專利名稱：Aad-1事件das-40278-9的檢測的制作方法
AAD-1 事件 DAS-40278-9 的檢測
背景技術(shù)：
aad-Ι基因(最初來自Sphingobium herbicidovorans)編碼芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase，AAD-1)蛋白。該性狀賦予針對2，4_ 二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般稱作“fop”除草劑，如氯甲草(diclofop)和喹禾靈 (quizalofop))除草劑的耐受性，并可在植物轉(zhuǎn)化過程中和育種苗圃中用作選擇性標(biāo)記。 aad-Ι基因自身，首先在WO 2005/107437(亦參見US 2009-0093366)中公開其涉及植物中的除草劑耐受性。已知多種事件檢測的方法。然而，其均存在問題。一種方法是如Wingearmov. Pharma. Tech. 00 =18-24,2000)描述的Pyrosequencing技術(shù)。在該方法中，設(shè)計(jì)了與鄰近基因組DNA和插入DNA接點(diǎn)(junction)重疊的寡核苷酸。將所述寡核苷酸雜交于來自感興趣的區(qū)的單鏈PCR產(chǎn)物(一個(gè)引物在插入的序列中，一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中)，并在DNA 聚合酶、ATP、硫酰酶(sulfurylase)、螢光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5，磷硫酸(adenosine 5' phosphosulfate)和螢光素的存在下溫育。單獨(dú)添加DNTP，且其組入導(dǎo)致可測量的光信號。光信號表明由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基或多堿基延伸而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。熒光偏振是另一種可用于檢測本發(fā)明的擴(kuò)增子的方法。遵循該方法，設(shè)計(jì)了與基因組側(cè)翼和插入的DNA接點(diǎn)重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸雜交于來自感興趣的區(qū)的單鏈 PCR產(chǎn)物(一個(gè)引物在插入的DNA中，一個(gè)在側(cè)翼基因組DNA序列中)，并在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP的存在下溫育。單堿基延伸導(dǎo)致ddNTP的組入。組入可使用熒光計(jì)作為偏振改變來測量。偏振中的改變表明由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸所致的轉(zhuǎn)基因插入/側(cè)翼序列的存在。已描述了分子燈塔(Molecular Beacon)用于序列檢測。簡言之，設(shè)計(jì)了與側(cè)翼基因組和插入DNA接點(diǎn)重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其含有保持熒光和淬滅模塊彼此接近的二級結(jié)構(gòu)。在熱穩(wěn)定性聚合酶和dNTP的存在下循環(huán)FRET探針和 PCR引物(一個(gè)引物在插入DNA序列中，一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中)。在成功的PCR擴(kuò)增之后，F(xiàn)RET探針對靶序列的雜交導(dǎo)致探針二級結(jié)構(gòu)的去除和熒光和淬滅模塊的空間上的分離。其結(jié)果為熒光信號。熒光信號表明由于成功的擴(kuò)增和雜交所致的側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。水解探針測定法，亦稱作TAQMAN(PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.)，是檢測和量化DNA序列的存在的方法。簡言之，設(shè)計(jì)了與基因組側(cè)翼和插入DNA接點(diǎn)重疊的FRET寡核苷酸探針。在熱穩(wěn)定性聚合酶和dNTP存在下循環(huán)FRET探針和PCR引物(一個(gè)引物在插入DNA序列中，一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中)。在特異性擴(kuò)增過程中，Taq DNA聚合酶將FRET探針上的熒光模塊從淬滅模塊清除并釋放。熒光信號表明由于成功的擴(kuò)增和雜交所致的側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。許多挑戰(zhàn)中的另一種是對于給定測試尋找合適的參照基因。舉例而言，如 Czechowski等的摘要中陳述，“來自Affymetrix ATHl全基因組GeneChip研究的特別龐大的數(shù)據(jù)組提供了鑒定在模式植物物種擬南芥(Arabidopsis thaliana)中具有非常穩(wěn)定的表達(dá)水平的新一代參照基因的手段。發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種在整個(gè)發(fā)育過程中并在多種環(huán)境條件下在表達(dá)穩(wěn)定性方面超越傳統(tǒng)參照基因的擬南芥基因”(Czechowski等(200 Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139，5—17)。Brodmann等Q002)涉及對于四種在歐盟(European Union)中批準(zhǔn)的玉米品種， 食物中轉(zhuǎn)基因玉米成分的實(shí)時(shí)定量PCR檢測。Brodmann，P. D.，P. D.，Ilg E. C.，Berthoud H·,and Herrmann,A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85(3)。Hernandez等Q004)提及了供用于實(shí)時(shí)PCR的四種可能基因。Hernandez， M. , Duplan, M. -N. , Berthier, G. , Vaitilingom, M. , Hauser, W. , Freyer, R. , Pla, Μ., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J. Agric. Food Chem. 2004，52，4632—4637。Costa等Q007)考慮了這四種基因(亦在實(shí)時(shí)PCR的背景下)，并得出結(jié)論醇脫氫酶和玉米醇溶蛋白(zein)基因?qū)τ谵D(zhuǎn)基因飼料混合物問題(intermix issue)，是用于檢測樣品“事件”(植物凝集素基因)的最佳參照基因。Costa，L.D.，and Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007,55,1264-1273。Huang等U004)使用質(zhì)粒pMulM2作為供在玉米中檢測M0N810和NK603轉(zhuǎn)基因的參照分子。Huang and Pan, “ Detection of Genetically Modified Maize M0N810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods," J. Agric. Food Chem.，2004，52(11)，pp 3264-3268。Gasparic等Q008)對于定量分析玉米事件(如M0N810)，根據(jù)環(huán)化探針技術(shù)，TaqMan和多種實(shí)時(shí)PCR化學(xué)的比較，建議了 LNA技術(shù)。Ga§parid, Cankar， Zel, and Gruden, “ Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms, “ BMC Biotechnol. 2008 ；8 :26。US 20070148646涉及用于定量的引物延伸技術(shù)，其需要可由組入的核苷酸的量定量和檢測的單個(gè)核苷酸的受控分配。這與使用內(nèi)部參照基因的TaqMan PCR方法不同。為了區(qū)分TC1507的純合和半合基因型，對于該事件成功地使用了 Invader測定。 Gupta,Μ. ,Nirunsuksiri,ff. ,Schulenberg,G. ,Hartl, Τ. , Novak,S. , Bryan,J. ,Vanopdorp, N. , Bing, J. and Thompson,S.A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. Mol. Breeding 2008,21,173-181。Huabang (2009)涉及基于PCR接合性(zygosity)的轉(zhuǎn)基因玉米測試。然而，未顯不使用參照基因° Huabang, “ An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize, “ Molecular Plant Breeding,2009,Vol. 7,No.3，619-623。

