專利名稱：治療新生血管形成的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及發(fā)生在例如黃斑變性及其治療時(shí)的眼部新生血管形成領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)是指在眼的脈絡(luò)膜層中新生血管異?；蜻^(guò)量形成，其是年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)的常見癥狀。AMD是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致不可逆性失明的主要原因，其中CNV表現(xiàn)為脈絡(luò)膜血管異常生長(zhǎng)穿透Bruch膜進(jìn)入視網(wǎng)膜間隙，導(dǎo)致炎癥(一般情況下逐漸減輕)、血管生成、最終引起黃斑纖維化。目前對(duì)AMD和其他類型脈絡(luò)膜新生血管形成的治療通常是給予抗血管生成藥物。 但是，此類治療幾乎無(wú)法緩解CNV引起的炎癥和纖維化。這樣一來(lái)，盡管此類藥物能夠逆轉(zhuǎn)新生血管形成；但是其臨床療效卻不盡如人意，因?yàn)槠錈o(wú)法改變CNV導(dǎo)致的纖維化損傷。因此，對(duì)眼部新生血管形成(如，AMD)單獨(dú)進(jìn)行抗纖維化治療或同時(shí)施加抗血管生成治療將對(duì)減緩因CNV所致的視力喪失產(chǎn)生更好的臨床療效。鍵本申請(qǐng)公開了脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)會(huì)伴隨某些賴氨酰氧化酶型酶表達(dá)水平的升高，之后導(dǎo)致纖維化損傷。抑制一種或多種賴氨酰氧化酶型酶的活性有助于減輕和/ 或逆轉(zhuǎn)CNV引起的纖維化損傷。此外，將抗血管生成治療與抗纖維化治療聯(lián)用被確定可用于治療以CNV為特征的紊亂，如年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)。抗纖維化治療包括抑制一種或多種賴氨酰氧化酶型酶的活性。抗血管生成治療包括抑制一種或多種血管生成因子的活性，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)。抑制一種或多種賴氨酰氧化酶型酶活性和/或抑制血管生成的組合物可以包括蛋白(如，抗體或短肽)、核酸(如，寡核苷酸三聚體、siRNA, shRNA、micr0RNA、核酶)或能夠通過(guò)合成制備的小分子有機(jī)物(如，分子量低于IkD)，例如組合化學(xué)。因此，本發(fā)明公開的內(nèi)容包括，但不僅限于以下實(shí)施例 1. 一種治療生物體眼部新生血管形成的方法，所述方法包括抑制生物體一種或多種細(xì)胞中賴氨酰氧化酶型酶的活性。2.根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，其中抑制包括將抗體與賴氨酰氧化酶型蛋白結(jié)合。3.根據(jù)實(shí)施例2所述的方法，其中賴氨酰氧化酶型蛋白為賴氨酰氧化酶(LOX)。4.根據(jù)實(shí)施例2所述的方法，其中賴氨酰氧化酶型蛋白為賴氨酰氧化酶相關(guān)蛋白 2(L0XL2)。5.根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，其中方法進(jìn)一步包括抑制生物體一種或多種細(xì)胞中血管生成因子的活性。
6.根據(jù)實(shí)施例5所述的方法，其中血管生成因子的活性通過(guò)將抗體與血管生成因子結(jié)合抑制。7.根據(jù)實(shí)施例5所述的方法，其中血管生成因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (VEGF)。8.根據(jù)實(shí)施例7所述的方法，其中VEGF為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)。9.根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，其中所述眼部新生血管形成所在疾病選自下組年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病(DR)和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病。10.根據(jù)實(shí)施例2所述的方法，其中抗體被引入生物體的眼部。11.