顯示，SIP30是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展和維持的分子組分，用反義寡核苷酸拮抗SIP30可緩解神經(jīng)病理性疼痛慢性壓迫性損傷(CCI)大鼠模型的疼痛。發(fā)明人還表明，哺乳動物SIP30序列是高度相關的。因此，本發(fā)明提供了通過拮抗SIP30治療任何種類的哺乳動物神經(jīng)病理性疼痛的組合物和方法?；诒景l(fā)明，本領域的技術人員可以很容易地推導出，任何已知的拮抗方法(包括用諸如寡核苷酸拮抗SIP30mRNA的產(chǎn)生、或用化合物和/或抗體拮抗SIP30蛋白)都能產(chǎn)生本發(fā)明公開的緩解疼痛的效果。另外，本領域技術人員可以很容易地推導出可以通過拮抗與SIP30相關的分子來緩解神經(jīng)病理性疼痛；這樣的分子可以是突觸小泡相關蛋白，和/或通常稱作SNAREs的分子(Ungar和Hughson,2003；Brunger,2005)。本發(fā)明提供了ー種能減輕疼痛的有利策略，所述疼痛是任何與能誘導或表達SIP30蛋白任何部分的醫(yī)學狀態(tài)相關或由能誘導或表達SIP30蛋白任何部分的過程引起的疼痛。SIP30在某些哺乳動物組織中很豐富。在大腦中，SIP30在上丘腦和下丘腦高度表達，上丘腦和下丘腦包含著重要的聽覺和視覺系統(tǒng)的中繼核。GST沉降試驗和免疫沉淀實驗表明，SIP30與SNAP25直接結(jié)合。雖然在GST-pull-down實驗中SIP30不直接與突觸融合蛋白直接發(fā)生相互作用，突觸融合蛋白確實與SIP30發(fā)生免疫共沉淀，這表明突觸融合蛋白可能是通過SNAP25間接與SIP30相關聯(lián)。本發(fā)明的發(fā)明人通過實施例公開了減輕與外周神經(jīng)損傷相關的神經(jīng)病理性疼痛的化合物和方法。在本發(fā)明的至少ー個方面，SIP30拮抗劑局部給藥能防止、降低或至少減少了系統(tǒng)給藥的主要副作用。在至少ー個實施方式中，使用低劑量的SIP30拮抗劑分子局部給藥可獲得目標靶位點SIP30拮抗劑的高濃度，減輕了系統(tǒng)副作用的風險。另外，本發(fā)明的另一方面還包括通過將SIP30拮抗劑單獨或與其他適合的藥物ー起結(jié)合到可局部或中樞釋放該藥物的生物可降解儲庫植入物，以實現(xiàn)藥物緩釋以長期緩解神經(jīng)病理性疼痛，所述的其他適合的藥物選自抗驚厥劑、抗炎藥、靶向不同離子通道的化合物、阿片類物質(zhì)、鈉通道阻斷劑、抗抑郁藥或麻醉劑，更具體地說，包括但不限于美西律、利多卡因、反胺苯環(huán)醇、嗎啡、阿芬他尼、克他命、甲基強的松、腺苷、甘氨酸拮抗劑、地昔帕明、文拉法辛和加巴噴丁。另ー方面，本發(fā)明采用能與SNAREs的至少部分SIP30細胞因子核酸序列對應的反義分子或siRNA分子，提供了抑制NPII或抑制誘導神經(jīng)病理性疼痛的細胞因子在細胞中表達試劑、方法和系統(tǒng)。申請人發(fā)現(xiàn)靶向NPII和相關細胞因子mRNA的SIP30拮抗劑能有效抑制誘導神經(jīng)病理性疼痛的細胞因子的表達，從而提供了在機體中治療疼痛的改進的方法。一方面，本發(fā)明的方法可以采用分子生物學常規(guī)技術來實現(xiàn)。公開了一般分子生物學方法的基礎教科書包括《分子克隆實驗手冊》(2001年第3版)(Sambix)Ok等)、《現(xiàn)代分子生物學技木》(1994)(Ausubel等)。與本發(fā)明相關的更專業(yè)的教科書包括《RNA干擾導致基因沉默，技術與應用》(2004)(Sohail)。本發(fā)明的一個大方面涉及一種分尚的核酸分子，所述核酸分子含有編碼與SNAP25相互作用蛋白編碼區(qū)第11-31位核苷酸互補的核酸序列(GenBank登錄號為BC063144)。具體而言，所述分離的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)能中和與相關神經(jīng)病理性疼痛現(xiàn)象相關的SIP30的上調(diào)。另外，本發(fā)明還g在提供包含這些核酸分子的載體，以及含有所述載體的宿主細胞。另ー方面，具體而言，本發(fā)明涉及所述蛋白質(zhì)本身。本發(fā)明第二個大方面涉及SIP30蛋白和SNAREs(包括大鼠SNAP和如圖2所示的所有哺乳動物SIP30的同源的或同源類似物的序列)的特異性抗體。在本發(fā)明的ー個具體方面，所述的抗體是多克隆抗體。在本發(fā)明另ー個具體方面，所述的抗體是單克隆抗體。本發(fā)明的第三大方面涉及在產(chǎn)生特異性神經(jīng)病理性疼痛的組織(例如，脊髄同側(cè))局部降低SIP30上調(diào)或中樞性降低SIP30上調(diào)的方法。在ー個具體方面，分離的核酸分子在載體內(nèi)，該載體可以是質(zhì)?；虿《?如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)。轉(zhuǎn)染可以發(fā)生在體外或通過直接注射分離的核酸分子發(fā)生在體內(nèi)。在一個替代的途徑中，SIP30拮抗劑的直接給藥也是可能的。在本發(fā)明另ー個大方面，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種測定適合的SIP30拮抗劑與SIP30樣分子蛋白(包括SNAREs)相互作用能力的方法，該方法包括a)提供ー種SIP30樣分子多肽，該多肽包括選自從序列SEQIDBI到序列SEQIDB130的任何ー種序列的連續(xù)的氨基酸序列；和b)測定所述物質(zhì)與SIP30樣分子相互作用的能力。