發(fā)明內(nèi)容
本主題發(fā)明提供了用于檢測樣品(例如，玉米粒的)中命名為DAS-40278-9的 AAD-I玉米事件的存在的測定法。(代表性種子以登錄號PTA-10244保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(黃色馬齒型玉米(Yellow Dent maize)雜交種子(Zea Mays L) DAS-40278-9 ；根據(jù)布達(dá)佩斯條約以Dow AgroSciences LLC的名義保藏；ATTC收到種子/ 株的日期為2009年7月10日；2009年8月17日確認(rèn)存活))。亦提供了可用于進(jìn)行該測定的試劑盒和條件。更具體而言，本發(fā)明部分涉及在利用玉米內(nèi)源參照基因的玉米中對于AAD-I事件的終點(diǎn)TaqMan PCR測定。一些實(shí)施方案涉及能夠進(jìn)行高通量接合性分析的測定。本主題發(fā)明進(jìn)一步部分涉及供用于確定接合性的優(yōu)選轉(zhuǎn)化酶參照基因的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明還部分涉及包括本主題檢測方法的植物育種。在一些實(shí)施方案中，所述事件可與其他性狀“層疊(stack) ”，所述性狀包括例如其他除草劑耐受基因和/或昆蟲抑制蛋白。本主題方法可用于獨(dú)特地鑒定包含本主題發(fā)明的事件的玉米品系。


圖1顯示用于在玉米事件DAS-40278-9中用于DNA插入的克隆策略。圖2是在用于確證玉米事件DAS-40278-9的側(cè)翼邊界區(qū)的PCR擴(kuò)增中使用的引物的圖。該概略圖描述了用于從5’至3’邊界確證AAD-I玉米事件DAS-40278-9的全長測序的引物位置。圖3顯示了用于來自玉米事件DAS-40278-9的側(cè)翼邊界序列的克隆策略。用 EcoR V, StuI消化玉米事件DAS-40278-9的基因組DNA，并生成了相應(yīng)的 Genomeffalker 文庫，將其用作擴(kuò)增靶DNA序列的模板。序列簡述SEQ ID NO 1提供了對于玉米事件DAS-40278-9，AAD-1插入兩側(cè)的5，和3，基因組側(cè)翼序列的序列(包含該插入)。SEQ ID NO :2_7是供依照本主題發(fā)明的使用的引物和探針。SEQ ID NO :8是例示的事件擴(kuò)增子。SEQ ID NO :9是例示的參照擴(kuò)增子。
具體實(shí)施例方式通過Whisker介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生成了轉(zhuǎn)基因AAD-I (提供除草劑耐受性)玉米事件 DAS-40278-9。如USSN 61/235，248 (2009年8月19日提交)中詳述，克隆、測序并表征了該AAD-I轉(zhuǎn)基因插入的5’和3’端側(cè)翼序列。如本文中所述，部分地根據(jù)位于5’插入至植物接點(diǎn)的DNA序列，設(shè)計(jì)了具體的 TAQMAN引物和探針。在針對16種不同AAD-I玉米事件和兩種非轉(zhuǎn)基因玉米品種的實(shí)時(shí)PCR 中用玉米轉(zhuǎn)化酶作為參照基因以雙鏈體形式成功地測試了引物和探針的事件特異性。如本文中詳述，開發(fā)了用于AAD-I玉米DAS-40278-9的終點(diǎn)事件特異性TAQMAN測定法的流程。
在該AAD-I玉米中跨越宿主植物DNA和整合基因構(gòu)建體之間的整合接點(diǎn)的區(qū)的序列是獨(dú)特序列。用其開發(fā)了檢測AAD-I玉米DAS-40278-9的存在的事件特異性測定法(常規(guī)PCR或?qū)崟r(shí)PCR)以供GMO測試，并確定了育種群體中植物的接合性狀態(tài)。本文中報(bào)道的事件特異性TAQMAN測定法可用于這兩種應(yīng)用。本主題發(fā)明提供了在樣品中檢測主題轉(zhuǎn)基因玉米事件DAS-40278_9(亦稱作 PDAS1740-278)的存在的測定法。本主題發(fā)明的諸方面包括設(shè)計(jì)和/或產(chǎn)生任何本文中例示或建議的診斷性核酸分子的方法。本發(fā)明還部分涉及包括任何這些方法的植物育種。在一些實(shí)施方案中，本主題事件可與其他性狀(如例如其他除草劑耐受基因和/或編碼昆蟲抑制蛋白的基因)“層疊”。 包含本主題事件的植物品系可使用本文中公開和建議的序列來檢測。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及除草劑耐受性玉米品系的鑒定。本主題發(fā)明部分涉及檢測本主題事件的存在以確定有性雜交的后代是否含有感興趣的事件。此外，包括了用于檢測該事件的方法，并且其有助于，例如，遵守要求來源于重組作物植物的食物的上市前批準(zhǔn)和標(biāo)記的規(guī)定。本主題發(fā)明部分涉及利用內(nèi)源基因作為參照(拷貝數(shù))對照的供AAD-I玉米事件的高通量接合性分析的基于熒光的終點(diǎn)TaqMAN PCR測定法。本主題發(fā)明進(jìn)一步部分涉及優(yōu)選的參照基因即轉(zhuǎn)化酶的發(fā)現(xiàn)。鑒定了幾種參照基因作為可能的選項(xiàng)。本主題發(fā)明還部分涉及用于AAD-I事件特異性接合性分析的二通路(biplex)終點(diǎn)TaqMAN PCR的開發(fā)。此外，本發(fā)明部分涉及AAD-I育種測試試劑盒的開發(fā)。終點(diǎn)TaqMan測定基于加/減策略(plus/minus strategy)，其中“加”表明樣品就測定的基因而言是陽性的，而“減”表明樣品就測定的基因而言是陰性的。這些測定通常利用兩組分別用于鑒定AAD-I轉(zhuǎn)基因序列和野生型基因序列的寡核苷酸，以及測量轉(zhuǎn)基因和野生型序列含量的雙標(biāo)記探針。盡管Invader測定在表征事件方面是魯棒的技術(shù)，但其對DNA品質(zhì)非常敏感。此外，該測定需要大量DNA。Invader亦需要附加的變性步驟，若操作不當(dāng)，其可導(dǎo)致Invader 測定不成功。此外，Invader測定的較長測定時(shí)間限制了其在商業(yè)環(huán)境下的分析中有效地處理大量AAD-I樣品的靈活性。本主題發(fā)明的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是節(jié)約時(shí)間和變性步驟的消除。用于檢測AAD-I事件的本主題終點(diǎn)TaqMAN分析相對于Invader提供了令人驚訝的優(yōu)點(diǎn)，特別是在分析大量樣品方面。本發(fā)明可影響在作物包括玉米、大豆和棉花中AAD-I除草劑耐受性性狀的開發(fā)和表征。本文中提供了定義和實(shí)例以幫助描述本發(fā)明，并指導(dǎo)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。