根據(jù)實(shí)施例6所述的方法，其中多種抗體被引入生物體的眼部。12.根據(jù)實(shí)施例2所述的方法，其中編碼抗體的多核苷酸被引入生物體的眼部。13.根據(jù)實(shí)施例6所述的方法，其中編碼抗體的一種或多種多核苷酸被引入生物體的眼部。14.根據(jù)實(shí)施例10所述的方法，其中抗體被引入一個(gè)或多個(gè)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞。15.根據(jù)實(shí)施例11所述的方法，其中多種抗體被引入一個(gè)或多個(gè)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞。16.根據(jù)實(shí)施例12所述方法，其中多核苷酸被引入一個(gè)或多個(gè)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞。17.根據(jù)實(shí)施例13所述方法，其中一種或多種多核苷酸被引入一個(gè)或多個(gè)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞。18.根據(jù)實(shí)施例12所述方法，其中多核苷酸被包裹在病毒載體中，病毒載體選自下組腺相關(guān)病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。19.根據(jù)實(shí)施例13所述方法，其中一種或多種多核苷酸被包裹在病毒載體中，病毒載體選自下組腺相關(guān)病毒(AAV)、腺病毒和慢病毒。20.根據(jù)實(shí)施例18所述方法，其中病毒載體為腺相關(guān)病毒(AAV)。21.根據(jù)實(shí)施例19所述方法，其中所述病毒載體為腺相關(guān)病毒(AAV)。22.根據(jù)實(shí)施例20所述方法，其中所述病毒載體為AAV 2型或AAV 4型。23.根據(jù)實(shí)施例21所述方法，其中所述病毒載體為AAV 2型或AAV 4型。24.根據(jù)實(shí)施例1所述方法，其中所述生物體為哺乳動(dòng)物。25.根據(jù)實(shí)施例M所述方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。


圖1為激光照射組(左列和中列)和未經(jīng)照射的對(duì)照組(右列)小鼠脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的蘇木精-曙紅(H&E)染色切片。上面三幅照片為激光凝固術(shù)后第4天兩只損傷眼和一只對(duì)照眼的切片；下面的照片為激光凝固術(shù)后第7天兩只損傷眼和一只對(duì)照眼的切片。 圈選的部位為損傷部位。圖2為激光照射組(左列和中列)和未經(jīng)照射的對(duì)照組(右列)小鼠脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜青色素3免疫熒光切片，用于指示CD45的免疫活性。上面三幅照片為激光凝固術(shù)后第 4天兩只損傷眼和一只對(duì)照眼的切片；下面照片為激光凝固術(shù)后第7天兩只損傷眼和一只對(duì)照眼的切片。圈選的部位為損傷部位。圖3為激光凝固術(shù)后第14天和第28天對(duì)照組和激光損傷組小鼠切片中⑶45反應(yīng)區(qū)域水平的定量分析結(jié)果。用CD45陽(yáng)性區(qū)域占總損傷區(qū)域的百分率表示炎癥程度。圖4為激光照射組(左列和中列)和未經(jīng)照射的對(duì)照組(右列)小鼠脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜三色染色切片。上面三幅照片為激光凝固術(shù)后第4天兩只損傷眼和一只對(duì)照眼的切片；下面照片為激光凝固術(shù)后第7天兩只損傷眼和一只對(duì)照眼的切片。圈選的部位為損傷部位。圖5為激光照射組(左列和中列)和未經(jīng)照射的對(duì)照組(右列)小鼠脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜天狼星紅染色切片。上面三幅照片為激光凝固術(shù)后第4天兩只損傷眼和一只對(duì)照眼的切片；下面照片為激光凝固術(shù)后第7天兩只損傷眼和一只對(duì)照眼的切片。圈選的部位為損傷部位。圖6為激光凝固術(shù)后第4天和第7天對(duì)照組和激光損傷組動(dòng)物切片的膠原沉積定量分析結(jié)果。