在本發(fā)明更具體的一個實施方式中，測定所述物質(zhì)與SIP30樣分子相互作用能力的步驟包括測定所述物質(zhì)與SIP30樣分子的相互作用親和性。在另ー種實施方式中，發(fā)明人公開了ー種測定一種物質(zhì)與SIP30樣分子相互作用能力的方法，該方法包括a)提供一種重組SIP30樣分子多肽，該多肽由包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少35個連續(xù)的核苷酸序列編碼；b)使所述物質(zhì)與所述重組SIP30樣分子多肽接觸；和c)測定所述物質(zhì)與所述重組SIP30樣分子結(jié)合的能力。在本發(fā)明更具體的一個實施方式中，所述核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少45個連續(xù)的核苷酸。在本發(fā)明另ー個更具體的實施方式中，所述核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少50個、75個或100個連續(xù)的核苷酸。本發(fā)明的ー個方面g在提供測定適合的SIP30拮抗劑與SNAREs和SIP30樣分子多肽相互作用能力的方法，該方法包括測定a)所述重組SIP30樣分子多肽與所述物質(zhì)相互作用的能力；b)所述物質(zhì)激活細胞膜離子通道的能力；或c)調(diào)節(jié)b)部分細胞膜離子通道的能力，具體而言，其中所述重組SIP30樣分子多肽是嵌合體。本發(fā)明的另一方面g在提供測定一種物質(zhì)與SIP30樣分子結(jié)合能力的方法，該方法包括a)在細胞中表達由包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少25個連續(xù)堿基的核酸序列編碼的重組SIP30多肽；b)使所述物質(zhì)與所述重組SIP30樣分子多肽接觸；和c)測定所述物質(zhì)與所述重組SIP30樣分子結(jié)合的能力。在本發(fā)明這一方面，所述核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少45個連續(xù)的核苷酸。在本發(fā)明另ー個更具體的實施方式中，所述核酸序列包括選自從SEQIDAl到SEQIDA130的任一序列的至少40個、45個、50個、75個或100個連續(xù)的核苷酸。本發(fā)明ー個優(yōu)選的實施方式提供了與太鼠SIP30編碼區(qū)的11031核苷酸互補的反義寡脫氧核苷酸。本發(fā)明另一方面g在提供能與至少部分SIP30核酸序列相匹配的siRNA分子、編碼SNAREs的mRNA(包括能抑制細胞中所述造成神經(jīng)病理現(xiàn)象的蛋白或細胞因子表達的SNAP25)。本發(fā)明的siRNA通常都是短的(19-29個核苷酸)、雙鏈RNA分子，能使互補靶mRNA產(chǎn)生序列特異性降解(即RNA干擾，RNAi)(Bass,Nature411:428(2001))。因此，在某些實施方式中，siRNA分子包含ー個雙鏈結(jié)構，該雙鏈結(jié)構包含ー個正義鏈和ー個反義鏈，其中所述的反義鏈包含一段核苷酸序列，該核酸序列與多肽、蛋白質(zhì)或細胞因子至少部分核苷酸序列互補；正義鏈包括一段核苷酸序列，所述核苷酸序列與所述反義鏈的核酸序列的至少一部分互補；其中每條正義鏈和反義鏈都包含大約19-29個核苷酸。靶向NPII或疼痛-誘導細胞因子或蛋白的siRNA分子可以基于本領域眾所周知的準則進行設計(如Elbashir等，EMBOJ.20:6877(2001))。例如，靶mRNA的靶標部分優(yōu)選以AA(最優(yōu)選)、TA、GA或CA開始；siRNA分子的GC比優(yōu)選為45-55%；siRNA分子在一行中優(yōu)選不含有3個連續(xù)相同的核苷酸；siRNA分子在一行中優(yōu)選不含有7個混雜的G/C；siRNA分子優(yōu)選在每個3’末端都含有二核苷酸突出(優(yōu)選TT);靶標部分優(yōu)選位于靶mRNA的ORF(開放性閱讀框)區(qū)，位于起始密碼子ATG之后至少75個堿基對，且在終止密碼子之前至少75個堿基對；靶標部分優(yōu)選不含有16-17個連續(xù)的與其他編碼序列同源的堿基對。基于以上部分或全部準則可以確定優(yōu)選的疼痛-誘導細胞因子siRNA靶序列。因此，本發(fā)明另一方面提供ー種抑制SIP30疼痛-誘導蛋白或細胞因子或其他介質(zhì)在細胞中表達的方法，該方法包括在細胞中引入至少ー個能與疼痛-誘導核酸序列的至少一部分反應的反義分子或siRNA分子。雖然任何細胞都可以作為靶標，但是，引入所述分子的細胞優(yōu)選是SIP30有上調(diào)風險的中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域，更優(yōu)選為脊髄，或者有疼痛誘導蛋白或細胞因子存在的局部區(qū)域。在更優(yōu)選的實施方式中，所述區(qū)域來自遭遇損傷的機體，優(yōu)選人類患者。本發(fā)明的化合物和分子可以采用本領域眾所周知的技術在體外或體內(nèi)引入細胞內(nèi)，包括電擊、鈣磷共沉積、微注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、多轉(zhuǎn)染和與細胞穿透肽(CPP)偶聯(lián)?？商娲?