專利名稱：含有蝦青素的組合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有蝦青素的組合物的制備方法。特別是涉及使含有3-羥基-3'， 4' - 二脫氫-β，Ψ-胡蘿卜素-4-酮(HDCO)的含有蝦青素的組合物中的HDCO相對于蝦青素的相對量降低的方法。
背景技術(shù)：
蝦青素是一種天然存在的類胡蘿卜素，可作為改善養(yǎng)殖魚的肉和皮膚顏色的飼料用添加劑廣泛使用，同時，近年來作為功能性食品原材料備受關(guān)注。已知蝦青素是通過屬于法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)(原名紅法夫酵母屬(Phaffia))、短波單胞桿菌屬(Brevundimonas)、紅球藻屬(Haematococcus)、衣藻屬(Chlamydomonas)、單針藻屬(Monoraphidium)、赤細(xì)菌屬(Erythrobacter) > ff lif M (Agrobacterium)、副球菌屬(Paracoccus)、盤蜷綱(Labyrinthulea)等的微生物的細(xì)胞生產(chǎn)的，此外還可以通過化學(xué)合成制備。3-羥基-3'，4' - 二脫氫_β，Ψ-胡蘿卜素-4-酮(下文簡稱為HDC0)是類胡蘿卜素中的一種，是可在蝦青素生物合成體系中發(fā)現(xiàn)的副產(chǎn)物。由于HDCO的生物學(xué)功能未知，因此，在含有蝦青素的組合物作為例如飼料、食品、食品添加劑或藥物使用之時，優(yōu)選所述組合物中的HDCO相對于蝦青素的相對量較低。一方面，據(jù)報告，在希望通過突變改良法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)(原名 紅法夫酵母屬(PhafTia))的酵母而提高蝦青素含量的情況下，隨著蝦青素含量升高，HDCO 相對于蝦青素的相對量也有升高的傾向(專利文獻(xiàn)1)。關(guān)于獲得HDCO相對于蝦青素的相對量低的含有蝦青素的組合物的方法，專利文獻(xiàn)1公開了從誘發(fā)偶然突變的法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)酵母株中獲得同時實(shí)現(xiàn)高蝦青素含量和低HDCO含量的突變株的方法，和由所述突變株獲得含有蝦青素的組合物的方法。專利文獻(xiàn)1中記載了獲得目標(biāo)突變株的方法，從紅色菌落(蝦青素含量高，且具有相對于蝦青素較高的HDCO含量)的固體物中，通過視覺選擇強(qiáng)烈著色為桔色的菌落，所述桔色菌落蝦青素含量高，且具有相對于蝦青素較低的HDCO含量。然而，由于蝦青素含量低的突變株等菌落的紅色變?nèi)?，僅根據(jù)菌落顏色選擇目標(biāo)菌株是非常困難的，目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)受偶然性左右，并且需要大量的時間和勞動力。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本專利第3202018號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題實(shí)際上，本發(fā)明人考慮到，以提高蝦青素含量為目的，對法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)進(jìn)行突變改良的結(jié)果如下文所示，所獲得的高蝦青素含量菌株中的 HDCO的量，相對于蝦青素都超過10%，獲得如專利文獻(xiàn)1的突變株的頻率非常低。因此，本發(fā)明的目的是提供一種極為簡單的方法，以減少含有HDCO的含有蝦青素的組合物中HDCO 相對于蝦青素的相對量。解決問題的方法本申請發(fā)明人為了解決上述問題，進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將含有蝦青素和 HDCO的組合物與pH 3以下的酸性介質(zhì)和/或pH 9以上的堿性介質(zhì)接觸，使所述組合物中的HDCO相對于蝦青素的相對量降低，從而完成了本發(fā)明。換言之，本申請發(fā)明涉及使含有蝦青素和HDCO的組合物與pH 3以下的酸性介質(zhì)和/或pH 9以上的堿性介質(zhì)接觸，使所述組合物中的HDCO相對于蝦青素的相對量降低的方法。此外，涉及含有蝦青素的組合物的制備方法，所述方法包括使含有蝦青素和HDCO的組合物與PH 3以下的酸性介質(zhì)和/或pH 9以上的堿性介質(zhì)接觸，使所述組合物中HDCO相對于蝦青素的相對量降低的步驟。進(jìn)一步的，涉及包含通過上述方法獲得的含有蝦青素的組合物的飼料、食品、食品添加劑及藥物。發(fā)明的效果按照本申請發(fā)明，可以有效降低含有蝦青素和HDCO的組合物中的HDCO相對于蝦青素的相對量。