通過(guò)確定膠原纖維(使用三色染為藍(lán)色，使用天狼星紅染紅色)的面積占總損傷面積的百分率對(duì)膠原沉積情況進(jìn)行定量。在偏振光下對(duì)天狼星紅染色結(jié)果進(jìn)行分析。 三色和天狼星紅的P值分別為0. 00003和0. 00005。圖7為激光凝固術(shù)后第14天和第觀天對(duì)照組和激光損傷組小鼠切片的膠原沉積定量分析結(jié)果。膠原沉積的定量分析方法參見圖6說(shuō)明。圖8為激光凝固術(shù)后第4、7、14和28天激光損傷眼中編碼賴氨酰氧化酶(LOX)和賴氨酰氧化酶樣(LOXL)蛋白mRNA的水平。各組第4、7、14和28天的結(jié)果均用5個(gè)柱狀圖表示，從左到右依次為經(jīng)歸一化處理的LOX、LOXL 1、L0XL2、L0XL3和L0XL4的mRNA水平。各時(shí)間點(diǎn)柱狀圖從左到右依次為經(jīng)歸一化處理的mL0X、mL0XLl、mL0XL2、mL0XL3和mL0XL4的 mRNA水平。圖9為激光凝固術(shù)后第2、4、觀和35天激光損傷眼中編碼賴氨酰氧化酶(LOX)和賴氨酰氧化酶樣(LOXL)蛋白mRNA的水平。獲得結(jié)果實(shí)驗(yàn)不同于產(chǎn)生圖8所示結(jié)果的實(shí)驗(yàn)。 各組第2、4、觀和35天的結(jié)果均用5個(gè)柱狀圖表示，從左到右依次為經(jīng)歸一化處理的L0X、 LOXLU L0XL2、L0XL3和L0XL4的mRNA水平。各時(shí)間點(diǎn)柱狀圖從左到右依次為經(jīng)歸一化處理的 mLOX、mLOXLl、mL0XL2、mL0XL3 和 mL0XL4 的 mRNA 水平。圖10為激光凝固術(shù)后第35天激光損傷小鼠眼切片中CD45反應(yīng)區(qū)域水平的定量分析結(jié)果。采用抗L0XL2抗體(最左邊)；抗LOX抗體(中間)或載體(最右邊)處理小鼠組織。用CD45陽(yáng)性區(qū)域占總損傷區(qū)域的百分率表示炎癥程度。圖11為激光凝固術(shù)后第35天激光損傷小鼠眼切片中CD31反應(yīng)區(qū)域水平的定量分析結(jié)果。采用抗L0XL2抗體(最左邊)；抗LOX抗體(中間)或載體(最右邊)處理小鼠組織。用CD45陽(yáng)性區(qū)域占總損傷區(qū)域的百分率表示新生血管形成程度。圖12為激光凝固術(shù)后第35天激光損傷小鼠眼切片中膠原沉積情況的，采用天狼星紅染色定量分析結(jié)果。通過(guò)確定膠原纖維(染紅色)的面積占總損傷面積的百分率對(duì)膠原沉積情況進(jìn)行定量。在偏振光下對(duì)天狼星紅染色結(jié)果進(jìn)行分析。詳細(xì)說(shuō)明除另有說(shuō)明外，本發(fā)明中使用的方法均為細(xì)胞生物學(xué)、毒理學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、重組DNA領(lǐng)域及相關(guān)領(lǐng)域所公知的標(biāo)準(zhǔn)方法和常規(guī)技術(shù)手段。這些技術(shù)手段可見于文獻(xiàn)中，進(jìn)而使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以獲得。參見，例如， Alberts，B. et al.，“Molecular Biology of the Cell，” 第 5 片反，Garland Science，NewYorkiNY,2008 ；Voet,D.et al. "Fundamentals of Biochemistry :Life at the Molecular Level，，，第 3 片反，John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, 2008 ；Sambrook, J. et al.，“Molecular Cloning :A Laboratory Manual，”第 3 版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，2001 年；Ausubel，F(xiàn). et al. ,"Current Protocols in Molecular Biology，，，John Wiley&Sons,New York，1987，定期更新；Freshney，R. I.，“Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique，” 第 4 版，John Wiley & Sons，Somerset, NJ, 2000 ；以及 “Methods in Enzymology，” 叢書， Academic Press，San Diego, CA.