，這些靶向誘導疼痛的細胞因子的分子可以在體內(nèi)通過編碼正義序列和反義序列的表達載體內(nèi)源產(chǎn)生而引入細胞內(nèi)。遺傳控制元件包括轉(zhuǎn)錄啟動子，還可以包括轉(zhuǎn)錄增強子以増加mRNA表達水平，編碼適合的核糖體結(jié)合位點的序列，以及終止轉(zhuǎn)錄的序列。適合的真核啟動子包括組成型RNA聚合酶II啟動子(如巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40早期啟動子區(qū)域、包含Rous肉瘤病毒(RSV)3'長末端重復序列的啟動子、單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)啟動子和雞β-肌動蛋白啟動子)，組織特異性RNA聚合酶II啟動子和RNA聚合酶III啟動子(如U6、HI、7SK和7SL啟動子)。在一些實施方式中，正義鏈和反義鏈可以由不同的表達載體編碼(即共轉(zhuǎn)染的載體)。在另ー些實施方式中，siRNA分子的正義鏈和反義鏈由相同的表達載體編碼。采用收斂轉(zhuǎn)錄或背離式轉(zhuǎn)錄(convergentordivergenttranscription),正義鏈和反義鏈可以獨立地由単一的表達載體表達?？商娲?，正義鏈和反義鏈可以由ー個單獨的表達載體以單個發(fā)卡RNA分子的形式共同表達，既可以表達成短發(fā)卡RNA(shRNA)分子形式(如Arts等，GenomeRes.132325(2003)),也可以表達成長發(fā)卡RNA分子形式(如Paddison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:1443(2002))。誘導神經(jīng)病理性疼痛的中間體、細胞因子多肽(或其片段)可以采用眾所周知的多種免疫方法檢測和定量，諸如酶聯(lián)免疫法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、免疫沉淀法、免疫熒光法和Western印跡。免疫方法中所用的抗前炎性細胞因子抗體(優(yōu)選抗人前炎性細胞因子抗體)可以從商業(yè)渠道獲得，如EMDBiosciences(SanDiego,CA),Upstate(Charlottes-ville,VA)，Abeam(Cambridge,MA)，AffinityBioreagents(Golden,CO)andNovusBiologicals(Littleton,CO),或可以由本領域熟練技術人員按眾所周知的技術制得。本發(fā)明的另一方面，提供了一種篩選方法，該方法包括以下步驟提供ー種含有至少部分SIP30和/或SIP30蛋白的樣品；向所述樣品中的至少第一部分中加入待測化合物；將來自于至少樣品第一部分的參數(shù)與來自于至少樣品第二部分的ー個參數(shù)進行比較，其中至少樣品的第二部分不包括待測化合物。來自于至少樣品第一部分的至少ー個參數(shù)和來自于至少樣品第二部分的至少ー個參數(shù)的差別的大小是待測化合物的指標，尤其是它改變SIP30表達和活性的能力，或上調(diào)SIP30的能力。本發(fā)明的另一方面提供了試劑盒，包括至少部分SIP30和/或至少部分SIP30蛋白和至少一定量的對照化合物。本發(fā)明的另一方面提供了一種評估機體在術后發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛的風險的方法，包括測定SIP30基因產(chǎn)物在機體樣品中的量；然后將測定量和對照樣品中SIP30基因產(chǎn)物的標準量進行比較，如果發(fā)現(xiàn)測定量在SIP30基因產(chǎn)物的標準范圍之外即為診斷術后神經(jīng)病理性疼痛風險的陽性指征。反義或siRNA分子単獨使用或與其他解痙劑、抗炎藥、麻醉劑聯(lián)合使用來抑制誘導神經(jīng)病理性疼痛細胞因子的表達可作為在機體治療炎癥反應的用途或方法。因此，本發(fā)明另一方面提供了ー種治療神經(jīng)病理性疼痛患者的方法，包括給所述患者引入至少有效量的能與至少部分SIP30核酸序列反應的SIP30拮抗劑。所述治療炎癥的方法可以采用將所述分子向目標組織靶向給藥的系統(tǒng)實現(xiàn)。因此，本發(fā)明的另一方面提供了將有效量的所述藥劑引入患者的組織的方法。在優(yōu)選地實施方式中，所述的患者是人類。關于組織的基因遞送給藥，存在著大量的眾所周知的方法，諸如，以導管、注射針管或儲庫植入物為例。優(yōu)選的給藥系統(tǒng)包括儲庫植入物。本發(fā)明的儲庫植入物包括有助于在患者的靶位置植入和保留的物理結(jié)構。藥物儲庫植入物可以包括微球，微球還可以進ー步包括分離的核酸、能給機體靶向提供濃度梯度的藥物的siRNA分子。在本發(fā)明的另ー個實施方式中，微球是注射到靶組織的。本發(fā)明的另一方面，本領域的普通技術人員可以理解，速釋制劑或緩釋制劑形式存在的產(chǎn)品的不同組合都適合本發(fā)明。例如，實施者可以將至少ー種SIP30拮抗劑和載有至少ー種解痙劑、抗抑郁劑、抗炎劑、阿片類物質(zhì)或麻醉劑的凝膠和微球一起制成制劑，其中凝膠和微球的組合被置于靶標區(qū)域。本發(fā)明實施時，可以局部給藥或持續(xù)給藥。本發(fā)明的試劑、方法和系統(tǒng)也都可以用于機體的多種器官。根據(jù)本發(fā)明的方法，具體實施方式將用以下的實施例進行描述。雖然本發(fā)明采用了具體的實施方式進行描述，這些實施方式應該理解為僅僅是為了形象描述本發(fā)明的原理和應用。