HDCO相對于蝦青素的相對量降低了的含有蝦青素的組合物，可用作例如飼料、食品、食品添加劑或藥物。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式本申請發(fā)明中使用的含有蝦青素和HDCO的組合物，只要含有這兩種化合物即可， 對這些化合物以外的組成沒有特別的限制，例如，可列舉同時生產(chǎn)兩種化合物的細(xì)胞培養(yǎng)液、培養(yǎng)上清液、細(xì)胞體和細(xì)胞體的破碎物、干燥物、提取物等，以及它們的部分純化物等。 此外，只要含有HDC0，含有化學(xué)合成制備的蝦青素的組合物也相當(dāng)于本發(fā)明使用的含有蝦青素和HDCO的組合物。同時生產(chǎn)兩種化合物的細(xì)胞可列舉屬于例如法夫酵母屬(Xanthophyllomyces) (原名紅法夫酵母屬(Phaffia))、短波單胞桿菌屬(Brevundimonas)、紅球藻屬 (Haematococcus)、衣藻屬(Chlamydomonas)、單針藻屬(Monoraphidium)、赤細(xì)菌屬(Erythrobacter)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、副球菌屬(Paracoccus)、盤蜷綱 (Labyrinthulea)等的微生物，其突變株、其基因重組菌株及其自身克隆株的細(xì)胞，但不限于此。 關(guān)于屬于盤蜷綱(Labyrinthulea)的微生物，可列舉例如屬于破囊壺菌屬 (Thraustochytrium)、裂殖壺菌屬(Schizochytrium)禾口 Labyrinthula 屬的微生物。用于本申請發(fā)明的酸性介質(zhì)指在用玻璃電極法測定pH時，顯示為pH 3以下、優(yōu)選 2以下、更優(yōu)選1以下、進(jìn)一步優(yōu)選0.5以下、更進(jìn)一步優(yōu)選0. 1以下的液體，例如通過將酸性物質(zhì)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲卸@得的。只要可獲得本發(fā)明的效果，則對酸性物質(zhì)沒有特殊的限制，可列舉例如氯化氫、硫酸、磷酸、硝酸等無機(jī)酸，甲酸、醋酸等有機(jī)酸，氯化氫和硫酸是特別優(yōu)選的?？梢詥为?dú)使用這些酸性物質(zhì)，也可以任意的組合使用。用于本發(fā)明的堿性介質(zhì)指在用玻璃電極法測定pH時，顯示為pH 9以上、優(yōu)選10 以上、更優(yōu)選11以上、進(jìn)一步優(yōu)選12以上、更進(jìn)一步優(yōu)選13以上、更進(jìn)一步優(yōu)選13. 5以上、更進(jìn)一步優(yōu)選13. 9以上的液體，例如通過將堿性物質(zhì)溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲卸@得的。只要可獲得本發(fā)明的效果，則對堿性物質(zhì)沒有特殊的限制，可列舉例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂等堿金屬或堿土金屬的氫氧化物，氨水，胺類等，氫氧化鈉是特別優(yōu)選的?？梢詥为?dú)使用這些堿性物質(zhì)，也可以任意的組合使用。只要可獲得本發(fā)明的效果，則對溶解酸性物質(zhì)和/或堿性物質(zhì)的溶劑沒有特殊的限制，可列舉例如水、乙醇、丙酮、甲醇或其混合溶劑等，水是優(yōu)選的。此外，在含有蝦青素和 HDCO的組合物中所含的溶劑也可用作構(gòu)成酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)的溶劑。在以上述方法進(jìn)行測定的情況下，酸性介質(zhì)顯示為pH3以下、優(yōu)選2以下、更優(yōu)選 1以下、進(jìn)一步優(yōu)選0.5以下、更進(jìn)一步優(yōu)選0. 1以下，只要可以獲得本發(fā)明的效果，也可以含有除上述酸性物質(zhì)和溶劑以外的化合物。此外，在以上述方法測定的情況下，堿性介質(zhì)顯示為pH 9以上、優(yōu)選10以上、更優(yōu)選11以上、進(jìn)一步優(yōu)選12以上、更進(jìn)一步優(yōu)選13以上、 更進(jìn)一步優(yōu)選13. 5以上、更進(jìn)一步優(yōu)選13. 9以上，只要可以獲得本發(fā)明的效果，也可以含有除上述堿性物質(zhì)和溶劑以外的化合物。只要可以獲得本發(fā)明的效果，關(guān)于對使含有蝦青素和HDCO的組合物與酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)接觸的步驟，其實(shí)施方法沒有特殊的限制，例如可以將含有蝦青素和HDCO 的組合物，和酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)裝入合適的容器、反應(yīng)罐等中，必要時通過混合來實(shí)施。