賴氨酰氧化酶型酶在脈絡(luò)膜新生血管形成中的作用賴氨酰氧化酶(LOX)和賴氨酰氧化酶(LOXL)樣蛋白與膠原蛋白和胞外區(qū)域彈性蛋白的交聯(lián)有關(guān)。因?yàn)樵摶钚裕@些蛋白在纖維化過(guò)程中起重要作用。本申請(qǐng)顯示，在年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)模型中，激光誘導(dǎo)CNV后，某些賴氨酰氧化酶型酶的表達(dá)水平升高， 且在賴氨酰氧化酶的表達(dá)量增加的同時(shí)，也觀察到了纖維化損傷(參見下文的實(shí)施例4和 5)。此外，本申請(qǐng)顯示，在相同檢測(cè)系統(tǒng)中，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物賴氨酰氧化酶(LOX)和賴氨酰氧化酶樣蛋白2(L0XU)活性抑制劑(如，抗LOX和抗L0XL2抗體)后，其能夠阻止激光誘導(dǎo) CNV后的新生血管形成和纖維化。由此可知，抑制賴氨酰氧化酶型酶(如，L0X，L0XL2)的活性能夠用于逆轉(zhuǎn)、減輕和/或阻止CNV所致的眼部纖維化損傷。因此，在一方面，能夠調(diào)節(jié)本申請(qǐng)所述一種或多種賴氨酰氧化酶型酶活性的組合物可用于治療以新生血管形成為特征的狀況。一個(gè)非限制性的以新生血管形成為特征的疾病實(shí)例為年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)。其它疾病包括糖尿病視網(wǎng)膜病和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病。在某些實(shí)施例中，賴氨酰氧化酶型酶抑制劑可以是能夠抑制編碼賴氨酰氧化酶型蛋白基因表達(dá)的抗體、小RNA分子、核酶、核酸三聚體或轉(zhuǎn)錄因子。參見，例如US 2006/0127402、US2007/0225242和被共同持有的US 2009/0053224 ；為了公開多種類型的賴氨酰氧化酶抑制劑將其參考并入。還可參見，U. S.專利號(hào)6，534，沈1，為了公開制備抑制編碼賴氨酰氧化酶型酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的方法將其參考并入。在某些實(shí)施例中，賴氨酰氧化酶型酶抑制劑是某種能夠與賴氨酰氧化酶型酶結(jié)合并抑制其活性的抗體。在另外一些實(shí)施例中，抑制是非競(jìng)爭(zhēng)性的。能夠與一種或多種賴氨酰氧化酶型酶結(jié)合并抑制其活性的示例性抗體參見被共同持有的US 2009/0053224中公開的內(nèi)容；為了公開了能夠與賴氨酰氧化酶型酶結(jié)合的抗體的制備方法、組合物和用途將其內(nèi)容參考并入。在某些實(shí)施例中，將核酸編碼抗體或功能性抗體片段編碼的核苷酸作為賴氨酰氧化酶型酶的抑制劑。這些核酸能夠通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法給藥。例如，將無(wú)修飾核酸可選擇地加入緩沖液或藥學(xué)上可以接受載體溶液中后，再加入眼中，或制成用于滴眼或全系統(tǒng)給藥的溶液?？蛇x地，核酸可以用病毒載體進(jìn)行包裹(例如，腺病毒、腺相關(guān)病毒或慢病毒載體)。賴氨酰型酶本申請(qǐng)所述的術(shù)語(yǔ)“賴氨酰氧化酶型酶”指催化賴氨酸的ε -氨基和羥賴氨酸殘基發(fā)生氧化脫氨基化反應(yīng)，從而使肽基賴氨酸轉(zhuǎn)化成肽酰-α -氨基脂肪基-δ -半醛(醛賴氨酸)，并且釋放化學(xué)計(jì)量的氨和過(guò)氧化氫的蛋白家族成員
此反應(yīng)常在細(xì)胞外膠原蛋白和彈性蛋白的賴氨酸殘基上發(fā)生。醛賴氨酸的醛基具有反應(yīng)性，其能夠自發(fā)性的與其它醛賴氨酸和賴氨酸殘基發(fā)生縮合反應(yīng)，導(dǎo)致膠原蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而產(chǎn)生膠原纖維化。已從雞、大鼠、小鼠、牛和人中純化得到賴氨酰氧化酶型酶。所有賴氨酰氧化酶型酶均含有一個(gè)常見的催化結(jié)構(gòu)域，其長(zhǎng)度約為205個(gè)氨基酸，位于該蛋白的羧基末端，含有酶活性位點(diǎn)。