因此應當理解，這些描述性的實施方式可以進行大量的變化，而其他的安排涉及也不會背離由以下權利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。實施例實施例I:拮抗SIP30以抑制周圍神經(jīng)損傷誘導的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展和持續(xù)材料和方法實驗動物成年雄性Sprague-Dawley大鼠，200-280克，每籠2只，自由飲食，1212小時明暗周期，室溫恒定。鞘內(nèi)植管。戊巴比妥鈉(40mg/kg，腹腔注射)麻酔下，鞘內(nèi)導管(PE-10導管)通過L4和L5腰椎之間的間隙插入，深入到腰椎膨大的硬膜外腔(L4和L5部分)。導管用無菌生理鹽水充滿(大約4μI)，外末端塞住。插了導管的大鼠恢復4天，単獨飼養(yǎng)。任何表現(xiàn)因手術過程而發(fā)生神經(jīng)性缺陷的大鼠都被剔除出本實驗。坐骨神經(jīng)的慢性壓迫性損傷模型(CCI)。大鼠用戊巴比妥鈉((45mg/kg，腹腔注射)深度麻酔，右側(cè)坐骨神經(jīng)用鈍解剖鉗暴露在大腿中部。CCI手術組根據(jù)Bennett和Xie(1988)的描述，坐骨神經(jīng)在其三叉分支的近端用4道鉻制腸線(4_0)松弛結(jié)扎，彼此相距大約I毫米；假手術組坐骨神經(jīng)暴露但不結(jié)扎。CCI或假手術后，用4-0絲線分別分層縫合肌肉和皮膚，用抗生素粉抗感染。反義寡核苷酸(ODN)的制備和給藥。反義序列(AS，5'-TTTCTCCGCGTCCGCCATGGT-3')SEQ.IDNo.B131，與大鼠SNAP25相互作用蛋白30(SIP30，GenBank登錄號BC063144)編碼區(qū)的11-31位核苷酸互補，以及其相應的錯配序列SEQ.ID.No.B132(MM，5'-TTTCCTCGCGTCCCGCATGGT-3')都為IntegratedDNATechnologies公司(Coralville,IA,USA)合成和純化。所有的ODN都是采用BLAST算法在GenBank數(shù)據(jù)庫中篩查以排除反義ODN的非特異性結(jié)合，并表明錯義ODN不與登記的核苷酸序列匹配。ODN在給藥前重溶于O.9%的生理鹽水(NS)中。大鼠分別鞘內(nèi)注射NS(10μI),AS(50μg/ΙΟμI)和ΜΜ(50Μ/10μ1)，然后用5μI生理鹽水沖洗，每24小時沖洗一次，共沖洗4天(給藥方案I:從第O天(CCI術前6小時)到CCI術后第3天；給藥方案II:從CCI術后第4天到第7天)。RNA提取和實時PCR分析。在CCI或假手術術后第3天或第7天處死大鼠。為了評價神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展情況和反義治療的效果，處死前，按如2.6所述的方法檢測大鼠的機械性痛覺異常和熱痛覺過敏。來自正常組大鼠、假手術組大鼠和CCI組大鼠的脊髓用AS、麗或NS處理，然后切成兩部分，即CCI同側(cè)和CCI對側(cè)。對同樣處理的大鼠的DRG(L4-L6)進行解剖。收集兩組大鼠同側(cè)和對側(cè)DRG單個樣品。切開后，所有組織迅速在干冰中冷凍并儲存于_80°C直到進ー步處理。冷凍的脊髓直接用ImlTRIZOL試劑(Invitrogen,LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA)均質(zhì)化。根據(jù)廠家的操作規(guī)程略有修改進行總RNA的提取。簡單地說，氯仿提取之后，RNA用異丙醇沉淀，沉淀用70%こ醇沖洗兩次。在空氣中干燥，而后RNA用超純水重懸。總RNA的質(zhì)量和數(shù)量用電泳法以及A260測定(Agilent2001Bioanalyzer,PaloAlto，CA)檢測。提取的RNA用DNaseI(不含DNA，Ambion)處理以去除基因組DNA。cDNA用隨機十聚體引物采用AmbionRETROscript反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)廠家的操作說明合成。用不含RNA的陰性對照反應來檢測試劑是否污染。實時PCR。在C印heidSmartCycler上進行實時PCR分析。循環(huán)閾值(Ct)采用SmartCyclerDataAnalysisSoftware2.0(Cepheid)進行計算。PCR反應米用LightCyclerDNAMasterSYBRGreenIkit在20μI的終體積中進行，包括12.6μIPCR級水，2·4μ1MgCl2(25mM)，2μIIOxLightCyclerDNAMasterSYBRGreenI[TaqDNA聚合酶，反應緩沖液dNTP混合物(用dUTP代替dTTP)，SYBRGreenI染料，和IOmMMgCl2]，2μIcDNA模板，O.5μI正向和反向引物(lOOng/μI)。擴增方案包括95°C，150秒激活TaqDNA聚合酶；然后40個循環(huán)(95°C，10秒變性；58°C，15秒退火和72°C，20秒延伸)。在所有情況下，首先可以觀察到樣品cDNA的量和Ct的線性關系。每個樣品都運行3適，Ct值取每次反應的平均值。關于對照，運行無模板的對照，以水代替模板。RT-PCR分析的結(jié)果用Ct值表示，用來確定靶基因mRNA相對于參照基因mRNA量的量。在本研究中，采用β-肌動蛋白作為參考基因標準化表達水平。