此外，也可以在配管中實(shí)施混合。此時，適當(dāng)調(diào)節(jié)所述混合物的溫度是優(yōu)選的。上限溫度通常是140°C，優(yōu)選100°C， 更優(yōu)選90°C，進(jìn)一步優(yōu)選70°C。下限溫度通常是_20°C，優(yōu)選0°C，進(jìn)一步優(yōu)選10°C，更進(jìn)一步優(yōu)選30°C。超過上述的上限溫度時，蝦青素有趨于不穩(wěn)定的傾向，在低于上述的下限溫度時，有難以操作的傾向。此外，只要可以獲得本發(fā)明的效果，對于使含有蝦青素和HDCO的組合物與酸性介質(zhì)或堿性介質(zhì)接觸的時間沒有特殊的限制，上限時間通常是12000分鐘，優(yōu)選1200分鐘，更優(yōu)選300分鐘。下限時間通常是1分鐘，優(yōu)選10分鐘，更優(yōu)選60分鐘。對于含有蝦青素和HDCO的組合物所接觸的酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)的pH、接觸時的溫度、接觸的時間，可以選擇它們的任意組合，只要可以獲得本發(fā)明的效果，則對所述組合沒有特殊的限制?？梢愿鶕?jù)含有蝦青素和HDCO的組合物形態(tài)、使用的酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)的種類、使用的酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)的PH，接觸處理時的混合條件等，選擇適當(dāng)?shù)慕M合?？梢杂肏PLC分析所述組合物，根據(jù)在471nm的吸光度下檢測獲得的分析圖表上的蝦青素的峰面積和HDCO的峰面積，通過以下計(jì)算公式算出含有蝦青素和HDCO的組合物中， HDCO相對于蝦青素的相對量HDCO相對于蝦青素的相對量(％ ) = (HDC0的峰面積/蝦青素的峰面積)X 100上述HPLC分析可以通過如下實(shí)施，使用例如YMC Carotenoid (4. 6 X 250mm ；YMC 公司)作為柱子，將柱溫設(shè)定為20°C，流動相使用A液甲醇/甲基-叔丁醚/1%磷酸水溶液=82/15/3，和B液甲醇/甲基-叔丁醚/水/磷酸=7/90/3/0. 03，樣品注入后的 0-30分鐘為A液100%, 30-90分鐘為A液100%向B液100%的線性梯度，90-95分鐘為B 液100%的條件，按1. Oml/分鐘的流速進(jìn)行通液?？梢园凑障率鰲l件，使用HPLC對含有蝦青素和HDCO的組合物進(jìn)行分析，例如必要時將所述組合物溶解在恰當(dāng)?shù)娜軇┲校⑷際PLC裝置中。溶解所述組合物的溶劑可以使用例如二甲基亞砜、丙酮、氯仿、二氯甲烷、甲醇或其任意組合而成的混合溶劑，但只要可以溶解所述組合物，就沒有特別的限制。此外，在所述組合物含有具有蝦青素生產(chǎn)能力的細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞體或其破碎物等這些對上述溶劑呈現(xiàn)非溶解性的成分的情況下，可以例如通過將在上述溶劑中機(jī)械破碎所述組合物而獲得的提取物注入HPLC裝置中，再進(jìn)行所述分析。 上述機(jī)械破碎的方法可列舉例如使用玻璃珠的方法、壓力破碎方法。本發(fā)明使用的含有蝦青素和HDCO的組合物，只要含有這兩種化合物即可，沒有特別的限制，可列舉例如以上述方法計(jì)算的HDCO相對于蝦青素的相對量優(yōu)選在1 %以上，更優(yōu)選在5%以上的組合物。從最大限度發(fā)揮本發(fā)明的效果的觀點(diǎn)出發(fā)，更優(yōu)選HDCO相對于蝦青素的相對量在10%以上，特別優(yōu)選在15%以上。如上所述，在改良法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)(原名紅法夫酵母屬 (Phaffia))的微生物以提高蝦青素含量的情況下，HDCO相對于蝦青素的相對量也有提高的趨勢。因而，本發(fā)明中使用的含有蝦青素和HDCO的組合物優(yōu)選蝦青素含量在2000μ g/ g干細(xì)胞以上的法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)微生物的細(xì)胞，或者從該細(xì)胞中獲得的含有蝦青素的組合物。更優(yōu)選的是蝦青素含量在3000 μ g/g干細(xì)胞以上，進(jìn)一步優(yōu)選的是蝦青素含量在5000 μ g/g干細(xì)胞以上，更進(jìn)一步優(yōu)選蝦青素含量在8000 μ g/g干細(xì)胞以上，特別優(yōu)選蝦青素含量在10000 μ g/g干細(xì)胞以上的法夫酵母屬(Xanthophyllomyces) 的微生物的細(xì)胞，或者從所述細(xì)胞中獲得的含有蝦青素的組合物。