酶活性位點(diǎn)中包括銅結(jié)合位點(diǎn)，其中包括能夠與Cu(II)原子配位的4個(gè)組氨酸殘基的保守氨基酸序列?；钚晕稽c(diǎn)還包括酪氨酰醌(LTQ)輔因子，其由賴氨酸和酪氨酸殘基通過(guò)分子內(nèi)共價(jià)連接形成(對(duì)應(yīng)大鼠賴氨酰氧化酶中l(wèi)ys314和tyr349，對(duì)應(yīng)人賴氨酰氧化酶中l(wèi)ys320和tyr355)。在賴氨酰氧化酶型酶中形成LTQ輔因子的酪氨酸殘基周圍的序列也是保守的。催化結(jié)構(gòu)域中也含有十個(gè)保守的半胱氨酸殘基，其參與形成五個(gè)二硫鍵。 催化結(jié)構(gòu)域中還包括纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。最后，在催化結(jié)構(gòu)域中還存在與生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子受體結(jié)構(gòu)域類似的氨基酸序列，該氨基酸序列包含四個(gè)半胱氨酸殘基。在該酶家族中首個(gè)被分離和鑒定出的成員為賴氨酰氧化酶(EC 1. 4. 3. 13)；又名蛋白-賴氨酸6-氧化酶、蛋白-L-賴氨酸氧6-氧化還原酶(脫氨基)或L0X。參見，例如，Harris et al. ,Biochim. Biophys. Acta 341:332—344(1974) ；Rayton et al. ,J. Biol. Chem. 254 :621-626(1979) ；Stassen，Biophys. Acta 438:49—60(1976)。隨后又相繼發(fā)現(xiàn)了其它的賴氨酰氧化酶型酶。這些蛋白被稱為“L0X樣”或 “L0XL”。其全部含有上文所述的常見催化結(jié)構(gòu)域，且具有類似的酶活性。目前已知，在人和小鼠中均存在五中不同的賴氨酰氧化酶型酶L0X和四種LOX相關(guān)，或LOX樣蛋白LOXl (又稱為“賴氨酰氧化酶樣”、“ LOXL，，或 “ LOL，，)、L0XL2 (又稱為“ LOR-1 ”)、L0XL3 和 L0XL4。 編碼各賴氨酰氧化酶型酶的五個(gè)基因分別位于不同的染色體上。參見，例如，Molnar et al. ， Biochim Biophys Acta. 1647 :220-24(2003) ；Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70 1-32(2001) ；W001/83702，
公開日2001年11月8日和U. S.專利，專利號(hào)6，300，092，所有內(nèi)容均參考并入。有一種名為L(zhǎng)OXC的LOX樣蛋白，其與L0XL4存在某些相似之處，但表達(dá)類型不同，此蛋白分離自鼠源性 EC 細(xì)胞系。Ito et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 =24023-24029 兩種賴氨酰氧化酶型酶DmLOXL-I和DmL0XL_2分離自果蠅。盡管所有的賴氨酰氧化酶型酶均具有相同的催化結(jié)構(gòu)域，但是這些酶之間仍存在差異，其差異主要表現(xiàn)在氨基末端區(qū)域。與LOX相比，四個(gè)LOXL蛋白存在氨基末端延伸。這樣，人前原LOX (即，信號(hào)序列裂解前的主要翻譯產(chǎn)物，見如下)中含有417個(gè)氨基酸殘基； L0XL1中含有574個(gè)氨基酸殘基、L0XL2中含有638個(gè)氨基酸殘基、L0XL3中含有753個(gè)氨基酸殘基和L0XL4中含有756個(gè)氨基酸殘基。在其氨基末端，L0XL2、L0XL3和L0XL4中含有四個(gè)重復(fù)的清道夫受體-富含半胱氨酸(SRCR)結(jié)構(gòu)域。在LOX或LOXLl中不存在這些結(jié)構(gòu)域。SRCR結(jié)構(gòu)域存在于分泌性、跨膜或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中，已知其能夠在許多分泌性和受體蛋白中介導(dǎo)配體結(jié)合。Hoheneste et al. (1999) Nat.Struct. Biol. 6 :228-232 ；Sasaki et al (1998)EMBO J. 17 :1606_1613。 除SRCR結(jié)構(gòu)域以外，L0XL3在其氨基末端區(qū)域含有核定位信號(hào)。僅在LOXLl中存在一個(gè)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域。