相對基因表達水平用靶基因和肌動蛋白基因表達量按照以下公式計算(Livak和Schmittgen,2001；Marvizon等，2002；BeItramo等，2003)mRNA相對表達=2_(靶基Hct_e-肌動蛋白ct)。引物用InvitrogenCustomPrimerDesigner軟件設計·測定機械敏感性的VonFrey纖維試驗。后爪回縮閾值采用vonFrey纖維(Stoelting,IL,USA)校正系列確定(范圍是0.6到18克)。動物各自置于底部帶有網(wǎng)眼的電線籠中，適應30分鐘。將vonFrey纖維系列應用于足底表面中央?yún)^(qū)，對左后爪施加不斷增加的力(0.6,0.9，I.3，2.2,4.8,6,7.2,9,13和18克)，每單次試驗時間達6秒。只有大鼠靜止并四爪著地時才施用vonFrey纖維。只有當后爪完全從帶網(wǎng)眼的底部離開時才認為回縮反應是真實有效的。回縮反應成立時，從下一個較低的vonFrey纖維開始重復檢測該后爪，直到?jīng)]有反應發(fā)生。試驗包括給后爪施用vonFrey纖維5次/每個后爪，間隔15秒。后爪回縮閾值定義為在施用連續(xù)5次時，引起3次回縮的最小的力。一旦左后爪的閾值確定，5分鐘后在右后爪重復同樣的試驗。哈格里夫后爪熱敏感試驗(Hargreave'stest)。適應檢測管之后,通過測定后爪對輻射熱源回縮的潛伏期來測定熱痛覺過敏。大鼠各自置于位于升起的平臺上的有機玻璃籠中，平臺下是通過玻璃板施用于足爪的福射性熱源(336型組合元件,IITC/lifeScienceInstruments,WoodlandHill,CA,USA)當大鼠抬起足爪時關閉熱源,測定從施用熱源開始到大鼠后爪回縮的時間。該時間被定義為后爪回縮潛伏期。在沒有CCI時，維持在穩(wěn)定強度的熱源將產(chǎn)生穩(wěn)定的回縮潛伏期(大約8-10秒)。在沒有反應時，關閉20秒防止組織損傷。大鼠4只一組，以便在5分鐘的間隔內(nèi)可以對每只大鼠進行一次左后爪(對照)然后一次右后爪的刺激。這種方法再重復2次，每個腳爪測定三次取平均值。結(jié)果嚙齒類模型中神經(jīng)病理性疼痛的鑒定為了掲示參與調(diào)整神經(jīng)病理性疼痛信號途徑的新的分子成分，發(fā)明人采用CCI作為嚙齒類神經(jīng)病理性疼痛模型(Bennett和Xie，1988;Moalem等，2004；Xie等，2005)來尋找CCI大鼠脊髄中差異表達的基因。由于發(fā)明人希望鑒定出參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展階段的基因，他們首先確定了CCI模型中神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展的時間階段。采用接受單側(cè)CCI手術的S-D大鼠，測定出后爪熱和觸覺痛覺敏感性(從CCI術后2天開始)。從圖I可以看出，在CCI術后第二天，CCI后爪與對照爪(即未手術側(cè))，熱和觸覺痛覺敏感性大大提高，幾乎達到了最高值。這些結(jié)果與以前的研究(Khalil等，1999)一致，即CCI術后幾天之內(nèi)即會發(fā)生機械性痛覺異常和熱痛覺過敏?；谶@些神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展時間進程的信息，發(fā)明人選擇CCI術后3天作為時間點，選擇來自于對照組和CCI組腰椎膨大部分提取RNA，采用如前所述的(Hou等，2004Jin等，2005;Wang等，2005)自定義構建的cDNA文庫芯片進行微陣列分析。在此過程中鑒定出的ー個cDNA克隆是SIP30，即之前被報道與SNAP25相互作用的ー種分子(Lee等，2002)。SIP30在大鼠大腦的幾個區(qū)域都存在(Lee等，2002)，但其分子功能還不清楚。如圖2所示，SIP30同源類似物在幾種哺乳動物(包括猩猩、猴子和幾種非靈長類哺乳動物)中都有存在。這些序列是高度同源的。對GenBank和其他公共序列庫的廣泛檢索顯示SIP30序列存在于靈長類和其他哺乳動物中。SIP30和小直徑神經(jīng)元標記物共定位。為了評價SIP30在不同中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)組織中的表達模式進行了Northern印跡，結(jié)果表明SIP30主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(圖3)。這些結(jié)果能夠支持之前的報道(Lee等，2002)。之后對于SIP30在DRG的表達進行了研究。小直徑DRG神經(jīng)元主要是痛覺感受器，在神經(jīng)化學上可以分為兩個群植物凝集素B4(IB4)_陽性的非肽能神經(jīng)元和IB4-陰性的肽能神經(jīng)元。IB4-陰性的神經(jīng)元表達神經(jīng)生長因子(NGF)的受體TrkA，依賴NGF生存，并含有神經(jīng)肽(包括降鈣素基因相關肽和P物質(zhì))。IB4-陽性的神經(jīng)元表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍化神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurturin)或青蒿琥酯(artemin)的受體。IB4-陽性和IB4-陰性痛覺感受器有著不同的功能(Stucky和Lewin，1999)。