在這些法夫酵母屬 (Xanthophyllomyces)的微生物中，或者在從所述微生物中獲得的含有蝦青素的組合物中， HDCO相對于蝦青素的相對量優(yōu)選在10%以上，更優(yōu)選在15%以上。在本發(fā)明中，在使HDCO相對于蝦青素的相對量減少的步驟，S卩，在使其接觸酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)的步驟的前后，以上述方法計(jì)算的HDCO相對于蝦青素的相對量(％ ) 通常減少0. 1百分點(diǎn)(pp)以上，優(yōu)選0. 5pp以上，更優(yōu)選Ipp以上，進(jìn)一步優(yōu)選2pp以上， 更進(jìn)一步優(yōu)選3pp以上，更進(jìn)一步優(yōu)選4pp以上，更進(jìn)一步優(yōu)選5pp以上。減少1個百分點(diǎn) (PP)以上是指按照(處理前的組合物中HDCO相對于蝦青素的相對量(％))_(處理后的組合物中 HDCO相對于蝦青素的相對量(％ ))計(jì)算的數(shù)值是1以上。根據(jù)本發(fā)明制備的、HDCO相對于蝦青素的相對量降低了的含有蝦青素的組合物， 在必要時將酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)中和后，視情況而定以常規(guī)的操作與其分離，在必要時進(jìn)行清洗，可以將其用作能夠作為飼料、食品、食品添加劑或藥物的含有蝦青素的組合物。此外，也可將上述獲得的組合物進(jìn)一步純化后，用于上述用途。上述的常規(guī)操作可以按照下述方法實(shí)施，例如存在可以溶解本申請發(fā)明組合物、 且可以與酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)相分離的溶劑的情況下，通過將本申請發(fā)明的組合物溶解在該溶劑中，將組合物溶解于該溶劑中得到的溶液與酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)分離后進(jìn)行水洗，并將該溶劑蒸餾除去，所述本申請發(fā)明的組合物使HDCO相對于蝦青素的相對量降低了的組合物。此外，在沒有可以溶解所述組合物的溶劑的情況下，上述常規(guī)操作可以按照下述實(shí)施，通過例如連續(xù)離心分離或過濾等操作，將所述組合物與酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)分離，必要時進(jìn)行水洗。但是，上述的常規(guī)操作并不限于此?？梢赃M(jìn)一步加工如此獲得的含有蝦青素的組合物，成為適合作為飼料、食品、食品添加劑或藥物的制品形式，所述制品也包含在本發(fā)明中。在本申請發(fā)明中，所述飼料指給予例如魚、甲殼類、貝類等水產(chǎn)動物，雞、鵪鶉、鴨等家禽類，牛、豬、羊等畜牧動物，狗、貓等寵物等的飼料或添加劑等，但并不限于此。此外， 在本申請發(fā)明中，所述食品除主食以外，還包括著色劑、添加劑等，但并不限于此。如上所述，根據(jù)本申請發(fā)明，可以有效的降低含有蝦青素和HDCO的組合物中的 HDCO相對于蝦青素的相對量，可以從含有蝦青素和HDCO的組合物，有效的獲得適合作為飼料、食品、食品添加劑、藥物等使用的、混入更少HDCO的含有蝦青素的組合物。
實(shí)施例下文通過實(shí)施例對本申請發(fā)明做以更具體的說明，但不是將本申請發(fā)明的范圍限定于此。[用于分析蝦青素和HDCO的提取方法]在含有蝦青素和HDCO的組合物是例如微生物菌體等的情況下，獲得含有蝦青素和HDCO的提取物的方法可以利用使用玻璃珠的機(jī)械破碎方法。通過該方法獲得的含有蝦青素和HDCO的提取物可提供至使用了 HPLC裝置的分析。將所述組合物裝入可以密封的1. 5ml容積的塑料制容器中，通過離心分離獲得沉淀。將沉淀水洗后，通過再次的離心分離去除上清液。向獲得的沉淀中加入Ig玻璃珠(直徑0.5mm)、lml丙酮，用Multi Beads shocker (安井器械公司制造)處理。然后，通過過濾器過濾(- 7毛少^ 7 7 ^義夕一 S，0.45 μ m，Millipore公司生產(chǎn))去除固體和玻璃珠后，可以獲得提取出蝦青素、HDCO的丙酮溶液。此外，Multi Beads shocker對所述組合物的破碎是重復(fù)30秒破碎和30秒冷卻 (4°C )各5次，分析時使用確認(rèn)已充分破裂的所述組合物。[蝦青素生產(chǎn)菌中的HDCO的相對量]用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)將紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)NBRC 101 菌株(由獨(dú)立行政法人制品評價技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物遺傳資源部門，〒四2-0818千葉縣木更津市KAZUSA鐮足2_5_8獲得)進(jìn)行誘變處理后，挑選瓊脂平板上紅色強(qiáng)的菌落，獲得蝦青素含量提高的突變株。