除非另行指出，術(shù)語應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域一般技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。使用列舉于 37 CFR § 1. 822的DNA堿基的命名法。如用于本文，術(shù)語“后代”指親本植物包含AAD-I玉米事件DAS-40278-9的任一世代的后代。轉(zhuǎn)基因“事件”是通過用異源DNA，即含有感興趣的轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，重新產(chǎn)生由將所述轉(zhuǎn)基因插入植物基因組所得的植物群體，并選擇由插入特定基因組位置所表征的特定植物來產(chǎn)生。術(shù)語“事件”指起始轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化體含有所述異源DNA的后代。術(shù)語“事件”還指通過轉(zhuǎn)化體和含有基因組/轉(zhuǎn)基因DNA的另一品種之間的有性異型雜交(outcross)產(chǎn)生的后代。即使在與回歸(recurrent)親本的反復(fù)回交之后，插入的轉(zhuǎn)基因DNA和來自轉(zhuǎn)化的植物的側(cè)翼基因組DNA (基因組/轉(zhuǎn)基因DNA)仍存在于雜交后代的相同染色體位置處。術(shù)語“事件”還指來自起始轉(zhuǎn)化體及其包含插入的DNA和直接鄰接插入的DNA的側(cè)翼基因組序列的后代的DNA，期待其會轉(zhuǎn)移至下述后代，所述后代作為一個(gè)含有插入的DNA的親本系(例如起始轉(zhuǎn)化體和其自交所得的后代)和不含有該插入的DNA 的親本系有性雜交的結(jié)果而接受了含有感興趣的轉(zhuǎn)基因的插入的DNA。“接點(diǎn)序列”跨越了插入基因組的DNA與來自插入點(diǎn)側(cè)翼的玉米天然基因組的DNA 的連接點(diǎn)。其包括跨越本文中所述的玉米事件中的插入和類似長度的側(cè)翼DNA的DNA序列。本主題發(fā)明涉及本主題事件的鑒定。本發(fā)明包括相關(guān)的PCR引物和擴(kuò)增子。這些分子可用于檢測或鑒定商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米品種或來源于本主題轉(zhuǎn)基因玉米品系的品系。插入的整個(gè)序列，以及相應(yīng)的側(cè)翼序列的部分，在本文中提供為SEQ ID No :1。相對于SEQ ID No :1(總共8557堿基對)的本事件的插入和側(cè)翼序列的坐標(biāo)列于下表。
5，側(cè)翼插入3，側(cè)翼殘基#s (SEQ:29):1-18731874-66896690-8557長度(bp):1873 bp4816 bp1868 bp對于該事件的AAD-I插入和側(cè)翼序列的組分進(jìn)一步圖示于圖1至圖3。本主題發(fā)明的檢測技術(shù)可與植物育種一同使用，以確定在為了將一種或多種其他感興趣的性狀賦予后代，將包含感興趣的事件的親本植物與另一植物品系雜交之后，何種后代植物包含給定事件。本主題發(fā)明可用于例如玉米育種項(xiàng)目以及質(zhì)量控制，特別是對于商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米種子。這亦可幫助產(chǎn)品登記和產(chǎn)品管理。這些方法可用于加速育種策略。在一些實(shí)施方案中，用于接合性分析的基于熒光的終點(diǎn)TaqMAN測定允許在讀板器中直接讀取結(jié)果以供鑒定參照基因和玉米中的AAD-I事件。本主題發(fā)明包括育種應(yīng)用，如測試AAD-I事件對其他玉米品系的漸滲 (introgression) 0本主題發(fā)明的檢測方法和試劑盒可用于鑒定本主題發(fā)明的事件。本主題發(fā)明的方法和試劑盒可用于加速育種策略和建立連鎖數(shù)據(jù)。本主題發(fā)明的檢測技術(shù)特別可用于與植物育種一同確定在為了將一種或多種其他感興趣的性狀賦予后代，將包含感興趣的事件的親本植物與另一植物品系雜交之后，何種后代植物包含給定事件。這些Taqman PCR分析方法有助于玉米育種項(xiàng)目以及質(zhì)量控制， 特別是對于商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米種子?，F(xiàn)亦可制備并使用供這些轉(zhuǎn)基因玉米品系的Taqman PCR檢測試劑盒。此亦可有助于產(chǎn)品登記和產(chǎn)品管理。此外，還可將目標(biāo)方法用于研究和表征轉(zhuǎn)基因整合過程，基因組整合位點(diǎn)特征，事件分選，轉(zhuǎn)基因和及其側(cè)翼序列的穩(wěn)定性，和基因表達(dá)(特別涉及基因沉默，轉(zhuǎn)基因甲基化樣式，位置效應(yīng)，和潛在的表達(dá)相關(guān)元件，如MARS (基質(zhì)結(jié)合區(qū))等)。如用于本文，術(shù)語“玉米”意指玉米(Zea mays)，并包括所有其可與玉米繁殖(breed)的品種。本發(fā)明進(jìn)一步包括進(jìn)行雜交和使用本主題發(fā)明的方法的過程。舉例而言，本主題發(fā)明包括用于產(chǎn)生F1雜交種子的方法，即通過將例示的植物與不同(例如，近交的親本)植物雜交，收獲所得的雜交種子，和檢測本主題事件。所得的植物的特征亦可通過包括本主題發(fā)明的方法來改善?？膳嘤輨┠褪苄杂衩字参?，即首先將由從本文中提及品系的種子生長出的玉米植物組成的第一親本玉米植物和第二親本植物有性雜交，由此產(chǎn)生多株第一后代植物， 然后選擇對除草劑有抗性的(或擁有主題事件的)第一后代植物；并將所述第一后代植物自交，由此產(chǎn)生多株第二后代植物，然后選擇對除草劑有抗性的(或擁有至少所述事件之一)第二后代植物。這些步驟可進(jìn)一步包括將第一后代植物或第二后代植物與第二親本玉米植物或第三親本玉米植物回交。然后可種植包含本主題發(fā)明的玉米種子的玉米作物或其后代。亦可理解的是，亦可使兩種轉(zhuǎn)基因植物交配以產(chǎn)生含有兩種獨(dú)立分離添加的外源基因的后代。合適后代的自交可產(chǎn)生對于兩種添加的外源基因?yàn)橥吹闹参?。亦考慮了與親本植物回交和與非轉(zhuǎn)基因植物的異型雜交，以及營養(yǎng)繁殖。其他常用于不同性狀和作物的育種方法在本領(lǐng)域是已知的。使用了回交育種以將簡單遺傳的、高度可遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移至期望的純合栽培種或近交系，其為回歸親本。待轉(zhuǎn)移的性狀的來源稱為供體親本。期待所得的植物具有回歸親本(例如栽培種)的特征和從供體親本轉(zhuǎn)移的期望的性狀。在最初的雜交之后，選擇了擁有供體親本的表型的個(gè)體，并將其反復(fù)與回歸親本雜交(回交)。 預(yù)期所得的親本具有回歸親本(例如栽培種)的特征，和從供體親本轉(zhuǎn)移的期望的性狀。本發(fā)明可與標(biāo)志物協(xié)助育種(MAB)方法一同使用。同樣，本發(fā)明的DNA分子可與其他鑒定遺傳連鎖的農(nóng)藝學(xué)上有用的性狀的方法(如AFLP標(biāo)志物，RFLP標(biāo)志物，RAPD標(biāo)志物，SNP和SSR) —起使用?？墒褂肕AB方法在雜交(或其后代和任何其他玉米栽培種或品種)的后代中追蹤除草劑抗性性狀。本發(fā)明的方法可用于鑒定具有本主題事件的任何玉米品種。本主題發(fā)明的方法包括產(chǎn)生除草劑耐受玉米植物的方法，其中所述方法包括用具有目標(biāo)事件的植物育種。優(yōu)選的方法進(jìn)一步包括通過就根據(jù)本主題發(fā)明可檢測的事件分析所述后代來選擇所述雜交的后代。舉例而言，本主題發(fā)明可用于通過與包含其他期望的性狀如農(nóng)藝學(xué)性狀的植物的育種循環(huán)來追蹤本主題事件。例如，可檢測、鑒定、選擇包含本主題事件和期望的性狀的植物，并在進(jìn)一步的育種輪次中快速使用。本主題事件/性狀亦可通過育種來與昆蟲抗性性狀和/或其他的除草劑耐受性狀組合，并根據(jù)本主題發(fā)明進(jìn)行追蹤。后者的一種優(yōu)選實(shí)施方案為包含與編碼咪唑啉酮除草劑，草甘膦和/或草銨膦的基因組合的本主題事件的植物。