據(jù)假設，IB4-陰性神經(jīng)元特異性地在炎癥性疼痛中起作用，而IB4陽性神經(jīng)元則在神經(jīng)病理性疼痛中起作用(Mantyh和Hunt,1998；Snider和McMahon,1998；Breese等，2005)。本發(fā)明研究了SIP30、IB4及CGRP在正常成年大鼠DRG(L4_L5)中的表達。SIP30在從小直徑到中直徑的DRG神經(jīng)元中都有表達(圖3)。SIP30在某些神經(jīng)元中與IB4和CGRP的表達有重疊，但主要是與CGRP(圖3)共同表達，這表明其肽能的本質(zhì)。本發(fā)明還對腰髓中SIP30的免疫反應活性進行了檢測，發(fā)現(xiàn)它在所有的腰段都有表達。SIP30的免疫反應活性主要集中在脊髓背角表層(第I、II層)(圖3)，并表現(xiàn)出很強的與相關神經(jīng)肽CGRP和P物質(zhì)共表達的模式(圖3)。另外，SIP30免疫染色也出現(xiàn)在第IV-VII層細胞體和脊髄前角運動神經(jīng)元中。CCI術后SIP30在脊髓中的上調(diào)。CCI組和假手術組大鼠脊髓和DRG中SIP30mRNA的變化用定量實時PCR來檢測。其它兩種基因的表達水平作為參照以標準化每個樣品中總RNA的量。首先采用定量實時PCR方法測定未手術組和CCI組大鼠脊髓和DRG中β-肌動蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達。CCI大鼠β-肌動蛋白和GAPDH的表達用未手術組標準化。結(jié)果表明，在脊髄和DRG中β-肌動蛋白的表達比GAPDH更一致(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，選擇肌動蛋白作為本研究中的參照。CCI術后第3天和第7天，和假手術組及未手術組相比，SIP30mRNA在同側(cè)脊髓中有統(tǒng)計學上顯著的增高(p<O.05)，而在對側(cè)脊髄沒有觀察到增高(圖4)。然而，在DRG，SIP30mRNA表達沒有用因CCI手術而改變。假手術組和CCI大鼠同側(cè)和對側(cè)DRG沒有差異(圖4)。CCI大鼠脊髓的Western印跡分析也表明了SIP30蛋白的上調(diào)。和CCI大鼠的對側(cè)以及假手術組大鼠的雙側(cè)相比，腰髓同側(cè)觀察到了增強的SIP30信號(圖4)。與CCI大鼠和假手術組大鼠SIP30mRNA在DRG的表達相似，CCI術后，DRG雙側(cè)都沒有觀察到增強的Western印跡信號(圖4)。CCI術后第3天和第7天，免疫染色顯示脊髓同側(cè)背角SIP30蛋白水平增高(圖4)?？疾炝薙IP30在CCI脊髓中的定位，結(jié)果表明，CCI術后第3天，在脊髓背角，SIP30和神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN，一種神經(jīng)元標記物)共定位(圖4)。SIP30和GFAP或0X-42染色時都沒有重疊(圖4)。這些結(jié)果顯示，在CCI過程中，SIP30水平在脊髄的同側(cè)上調(diào)了，顯示SIP30水平和神經(jīng)病理性疼痛的潛在相關性。SIP30參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展和維持。從第O天開始(CCI術前6小吋)，SIP30AS(反義核酸)髓鞘內(nèi)給藥(50mg/10y1，每天一次X4天)，到SIP30給藥的第4天，機械性痛覺異常和熱痛覺敏感的發(fā)展都受到部分抑制(圖5)。雙向ANOVA顯示反義組和NS組之間存在統(tǒng)計學顯著性差異(P<O.05)。AS給藥停止后2天(CCI術后第5天)，AS組顯示和NS組相似的機械性痛覺異常(圖5)。CCI術后第7天，出現(xiàn)熱痛覺敏感的腳爪回縮潛伏期和NS組相似(圖5)。MM給藥對機械性痛覺異常和熱痛覺敏感的發(fā)展沒有影響。對側(cè)腳爪回縮閾值和潛伏期不受AS、麗和NS治療的影響(圖5)。為了進一步證實SIP30特異性作用，考察了用靶向SIP30基因編碼區(qū)第143-162位核苷酸的第二個SIP30ASODNSEQ.ID.No.133(ASII5/-GGCAATCCTACAGGTTCCAG-3')“敲降”SIP30蛋白功能的結(jié)果。該ASII還能使CCI誘導的機械性痛覺異常和熱痛覺敏感減弱(圖5)。雙向ANOVA表明反義組和一般對照組(隨機0DN，5-ACGTAAGCAACGCTCAGCTA-3')之間存在著統(tǒng)計學顯著性差異。CCI術后第3天，大鼠發(fā)生機械性痛覺異常和熱痛覺敏感。在該點之后神經(jīng)病理性疼痛建立，用SIP30AS治療后的第4天，在ASODN治療的后期CCI大鼠同側(cè)腳爪回縮閾值和潛伏期增加，雙向ANOVA顯示CCI術后第7天和第9天，在反義組和NS組或麗組之間存在著統(tǒng)計學顯著性差異(P<O.05，圖5)。AS停藥4天后，機械性痛覺異常和熱痛覺敏感重新出現(xiàn)。匪ODN或NA都不能改變CCI大鼠對機械刺激和熱刺激的腳爪回縮反應。給藥期間和給藥后，NS、AS和麗ODN對對側(cè)后肢都沒有影響(圖5)。SIP30AS0DN(50mg/10μ1，每天一次Χ4天)治療正常大鼠對于VonFrey和熱刺激雙側(cè)后肢的反應都沒有觀察到任何影響(P>O.05，圖5)。