Molnar et al. (2003) Biochim. Biophys. Acta 1647:220-224。各種賴氨酰氧化酶的糖基化類型也不同。賴氨酰氧化酶型酶在組織中的分布情況也不同。人LOXmRNA在心臟、胎盤、睪丸、 肺、腎和子宮中的表達(dá)量較高，但是在腦和肝臟中的表達(dá)量較低。人LOXLl mRNA在胎盤、 腎臟、肌肉、心臟、肺和胰臟中均有表達(dá)，與LOX類似，其在腦和肝臟中的表達(dá)量要低很多。 Kim et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 :7176_7182。L0XL2 mRNA 在子宮、胎盤和其它器官中的表達(dá)量較高，但與LOX和LOXL類似，其在腦和肝臟中的表達(dá)量較低。Jourdan Le-Saux et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 :12939 12944。L0XL3 mRNA 在睪丸、脾臟和前列腺中的表達(dá)量較高，其在胎盤中呈中度表達(dá)，在肝臟中不表達(dá)，而L0XL4在肝臟中表達(dá)量較高。Huang et al. (2001)Matrix Biol. 20 :153-157 ；Maki and Kivirikko(2001)Biochem. J. 355 381-387 Jourdan Le-Saux et al. (2001)Genomics 74 :211-218 ；Asuncion et al. (2001) Matrix Biol. 20 :487-491。不同賴氨酰氧化酶型酶在疾病中的表達(dá)情況和/或與疾病之間的關(guān)系也是多種多樣。參見，例如，Kagen(1994)Pathol. Res. Pract. 190 :910-919 ；Murawaki et al. (1991)Hepatologyl4 :1167-1173 ；Siegel et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2945-2949 Jourdan Le-Saux et al. (1994)Biochem. Biophys. Res. Comm. 199 :587-592 ； and Kim et al. (1999) J. Cell Biochem. 72 :181_188。賴氨酰氧化酶型酶還與多種癌癥有關(guān)，包括頭部和頸部癌癥、膀胱癌、結(jié)腸癌、食道癌和乳腺癌。參見，例如，mi et al. (2007) Cancer Res. 67 :4123-4129 ；Gorough et al. (2007)J. Pathol. 212 :74-82 ；Csiszar(2001) Prog. Nuc1. Acid Res. 70 :1—32 禾口 Kirschmann et al. (2002)Cancer Res. 62 :4478_4483。盡管賴氨酰氧化酶型酶在結(jié)構(gòu)和功能上存在某些重疊，但是其各自還具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能。例如，定向刪除LOX是小鼠在出生即已死亡的原因，而L0XL1缺陷不會(huì)嚴(yán)重影響發(fā)育表型。Hornstra et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 :14387-14393 ；Bronson et al. (2005)Neurosci. Lett. 390 :118_122。盡管絕大部分文獻(xiàn)中均認(rèn)為賴氨酰氧化酶型酶的作用為在細(xì)胞外的膠原蛋白和彈性蛋白中催化特定的賴氨酸殘基發(fā)生氧化反應(yīng)，但是也有證據(jù)顯示賴氨酰氧化酶型酶還參與了多個(gè)胞內(nèi)過(guò)程。例如，有文獻(xiàn)報(bào)道某些賴氨酰氧化酶型酶能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)。Li et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :12817-12822 ；Giampuzzi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 :36341_36349。此外，有報(bào)道表明LOX能夠氧化組蛋白Hl中的賴氨酸殘基。LOX 的其它胞外活性包括誘導(dǎo)單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的趨化作用。