在一些實(shí)施方案中可使用麥草畏(dicamba)耐受基因。因此，本主題發(fā)明可與，例如編碼草甘膦抗性(例如，抗性植物或細(xì)菌EPSPS，G0X， GAT)，草銨膦抗性(例如，Pat, bar)，乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草劑抗性(例如，咪唑啉酮[如咪草煙(imazethapyr)]、磺酰脲、三唑并嘧啶磺酰苯胺、嘧啶基硫代苯甲酸類 (pyrmidinylthiobenzoates)和其他化學(xué)物[Csrl，SurA 等])，溴苯腈(bromoxynil)抗性 (例如Bxn)，對HPPD酶(4-羥基苯基丙酮酸二加氧酶)抑制劑的抗性，對八氫番茄紅素去飽和酶(phytoene desaturase) (PDS)的抑制劑的抗性，對光系統(tǒng)II抑制性除草劑(例如PsbA)的抗性，對光系統(tǒng)I抑制性除草劑的抗性，對原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase IX(PPO))抑制性除草劑(例如PP0-1)的抗性，對苯基脲除草劑(例如CYP76B1) 的抗性，麥草畏降解酶(dicamba-degrading enzyme)(參見，例如US20030135879)，和其他可單獨(dú)或以多種組合層疊的性狀相組合，以提供有效控制或預(yù)防雜草演替(weed shift)的能力和/或?qū)τ谌魏吻笆鲱愋偷某輨┑目剐??？紤]其他除草劑，一些其他的優(yōu)選ALS(亦稱作AHAS)抑制劑包括三唑并嘧啶磺酰苯胺(如氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)，雙氯磺草胺(diclosulam)，雙氟磺草胺(florasulam)，氟唑啶草(flumetsulam)，磺草唑胺(metosulam)和五氟磺草胺(penoxsulam))，嘧啶基硫代苯甲酸類(如雙嘧草醚(bispyrihc)和嘧草硫醚 (pyrithicAac))，和氟酮磺隆(f lucartazone)。一些優(yōu)選的HPPD抑制劑包括甲基磺草酮 (mesotrione)，異碌.氟草(isoxaflutole)和磺草酮(sulcotrione)。一些優(yōu)選的 PPO 抑制劑包括氟烯草酸(f lumiclorac)，丙炔氟草胺(f lumioxazin)，氟噠嗪草酯(f lufenpyr)， 吡草醚(pyraflufen)，噠草氟(fluthiacet)，氟丙嘧草酯(butafenacil)，氟酮唑草 (carfentrazone)，磺酰唑草酮(sulfentrazone)和二苯基醚類(diphenylethers)(如三氟羧草醚(acifluorfen)，氟磺胺草醚(fomesafen)，乳氟禾草靈(Iactofen)和乙氧氟草醚 (oxyfluorfen))。此外，AAD-I自身或與一種或多種其他HTC性狀層疊的AAD-I，可與一種或多種其他輸入(例如，昆蟲抗性，真菌抗性，或應(yīng)激耐受性等)或輸出(例如增加的產(chǎn)量，改善的油分布(profile)，改善的纖維品質(zhì)等)性狀層疊。因此本主題發(fā)明可用于提供改善的作物品質(zhì)與靈活且合算地控制任何數(shù)量的農(nóng)藝學(xué)病蟲害的能力的完整農(nóng)藝學(xué)套組(package)。如用于本文，“品系”為一組對于至少一種性狀在個(gè)體間顯示很少或不顯示遺傳差異的植物。此類品系可通過幾個(gè)世代的自花授粉和選擇，或從單個(gè)親本使用組織或細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行的營養(yǎng)繁殖來構(gòu)建。如用于本文，術(shù)語“栽培種”和“品種”是同義詞，并指用于商業(yè)生產(chǎn)的品系?！胺€(wěn)定性”或“穩(wěn)定的”意指對于給定組分，該組分在世代間，且優(yōu)選至少三個(gè)世代保持在基本上相同的水平，例如優(yōu)選士 15%，更優(yōu)選士 10%，最優(yōu)選士5%。穩(wěn)定性可受溫度、位置、應(yīng)激和種植時(shí)間影響。在田間條件下后續(xù)世代的比較應(yīng)以類似方式產(chǎn)生所述組分?！吧虡I(yè)實(shí)用性”定義為具有良好的植物活力(vigor)和高可育性，使得該作物可由農(nóng)民使用常規(guī)耕作設(shè)備來產(chǎn)生，且可使用常規(guī)壓榨和提取設(shè)備從種子提取具有所述組分的油。為了具有商業(yè)實(shí)用性，如通過種子重量、油含量和每英畝產(chǎn)生的全部的油測量的產(chǎn)率在其他方面相同的在相同區(qū)域種植的不具有優(yōu)等價(jià)值性狀的商業(yè)性玉米品種的平均產(chǎn)率的 15%以內(nèi)。“農(nóng)藝學(xué)上優(yōu)秀的”意指品系除了由于本主題事件的昆蟲抗性之外，還具有期望的農(nóng)藝學(xué)特征如產(chǎn)率、成熟性、疾病抗性等。農(nóng)藝學(xué)性狀可單獨(dú)或以任何組合采用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本公開基礎(chǔ)上會認(rèn)識到的，檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案可例如包括探針和/或引物。舉例而言，這包括如本文中指出的多核苷酸探針、引物和/或擴(kuò)增子。本領(lǐng)域技術(shù)人員亦會認(rèn)識到可設(shè)計(jì)引物和探針以在多種標(biāo)準(zhǔn)雜交和/或PCR條件下，與SEQ ID No:l(或其互補(bǔ)物)的片段，及其互補(bǔ)物相雜交，其中所述引物或探針并不完美地與例示的序列互補(bǔ)。即，可容忍一定程度的錯(cuò)配。例如，對于大約20個(gè)核苷酸的引物， 若錯(cuò)配的堿基在引物的內(nèi)部或與擴(kuò)增子相反的末端，通常一個(gè)或兩個(gè)左右的核苷酸并不需要與相反鏈結(jié)合。下面提供了多種適當(dāng)?shù)碾s交條件。合成的核苷酸類似物，如次黃嘌呤核苷，亦可用于探針中。亦可使用肽核酸(PNA)探針，以及DNA和RNA探針。重要的是此類探針和引物對于本主題發(fā)明的事件的存在是診斷性的(能夠獨(dú)一無二地鑒定和區(qū)分)。每種“插入”的組分圖示于圖1至3。這些組分，或其片段的DNA多核苷酸序列，可在本發(fā)明的方法中用作DNA引物或探針。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了用于在來自玉米植物的植物和種子等中檢測轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)的存在的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一個(gè)方面是包含新轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)的連續(xù)片段的DNA序列。包括了下述DNA序列，其包含充足長度的轉(zhuǎn)基因插入序列的多核苷酸和充足長度的玉米基因組序列的多核苷酸和/或可用作引物序列的序列以供產(chǎn)生對于一種或多種這種玉米植物具有診斷性的擴(kuò)增子產(chǎn)物。相關(guān)的實(shí)施方案涉及本文中鑒定的DNA序列的轉(zhuǎn)基因部分包含至少2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或更多個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)物的DNA序列。這些序列可用作DNA擴(kuò)增方法中的DNA引物。使用這些引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子對于本文中提及的玉米事件具有診斷性。因此，本發(fā)明還包括通過此類DNA引物和同源引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子和擴(kuò)增子。本發(fā)明包括在樣品中檢測對應(yīng)于本文中提及的玉米事件的DNA的存在的方法。