另外，為了排除SIP30ASODN鞘內(nèi)給藥可能產(chǎn)生非特異性運動缺陷的可能性，測定了接受SIP30AS治療的正常大鼠的自發(fā)性運動，在SIP30ASODN治療期間沒有觀察到異常行為或運動缺陷(數(shù)據(jù)未顯示)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)顯示抑制脊髄中抑制SIP30水平上調(diào)可使神經(jīng)性疼痛發(fā)展階段和維持階段的神經(jīng)性疼痛減弱，表明在SIP30上調(diào)和神經(jīng)性疼痛現(xiàn)象之間存在著因果關系O寡核苷酸敲降SIP30既能抑制SIP30又能抑制SNAP25在脊髓中的表達。考慮到CCI手術不能影響SIP30的mRNA或蛋白在DRG的表達，以下觀察僅集中在脊髄。為了證實SIP30ASODN髓鞘內(nèi)給藥是否確實能通過破壞SIP30mRNA的翻譯敲降SIP30，考察了SIP30AS0DN對SIP30mRNA和SIP30蛋白的影響。鞘內(nèi)注射SIP30AS(50μg/10μI)和MMODNGOyg/lOyI)。最后一次注射6小時后收獲脊髓的腰膨大部分。定量PCR顯示，和給予SIP30MM0DN相比，SIP30ASODN能顯著性降低0_3天或4_7天SIP30mRNA在同側(cè)脊髓的表達(圖6)。另外，Western印跡顯示，SIP30AS在反復髓鞘內(nèi)CCI術后給藥3天后，能顯著降低SIP30在大鼠同側(cè)脊髓中的表達，而麗ODN卻不能(圖6)，進ー步支持AS能介導SIP30蛋白“敲降”。為了評價SIP30AS的選擇性作用，我們還考察了在脊髄表達兩個相關的突觸蛋白(25kDa的突觸小體相關蛋白(SNAP25)和突觸后密度蛋白-95(PSD95))的作用。如圖6所示，SNAP25mRNA在CCI術后3天和7天在同側(cè)脊髓表現(xiàn)出顯著的上調(diào)。而與此相反，直到CCI術后7天，才檢測到PSD95mRNA在脊髓的變化。無論SIP30AS或匪ODN都不能阻礙CCI術后7天PSD95mRNA在同側(cè)脊髓的上調(diào)(圖6)。實施例2SIP30增加疼痛敏感的作用在異氟醚麻醉下，⑶-I小鼠鞘內(nèi)注射SIP30和對照藥(以質(zhì)粒DNA的形式)。無論是使用含有SIP30序列的質(zhì)粒還是空質(zhì)粒，都同時給予脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑。對照組小鼠(η=6)每只接受2.Oμg空質(zhì)粒。對于含有SIP30的質(zhì)粒，A組小鼠(η=5)每只接受2.OμgSIP30質(zhì)粒DNA，B組小鼠每只(η=5)接受5.25μgSIP30質(zhì)粒DNA。之后24天內(nèi)，小鼠通過VonFrey纖維接受腳爪回縮閾值試驗。圖7描述了試驗結(jié)果。在試驗的第4天、6天和8天，和對照組相比，A組和B組小鼠在腳爪回縮閾值都有顯著差異(*，p<0.05，和對照組相比有顯著差異)。測量包括每只小鼠的兩側(cè)腳爪。第24天時，腳爪回縮閾值回復到正常水平。本領域的普通技術人員可以理解，SIP30在加重神經(jīng)病理性疼痛中起著直接作用。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)對于治療方案中所需要的SIP30拮抗的時間和程度提供了充分的指導。雖然本發(fā)明采用具體實施方式進行了描述，應當理解這些實施方式都只是為了具體描述本發(fā)明的原理和應用。因此可以理解，可以對本發(fā)明描述性的實施方式進行大量的改進和其他安排而不會偏離由權利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍。權利要求1.ー種治療神經(jīng)病理性疼痛的方法，包括給予機體有效劑量的拮抗SIP30或SIP30相關大分子的拮抗劑。2.如權利要求I的方法，其中所述的有效的拮抗劑是小分子核酸組分。3.如權利要求2的方法，其中所述的核酸是SIP30或SIP30相關序列中部分序列的互補序列。4.如權利要求3的方法，其中所述的核酸的長度不短于12個堿基。5.如權利要求2的方法，其中所述的核酸由非修飾堿基組成。6.如權利要求2的方法，其中所述的核酸由修飾堿基組成。7.如權利要求2的方法，其中所述的核酸由非修飾堿基和修飾堿基的混合物組成。8.如權利要求2的方法，其中所述的核酸單獨給藥，或溶于藥學可接受的體內(nèi)給藥溶液給藥，和/或與其他治療藥物組合使用。9.如權利要求8的方法，其中所述的溶液選自以下溶液中的任何ー種脂類、多糖、蛋白質(zhì)、核酸，或其組合。10.如權利要求2的方法，其中所述的核酸與常用的增強核酸體內(nèi)穩(wěn)定性的物質(zhì)一起使用。11.如權利要求10的方法,其中所述增強核酸體內(nèi)穩(wěn)定性的物質(zhì)由酶抑制劑、核酸穩(wěn)定劑或其組合組成。12.如權利要求2-11的任ー權利要求的方法，其中所述的核酸是控釋劑型。13.如權利要求2-11的任ー權利要求的方法，其中所述的核酸是藥學常用劑型，包括儲庫劑型、注射劑型、局部給藥劑型、消化道給藥劑型、噴劑、吸入劑、電子便攜式劑型(electro-poratableform)、其他給藥劑型,或其組合。14.如權利要求I的方法，其中所述的拮抗劑以小分子、核酸、肽、多肽、擬肽或其組合的形式存在。15.一種篩選能與SIP30或SIP30相關蛋白相互作用的物質(zhì)的方法，包括以下步驟a)提供ー種含有選自從序列SEQIDBI到序列SEQIDB130的任一序列的連續(xù)氨基酸序列的多肽；和b)檢測所述物質(zhì)與所述SIP30或SIP30相關蛋白相互作用的能力。16.