對所獲得的突變株重復(fù)進(jìn)行同樣的操作，獲得蝦青素含量進(jìn)一步提高的突變株。如此獲得蝦青素含量提高的突變株紅發(fā)夫酵母 (Xanthophyllomyces dendrorhous) KNK-Ol 株、KNK_02_1 株、ΚΝΚ-02-2 株和 KNK-O3 株。所獲得突變株的蝦青素含量和HDCO相對于蝦青素的相對量如表1所示。如下進(jìn)行突變株的培養(yǎng)。在500ml容積的坂口燒瓶中加入30ml培養(yǎng)基(磷酸銨1. 3 %、磷酸鉀 0.7(%、琥珀酸0.6(%、酵母提取物0.3(%、？!1 5. 4)，用高壓滅菌鍋進(jìn)行滅菌。接種蝦青素生產(chǎn)菌株，在20°C振蕩培養(yǎng)180小時。在培養(yǎng)開始時，添加0. 3g葡萄糖，之后每12小時補(bǔ)充 0. 3g葡萄糖。[表 1]
權(quán)利要求
1.含有蝦青素的組合物的制造方法，該方法包括下述步驟使含有蝦青素和3-羥基-3’，4’_ 二脫氫-β，Ψ-胡蘿卜素-4-酮(HDCO)的組合物與ρΗ 3以下的酸性介質(zhì)和/ 或PH 9以上的堿性介質(zhì)接觸，從而使所述組合物中的HDCO相對于蝦青素的相對量降低。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含有蝦青素和HDCO的組合物選自具有蝦青素生產(chǎn)能力的細(xì)胞、細(xì)胞的一部分、細(xì)胞提取物、和/或它們的部分純化物。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述具有蝦青素生產(chǎn)能力的細(xì)胞為屬于法夫酵母屬 (Xanthophy 1 lomyces)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、紅球藻屬(Haematococcus)、衣藻屬(Chlamydomonas)、單針藻屬(Monoraphidium)、赤細(xì)菌屬(Erythrobacter) > ^kffliiM (Agrobacterium)、副球菌屬(Paracoccus)、盤蜷綱(Labyrinthulea)的微生物的細(xì)胞。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述具有蝦青素生產(chǎn)能力的細(xì)胞為屬于法夫酵母屬 (Xanthophyllomyces)的微生物。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述屬于法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)的微生物的蝦青素含量為2000 μ g/g干細(xì)胞以上。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述含有蝦青素和HDCO的組合物中的 HDCO相對于蝦青素的相對量為1 %以上。
7.權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述酸性介質(zhì)的ρΗ為2以下。
8.權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述堿性介質(zhì)的ρΗ為10以上。
9.權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在與酸性介質(zhì)和/或堿性介質(zhì)接觸后， HDCO相對于蝦青素的相對量降低0. 1 %以上。
10.飼料、食品、食品添加劑或藥物，其包含通過權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的方法獲得的含有蝦青素的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過使含有蝦青素和3-羥基-3′，4′-二脫氫-β，Ψ-胡蘿卜素-4-酮(HDCO)的組合物與pH 3以下的酸性介質(zhì)和/或pH 9以上的堿性介質(zhì)接觸，使所述組合物中的HDCO相對于蝦青素的相對量降低的方法；并且涉及含有蝦青素的組合物的制備方法，所述制備方法包括通過上述相對量降低方法以降低HDCO的相對量的步驟，根據(jù)本發(fā)明，可以以簡單的方法降低包含在含有蝦青素的組合物中的生物學(xué)功能未知的HDCO的相對量。
文檔編號A23L1/30GK102471795SQ20108003542
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者井上博晶, 木崎憲之, 難波弘憲 申請人:株式會社鐘化