此類方法可包括(a)將包含DNA的樣品與引物組相接觸，所述引物組當(dāng)用于用來自這些玉米事件至少之一的DNA進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生對于所述事件具診斷性的擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，由此產(chǎn)生所述擴(kuò)增子；和(c)檢測所述擴(kuò)增子。本主題發(fā)明的進(jìn)一步的檢測方法包括在樣品中檢測對應(yīng)于至少一種所述事件的 DNA的存在的方法，其中所述方法包括(a)將包含DNA的樣品與在嚴(yán)格雜交條件下與來自所述玉米事件至少之一的DNA雜交，而不在嚴(yán)格雜交條件下與對照玉米植物(非感興趣的事件的DNA)雜交的探針相接觸；(b)對樣品和探針施以嚴(yán)格雜交條件；和(c)檢測所述探針對所述DNA的雜交。本發(fā)明包括檢測樣品中來自至少一種本文中提及的玉米植物的DNA的存在的方法。此方法可包括(a)將包含DNA的樣品與本主題發(fā)明的引物組相接觸，所述引物組當(dāng)用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，與來自這些玉米事件至少之一的DNA(雜交)；(b)使用本文中鑒定的參照基因進(jìn)行TAQMAN PCR擴(kuò)增反應(yīng)；和(c)分析結(jié)果。仍在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本主題發(fā)明包括產(chǎn)生玉米植物的方法，所述玉米植物包括本發(fā)明的AAD-I事件，其中所述方法包括下述步驟(a)將第一親本玉米品系(包含本發(fā)明的表達(dá)盒，其賦予所述品系的植物以所述除草劑抗性性狀)與第二親本玉米品系(其缺乏該除草劑耐受性性狀)有性雜交，由此產(chǎn)生多株后代植物；和(b)通過使用分子標(biāo)志物選擇后代植物。此方法可任選地包括將所述后代植物與第二親本玉米品系回交以產(chǎn)生包含所述除草劑耐受性狀的真育種(true-breeding)玉米植物的進(jìn)一步步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了確定涉及本主題事件的雜交的后代的接合性的方法。所述方法可包括將包含玉米DNA的樣品與本主題的引物組相接觸。此種引物，當(dāng)用于使用來自所述玉米事件至少之一的基因組DNA的核酸擴(kuò)增時(shí)，產(chǎn)生對于所述玉米事件至少之一具診斷性的第一擴(kuò)增子。此方法進(jìn)一步包括進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，由此產(chǎn)生第一擴(kuò)增子；檢測所述第一擴(kuò)增子，并將包含玉米DNA的樣品與所述引物組相接觸，當(dāng)將所述引物組用于使用來自玉米植物的基因組DNA的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)，產(chǎn)生包含與所述玉米基因組區(qū)同源的天然玉米基因組DNA的第二擴(kuò)增子；并進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，由此產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。所述方法進(jìn)一步包括檢測所述第二擴(kuò)增子，和在樣品中比較所述第一和第二擴(kuò)增子，其中兩種擴(kuò)增子的存在表明該樣品對于所述轉(zhuǎn)基因插入是雜合的?？墒褂帽疚闹泄_的組合物和DNA檢測領(lǐng)域公知的方法開發(fā)DNA檢測試劑盒。所述試劑盒可用于在樣品中鑒定本主題玉米事件DNA，并可應(yīng)用于供育種含有該DNA的玉米植物的方法。所述制劑盒含有與所述擴(kuò)增子同源或互補(bǔ)的DNA序列，所述擴(kuò)增子例如本文中公開的擴(kuò)增子，或同與本主題事件的轉(zhuǎn)基因遺傳元件中所含DNA同源或互補(bǔ)的DNA序列同源或互補(bǔ)的DNA序列。這些DNA序列可用于DNA擴(kuò)增反應(yīng)，或作為DNA雜交方法中的探針。所述試劑盒亦可含有進(jìn)行檢測方法所需的試劑和材料?！疤结槨笔歉接诔Ｒ?guī)的可檢測標(biāo)記或報(bào)道分子(如放射性同位素、配體，化學(xué)發(fā)光劑或酶)的分離的核酸分子。此種探針與靶核酸的鏈互補(bǔ)，在本發(fā)明的情況下，與來自所述玉米事件之一的基因組DNA的鏈互補(bǔ)，無論所述其來自玉米植物或來自含有由所述事件所得的DNA的樣品。本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，且還包括聚酰胺和其他特異性結(jié)合于靶DNA序列并可用于檢測所述靶DNA序列存在的探針物質(zhì)?！耙铩睘橥ㄟ^核酸雜交與互補(bǔ)靶DNA鏈退火以形成引物和靶DNA鏈之間的雜合體，然后由聚合酶例如DNA聚合酶沿所述靶DNA鏈延伸的分離的/合成的核酸。本發(fā)明的引物對涉及其用于擴(kuò)增靶核酸序列(例如通過聚合酶式反應(yīng)(PCR)或其他常規(guī)核酸擴(kuò)增方法)的用途。探針和引物的長度一般為5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21， 22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46， 47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71， 72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96， 97,98,99,100，101，102，103，104，105,106,107，108，109，110，111，112，113，114，115，116， 117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135， 136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154， 155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173， 174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192， 193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211， 212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230， 231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249， 250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268， 269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287， 288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306， 307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344， 345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363， 364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382， 383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401， 402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420， 421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439， 440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458， 459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477， 478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496， 497,498,499或500個(gè)核苷酸或更長。