Lazarus et al. (1995)Matrix Biol. 14:727-731 ；Nelson et al. (1988) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 188 346-352。多種生長(zhǎng)因子和激素，如TGF-β、TNF-α和干擾素，均能夠誘導(dǎo)LOX自身的表達(dá)。 Csiszar(2001)Prog. Nucl. Acid Res. 70 :1_32。最新的研究結(jié)果顯示，LOX與其它多種生物學(xué)功能有關(guān)，如發(fā)育調(diào)節(jié)、腫瘤抑制、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞衰老。多種來(lái)源的賴氨酰氧化酶蛋白實(shí)例包括具有與下述序列之一多肽表達(dá)或翻譯后形式基本相同的氨基酸序列的酶EMBL/GenBank :M94054 ；AAA59525. 1—mRNA ；S45875 ； AAB23549. Ι-mRNA ；S78694 ；AAB21243. Ι-mRNA ；AF039291 ；AAD02130. Ι-mRNA ；BC074820 ； AAH74820. 1-mRNA ；BC074872 ；AAH74872. 1-mRNA ；M84150 ；AAA59541. 1_ 基因組 DNA。LOX 的一個(gè)實(shí)施例為人賴氨酰氧化酶(hLOX)前原蛋白。本申請(qǐng)公開的編碼賴氨酰氧化酶型酶序列的實(shí)例如下L0XL1的編碼mRNA為 GenBank/EMBL BC015090 ；AAH15090. 1 ；L0XL2 的編碼 mRNA 為 GenBank/EMBL U89942 ；L0XL3 的編碼 mRNA 為 GenBank/EMBL AF282619 ；AAK51671. 1 ；以及 L0XL4 的編碼 mRNA 為 GenBank/ EMBL AF338441 ；AAK71934. 1。LOX蛋白的初級(jí)翻譯產(chǎn)物為前原多肽，其中含有延伸自氨基酸1-21的信號(hào)序列。 在小鼠和人LOX中，該信號(hào)序列通過(guò)Cys21和Ala22之間的裂解在胞內(nèi)釋放，生成46_48kDa 的LOX前肽，在本申請(qǐng)中也稱為全長(zhǎng)形式。該前肽在通過(guò)高爾基體時(shí)發(fā)生N-糖基化反應(yīng)， 生成50kDa的蛋白，隨后其分泌至胞外環(huán)境中。在這個(gè)階段，蛋白被催化滅活。隨后這個(gè)蛋白進(jìn)一步裂解，小鼠LOX在Glyl68和Aspl69之間裂解，人LOX在Glyl74和Aspl75之間裂解，進(jìn)而產(chǎn)生成熟的、具有催化活性的30-32kDa的酶，同時(shí)釋放一個(gè)ISkDa的前肽。最終的裂解事件由金屬內(nèi)切蛋白酶前膠原C-蛋白水解酶催化完成，該酶也稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白-l(BMP-l)。有趣的是，這種酶還具有加工LOX的底物膠原的功能。隨后，N-糖基單元被除去。預(yù)計(jì)潛在信號(hào)多肽裂解位點(diǎn)在L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4的氨基末端。L0XL1、 L0XL2、L0XL3和L0XL4的潛在信號(hào)裂解位點(diǎn)預(yù)計(jì)分別在Gly25和Gln26、Ala25和Gln26、 Gly25 和 Serf6 和 Arg23 和 ProM 之間。已鑒定出LOXL(LOXLl)蛋白的BMP-1裂解位點(diǎn)在和Asp355之間。Borel et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 :48944-48949。依據(jù)前膠原和前-LOX(pro-LOX)中共有的 BMP-I裂解序列，其它賴氨酰氧化酶型酶的潛在BMP-I裂解位點(diǎn)預(yù)測(cè)為Ala/Gly-Asp序列， 經(jīng)常位于酸性或荷電的殘基之后。預(yù)計(jì)L0XL3的BMP-I裂解位點(diǎn)在Gly447和Asp448之間，在該位點(diǎn)進(jìn)行加工后可以得到與成熟LOX大小相當(dāng)?shù)某墒於嚯?。L0XL4的BMP-I潛在裂解位點(diǎn)也已被鑒定出，其在 Ala569 和 Asp570 之間。