如權利要求15的方法，其中檢測所述物質(zhì)與所述SIP30或SIP30-相關蛋白相互作用的能力的步驟還進ー步包括測定所述物質(zhì)與所述蛋白相互作用的親和カ。17.如權利要求15的方法，其中檢測所述物質(zhì)與SIP30分子相互作用的能力的步驟還進ー步包括測定所述物質(zhì)激活SIP30或SIP30-相關大分子的能力。18.篩選能夠治療神經(jīng)病理性疼痛的物質(zhì)的方法，包括如下步驟a)提供ー種由包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核酸序列編碼的重組SIP30多肽；b)使所述物質(zhì)與所述重組SIP30多肽接觸；c)檢測所述物質(zhì)與所述重組SIP30多肽結(jié)合的能力。19.如權利要求18的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少20個連續(xù)核苷酸。20.如權利要求18的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少35個連續(xù)核苷酸。21.如權利要求18的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少50個連續(xù)核苷酸。22.如權利要求18的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少100個連續(xù)核苷酸。23.如權利要求18-22任ー權利要求的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列。24.如權利要求18-22任ー權利要求的方法，其中檢測所述物質(zhì)與所述重組SIP30多肽相互作用的能力的步驟包括測定a)所述重組多肽與所述物質(zhì)相互作用的能力；b)所述物質(zhì)激活細胞膜中離子通道的能力；或c)所述物質(zhì)調(diào)節(jié)b)部分的細胞膜中的離子通道的能力。25.如權利要求18-22任ー權利要求的方法，其中所述的重組SIP30多肽是嵌合體。26.—種篩選具有SIP30結(jié)合能力的物質(zhì)的方法，包括如下步驟a)在細胞中表達由包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少25個連續(xù)核苷酸的核酸序列編碼的重組SIP30多肽；b)使所述物質(zhì)與所述重組SIP30多肽接觸；和c)檢測所述物質(zhì)與所述重組SIP30多肽相互作用的能力。27.如權利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少40個連續(xù)核苷酸。28.如權利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少45個連續(xù)核苷酸。29.如權利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少50個連續(xù)核苷酸。30.如權利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少75個連續(xù)核苷酸。31.如權利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的至少100個連續(xù)核苷酸。32.如權利要求26的方法，其中所述的核酸序列包括選自從序列SEQIDAl到序列SEQIDA130的任一序列的核苷酸序列。33.一種篩選方法,包括a)提供ー種含有至少部分SIP30或SIP30蛋白的樣品；b)向所述樣品中加入至少部分SIP30或SIP30蛋白；向所述樣品中的至少第一部分中加入待測化合物；和c)將來自所述樣品的至少第一部分的至少ー個參數(shù)和來自所述樣品的至少第二部分的至少ー個參數(shù)進行比較，其中所述的樣品的至少第二部分不包括待測化合物。34.ー種試劑盒，所述試劑盒包括至少部分SIP30和/或SIP30蛋白，所述至少部分SIP30能與至少部分SNAP25結(jié)合；和能與所述至少部分SIP30結(jié)合的至少部分SNAP25。35.一種用于篩選可以降低SNAP25的量的化合物的試劑盒，所述試劑盒包括調(diào)節(jié)SIP30轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地與編碼報告蛋白的核酸序列相連。36.如權利要求35的試劑盒，所述試劑盒還進ー步包括至少ー種表達SIP30和SNAP25的細胞。37.如權利要求35或36的試劑盒，所述試劑盒還進一歩包括將所述的核酸序列遞送到表達SIP30和SNAP25的細胞的工具。38.如權利要求35-37任ー權利要求的試劑盒，其中所述的細胞是神經(jīng)元。39.如權利要求35-38任ー權利要求的試劑盒,其中所述的報告蛋白選自螢火蟲突光素酶、海腎熒光素酶、緑色熒光蛋白、β半乳糖苷酶和氯霉素こ酰基轉(zhuǎn)移酶。全文摘要本發(fā)明涉及治療由SIP30調(diào)控的神經(jīng)病理性疼痛的化合物、組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒。本發(fā)明提供了用于治療神經(jīng)病理性疼痛的SIP30拮抗劑。文檔編號C12N15/11GK102666877SQ201080049104公開日2012年9月12日申請日期2010年9月2日優(yōu)先權日2009年9月2日發(fā)明者于雷,張玉秋,景乃禾,趙志奇,郭寧申請人:新澤西魯特格斯州立大學