此類探針和引物在高嚴(yán)格雜交條件下與靶序列特異性雜交。優(yōu)選地，本發(fā)明的探針和引物與靶序列具有完全的序列類似性，盡管可通過常規(guī)方法設(shè)計(jì)與靶序列不同并保留與靶序列雜交能力的探針。用于制備和使用探針和引物的方法描述于例如Molecular Cloning =A Laboratory Manual,2nd ed. ,vol. 1-3,ed. Sambrook Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N. Y.，1989。PCR-引物對可從已知序列，例如通過使用為此目的的計(jì)算機(jī)程序來衍生?；诒疚闹泄_的側(cè)翼DNA和插入序列的引物和探針可用于確證(且視需要，改正)通過常規(guī)方法，例如通過重新克隆此類序列和對此類序列測序而披露的序列。本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與靶DNA序列雜交?？墒褂萌魏纬Ｒ?guī)核酸雜交或擴(kuò)增方法以鑒定樣品中來自轉(zhuǎn)基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能夠在某些情況下特異性雜交于其他核酸分子。如用于本文，若兩個(gè)核酸分子能夠形成反平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則稱該兩個(gè)分子能夠彼此特異性雜交。若兩個(gè)核酸分子呈現(xiàn)完全互補(bǔ)性，則稱一個(gè)核酸分子為另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。如用于本文，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核苷酸互補(bǔ)于另一個(gè)分子的核苷酸時(shí)，稱這些分子呈現(xiàn)“完全互補(bǔ)性”。若兩個(gè)分子可以以足夠的穩(wěn)定性相互雜交以允許其在至少常規(guī)的“低嚴(yán)格”條件下維持彼此粘合(anneal)，則稱其為“最低限度互補(bǔ)的(minimally complementary) 類似地，若兩個(gè)分子可以以足夠的穩(wěn)定性相互雜交以允許其在常規(guī)的“高嚴(yán)格”條件下維持彼此粘合，則稱其為“互補(bǔ)的”。常規(guī)的嚴(yán)格條件描述于Sambrook等，1989。因此，可允許與完全互補(bǔ)的偏離，只要該偏離并不完全排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子充當(dāng)引物或探針，僅需其序列充分互補(bǔ)以能夠在采用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙聯(lián)結(jié)構(gòu)。如用于本文，基本上同源的序列是會與其在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行比較的核酸序列的互補(bǔ)物特異性雜交的核酸序列。術(shù)語“嚴(yán)格條件”是對于核酸探針對靶核酸通過Sambrook 等，1989在9. 52-9. 55處討論的特異性雜交步驟而雜交進(jìn)行的功能限定(還可見于 Sambrook等，1989,9. 47-9. 52和9. 56-9. 58)。相應(yīng)地，本發(fā)明的核苷酸序列可就其與DNA 片段的互補(bǔ)段選擇性低形成雙鏈體分子的能力而使用。取決于考慮到的應(yīng)用，可使用多種雜交條件以獲得探針對靶序列的不同程度的選擇性。對于需要高選擇性的應(yīng)用，可通常采用相對嚴(yán)格的條件來形成雜合體，例如，會選擇相對低鹽和/或高溫度的條件，如由約0. 02M至約0. 15M NaCl在約50°C至約70°C的溫度提供的條件。嚴(yán)格條件，例如，可涉及用高嚴(yán)格性洗滌緩沖液(0. 2X SSC,0. 1% SDS，65°C )洗滌雜交濾紙至少兩次。促進(jìn)DNA雜交的適當(dāng)嚴(yán)格條件，例如在約45°C的6. OX氯化鈉/檸檬酸鈉(350，接著在501用2.(^ SSC的洗滌，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。舉例而言， 洗滌步驟中的鹽濃度可選自在50°C的約2. OX SSC的低嚴(yán)格度至在50°C的約0. 2X SSC的高嚴(yán)格度。此外，洗滌步驟中的溫度可從室溫約22°C的低嚴(yán)格條件增加至約65°C的高嚴(yán)格條件。溫度和鹽均可變化，或可將溫度或鹽濃度之一維持恒定的同時(shí)改變另一個(gè)變量。此類選擇性條件幾乎不容忍探針和模板或靶鏈之間的錯(cuò)配(若有的話)。通過雜交檢測DNA 序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，且美國專利號4，965，188和5，176，995的教導(dǎo)是雜交分析方法的實(shí)例。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸會在高嚴(yán)格條件下特異性雜交于本文中例示或提出的一種或多種引物(或擴(kuò)增子或其他序列)，包括其互補(bǔ)物和片段。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的核酸分子具有SEQ ID NO :2-7中列出的核酸序列，或其互補(bǔ)物和/ 或片段。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的標(biāo)志物核酸分子與此類核酸序列分享80%至 100%或90%至100%的序列同一性。在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的標(biāo)志物核酸分子與此種序列分享95%至100%的序列同一性。此類序列可用作植物育種方法中的標(biāo)志物以鑒定遺傳雜交的后代。探針對靶DNA分子的雜交可通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的數(shù)種方法來檢測，其可包括但不限于熒光標(biāo)記，放射性標(biāo)記，基于抗體的標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。對于使用特定擴(kuò)增引物對擴(kuò)增靶核酸序列(例如，通過PCR)，“嚴(yán)格條件”為允許引物對僅雜交于會與具有對應(yīng)的野生型序列(或其互補(bǔ)物)的引物結(jié)合并優(yōu)選產(chǎn)生獨(dú)特?cái)U(kuò)增產(chǎn)物即擴(kuò)增子的靶核酸序列的條件。術(shù)語“特異于(靶序列)/對(靶序列)特異性的”表明探針或引物在嚴(yán)格雜交條件下僅與包含所述靶序列的樣品中的靶序列雜交。如用于本文，“擴(kuò)增的DNA”或“擴(kuò)增子”指作為核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。舉例而言，為了確定從有性雜交獲得的玉米植物是否含有來自本發(fā)明的玉米植物的轉(zhuǎn)基因事件基因組DNA，可對從玉米植物組織提取的DNA進(jìn)行使用引物對的核酸擴(kuò)增方法以產(chǎn)生對于所述事件DNA的存在為診斷性的擴(kuò)增子，所述引物對包括來源于所述植物基因組中鄰近插入的異源DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列的引物，和來源于插入的異源DNA的第二引物。所述擴(kuò)增子的長度和具有的序列使其亦對該事件具診斷性。所述擴(kuò)增子的長度的范圍可為引物對的合并長度加上一個(gè)核苷酸堿基對，和/或引物對的合并長度加上約2， 3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30， 31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55， 56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80， 81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104， 105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123， 124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142， 143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161， 162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180， 181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199， 200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237， 238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256， 257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275， 276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294， 295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313， 314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332， 333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351， 352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370， 371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389， 390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408， 409，410，411,412，413，414，415，416,417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427， 428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446， 447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465， 466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484， 485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，或 500，750，1000， 1250，1500，1750，2000或更多個(gè)核苷酸堿基對(加上或減去任何上述列出的增量)?；蛘撸?引物對可來源于插入的DNA兩側(cè)的側(cè)翼序列從而產(chǎn)生包括整個(gè)插入核苷酸序列的擴(kuò)增子。 來源于植物基因組序列的引物對的成員可位于距插入的DNA序列一定距離處。該距離的范圍可為一個(gè)核苷酸堿基對至約兩萬個(gè)核苷酸堿基對。術(shù)語“擴(kuò)增子”的使用特別排除了可在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚體。核酸擴(kuò)增可通過任何本領(lǐng)域中已知的多種核酸擴(kuò)增方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來實(shí)現(xiàn)。多種擴(kuò)增方法在本領(lǐng)域是已知的，并描述于除其他之外，美國專利號 4，683，195和美國專利號4，683，202。開發(fā)了 PCR擴(kuò)增方法以擴(kuò)增高至221Λ的基因組DNA。 這些方法，以及本領(lǐng)域已知的其他DNA擴(kuò)增的方法可用于本發(fā)明的實(shí)踐。可驗(yàn)證(視需要， 可校正)來自主題玉米事件的異源轉(zhuǎn)基因DNA插入的序列或側(cè)翼基因組序列，即使用來源于本文中提供的序列的引物來擴(kuò)增此類序列，接著對PCR擴(kuò)增子或克隆的DNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)DNA 測序。可通過多種技術(shù)檢測由這些方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子。瓊脂糖凝膠電泳和用溴乙錠的染色是檢測DNA擴(kuò)增子的常見公知方法。另一此類方法是Genetic BitAnalysis，其中設(shè)計(jì)了與鄰接的側(cè)翼基因組DNA序列和插入的DNA序列兩者重疊的DNA寡核苷酸。將所述寡核苷酸固定于微孔板的孔中。在對感興趣的區(qū)域的PCR(使用一個(gè)在插入序列中的引物和一個(gè)在鄰接側(cè)翼基因組序列中的引物)之后，可將單鏈PCR產(chǎn)物與固定的寡核苷酸雜交，并充當(dāng)模板用于單堿基延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)使用DNA聚合酶和對預(yù)期的接下來的堿基具有特異性的標(biāo)記的ddNTP。讀數(shù)可為熒光性的或基于ELISA的。信號表明由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸所致的插入/側(cè)翼序列的存在。本文中提及或引用的所有專利、專利申請、臨時(shí)申請和公開以其不與本說明書的明確教導(dǎo)不一致的程度通過全文提述并入本文。除非臨行指明，使用下述縮寫AAD-I芳氧基鏈烷酸酯二加氧酶-1bp堿基對0C攝氏度DNA脫氧核糖核酸DIG地高辛(digoxigenin)EDTA乙二胺四乙酸kb千堿基Pg微克μ ν微升mL毫升M分子量OLP重疊探針PCR聚合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
PTU植物轉(zhuǎn)錄單元
SDS十二烷基疏酸鈉
SOP標(biāo)準(zhǔn)操作方法
SSC含有氯化鈉和檸檬酸鈉的混合物pH 7.0的緩沖溶液
TBE含有Tris堿，硼酸和EDTA的混合物，pH 8.3的緩沖溶液
V伏特實(shí)施例實(shí)施例1 事件特異件Taaman測定法開發(fā)了事件特異性Taqman測定法以檢測玉米事件DAS_40278_9的存在和確定育種群體中植物的接合性狀態(tài)。為了開發(fā)事件特異性測定法，根據(jù)位于5’插入植物的接點(diǎn)處的DNA序列設(shè)計(jì)特異性Taqman引物和探針。對于DAS_40278_9的特異性檢測，使用兩種特異性引物擴(kuò)增跨越該5’整合接點(diǎn)的73-bp DNA片段。通過由Applied Biosystems合成的、 在其5’端含有FAM報(bào)道子的靶特異性MGB探針測量該P(yáng)CR產(chǎn)物的擴(kuò)增。針對16種不同 AAD-I玉米事件和雙鏈形式的非轉(zhuǎn)基因玉米品種用玉米特異性內(nèi)源參照基因即轉(zhuǎn)化酶來測試對于AAD-I玉米事件DAS-40278-9的該I^aqman檢測方法的特異性。實(shí)施例L 1 :gPNA分離在該研究中測試16個(gè)不同AAD-I玉米事件和非轉(zhuǎn)基因玉米品種的gDNA樣品。用兩種方法，Qiagen試劑盒或CTAB，來提取gDNA。對于用Qiagen制劑盒提取gDNA樣品，根據(jù)修飾的Qiagen DNeasy 96Plant Kit的實(shí)驗(yàn)方案，使用八片玉米新鮮葉片用于gDNA提取。 對于使用CTAB步驟提取的gDNA樣品，遵循來自Permingeat等，1998的實(shí)驗(yàn)方案使用約0. 3g凍干的葉組織。根據(jù)銷售商的指示(Molecular Probes, Eugene, 0R)，用Pico Green 方法對gDNA進(jìn)行定量。用不含DNase的水稀釋gDNA樣品，得到IOng/ μ L的濃度以供本研究的目的。實(shí)施例1. 2 =Taaman測定法和結(jié)果對于DAS-40278-9事件特異性Taqman測定法來設(shè)計(jì)具體Taqman引物和探針?？捎孟卤硭械臈l件來使用這些試劑以檢測AAD-I玉米事件DAS-40278-9。表1列出了特別對于事件DAS-40278-9的檢測來開發(fā)的引物和探針序列。表1:PCR引物和探針
權(quán)利要求
1.一種用于確定玉米植物的接合性的方法，所述植物包含AAD-I玉米事件 DAS-40278-9,所述事件包含轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體包含AAD-I基因，所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的側(cè)翼為5’側(cè)翼玉米基因組DNA和3’側(cè)翼玉米基因組DNA，所述方法包括獲得來自所述玉米植物的基因組DNA的DNA樣品；通過將所述DNA樣品與下述接觸來產(chǎn)生接觸的樣品a.第一事件引物和第二事件引物，其中所述第一事件引物特異性結(jié)合所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，所述第二事件引物特異性結(jié)合所述5’玉米基因組側(cè)翼DNA或所述3’玉米基因組側(cè)翼 DNA，且其中所述第一事件引物和所述第二事件引物，當(dāng)置于TAQMAN PCR條件下時(shí)，產(chǎn)生事件擴(kuò)增子b.參照正向引物和參照反向引物，其當(dāng)置于TAQMANPCR條件下時(shí)，產(chǎn)生來自內(nèi)源玉米參照基因的參照擴(kuò)增子c.熒光事件探針，其與所述事件擴(kuò)增子雜交d.熒光參照探針，其與所述參照擴(kuò)增子雜交；將所述接觸的樣品置于基于熒光的終點(diǎn)TAQMAN PCR條件下；對雜交于所述事件擴(kuò)增子的所述熒光事件探針進(jìn)行定量；對雜交于所述參照擴(kuò)增子的所述熒光參照探針進(jìn)行定量；將雜交的熒光事件探針的量與雜交的熒光參照探針的量相比較；和通過比較雜交的熒光事件探針和雜交的熒光參照探針的熒光比來確定DAS-40278-9 的接合性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增子由50-100個(gè)殘基組成。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述5，側(cè)翼DNA包含SEQID No 29的殘基1-1873，并且所述3，側(cè)翼DNA包含SEQ ID No 29的殘基6690-8557。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體由SEQID No 29的殘基1874-6689組成。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述參照基因是內(nèi)源玉米(Zeamays)轉(zhuǎn)化酶基因。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二事件引物結(jié)合SEQID No : 的殘基1673-1873或其互補(bǔ)物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二事件引物結(jié)合SEQID No :29的殘基6690-6890。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法用于將所述事件育種漸滲入另一玉米品系。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述另一玉米品系缺乏所述事件。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述事件擴(kuò)增子為73個(gè)堿基對。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述參照基因包含選自下組的序列或與選自下組的序列雜交=SEQ ID No 5, SEQ ID No 6 和 SEQ ID No -J0
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述參照引物包含SEQID No :5和SEQ ID No :6，并且所述參照探針包含SEQ ID No :7。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針用熒光染料和淬滅劑標(biāo)記。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述事件探針包含在所述事件探針5’端處的作為所述熒光染料的FAM，和在所述事件探針3’端的MGB淬滅劑。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述參照擴(kuò)增子是由所述引物擴(kuò)增的79個(gè)堿基對片段。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述參照探針用HEX在所述參照探針的5’端并用Black Hole Quencher 2 (BHQ2)在所述參照探針的3，端標(biāo)記。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述事件擴(kuò)增子由SEQID No :8組成，并且所述參照擴(kuò)增子由SEQ ID No 9組成。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述事件探針包含SEQID No :4。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述事件引物選自下組SEQID No 2和SEQ ID No :3。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法的結(jié)果直接在讀板器中讀取。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA樣品從田間的玉米植物獲得。
22.一種進(jìn)行權(quán)利要求1的方法的試劑盒，所述試劑盒包含所述第一事件引物，所述第二事件引物，所述參照正向引物，所述參照反向引物，所述事件探針和所述參照探針。
23.權(quán)利要求22的試劑盒，其中所述事件引物由SEQID No 2和SEQ ID No 3組成， 所述參照引物由SEQ ID No 5和SEQ ID No 6組成，所述事件探針由SEQ ID No 4組成， 并且所述參照引物由SEQ ID No 7組成。
全文摘要
本發(fā)明部分涉及檢測除草劑耐受性植物——更具體而言，玉米植物中的aad-1轉(zhuǎn)化事件。本主題發(fā)明還提供了用于在樣品(例如，玉米粒)中檢測本主題事件的存在的測定法。還提供了可用于進(jìn)行所述測定法的試劑盒和條件。本主題發(fā)明還部分涉及使用本主題方法的植物育種。在一些實(shí)施方案中，所述事件/多核苷酸序列可與其他性狀“層疊”。更具體而言，本發(fā)明部分涉及用于AAD-1玉米事件40278-9的終點(diǎn)TaqMan PCR測定法。一些實(shí)施方案涉及能夠進(jìn)行高通量接合性分析的測定法。本主題發(fā)明進(jìn)一步部分涉及優(yōu)選的參照基因用于確定接合性的用途。
文檔編號C12Q1/68GK102575299SQ201080047115
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日
發(fā)明者N.周, S.諾瓦克, T.W.格林, Y.C.崔 申請人:陶氏益農(nóng)公司