Kim et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 52071-52074。L0XL2也能夠按照與LOXL家族其它成員類似的方法被蛋白水解酶裂解和分泌。Akiri et al. (2003)Cancer Res. 63 1657—1666。為了本申請(qǐng)公開目的，術(shù)語(yǔ)“賴氨酰氧化酶型酶”包括上文所述全部五種賴氨酰氧化酶，還包括實(shí)際上具有酶活性的L0X、L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4的功能性片段和/或衍生物，例如，催化賴氨酸殘基脫氨基的能力。典型地，功能性片段或衍生物至少保持其賴氨酸氧化活性的50%。在某些實(shí)施例中，功能性片段或衍生物至少保持其賴氨酸氧化活性的 60%、70%、80%、90%、95%、99% 或 100%。本發(fā)明所述的賴氨酰氧化酶型酶功能性片段還包括催化活性未出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性改變的保守氨基酸取代物(相對(duì)于天然多肽序列而言)。術(shù)語(yǔ)“保守氨基酸取代物”指基于某種一般結(jié)構(gòu)和/或性質(zhì)的氨基酸組(grouping)。按照一般結(jié)構(gòu)，可以將氨基酸分為帶有非極性側(cè)鏈的(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)、帶有不帶電荷極性側(cè)鏈的(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸) 以及帶有帶電荷極性側(cè)鏈的(賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸)。含有芳香側(cè)鏈氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。雜環(huán)側(cè)鏈存在于脯氨酸、色氨酸和組氨酸中。在帶有非極性側(cè)鏈的氨基酸中，還可分為帶有短烴側(cè)鏈的(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)和不帶有烴基側(cè)鏈的(甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。在帶有帶電荷極性側(cè)鏈的氨基酸中，還可以分為帶有酸性側(cè)鏈的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和帶有堿性側(cè)鏈的氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)。確定各氨基酸一般性質(zhì)的功能性方法為，分析同源生物相應(yīng)蛋白間的氨基酸變化的歸一化的步頁(yè)率(Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1979)。根據(jù)這種分析，氨基酸組可以定義為在同源蛋白中被優(yōu)選地由一個(gè)取代為另一個(gè)的一組氨基酸，且其對(duì)整個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)具有類似影響(Schulz紹chirmer， supra)。根據(jù)此類分析，可以列出以下幾個(gè)可以彼此間保守互換的氨基酸組⑴包含帶電荷基團(tuán)的氨基酸，由Glu、Asp、Lys、Arg和His組成，(ii)包含帶正電基團(tuán)的氨基酸，由Lys、Arg和His組成，(iii)包含帶負(fù)電基團(tuán)的氨基酸，由Glu和Asp組成，(iv)包含芳香基團(tuán)的氨基酸，由Wie、Tyr和Trp組成，(ν)包含氮環(huán)基團(tuán)的氨基酸，由His和Trp組成，(vi)包含較大脂肪族非極性基團(tuán)的氨基酸，由Val、Leu和Ile組成，(vii)包含略帶極性基團(tuán)的氨基酸，由Met和Cys組成，(viii)包含較小殘基的氨基酸，由 Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln*Pro，(ix)包含脂肪族基團(tuán)的氨基酸，由Val、Leu、lie. Met和Cys組成，以及(χ)包含羥基的氨基酸，由Ser和Thr組成。因此，如上述示例所示，氨基酸的保守取代對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的，通?？勺鞒鲞@種取代而不改變所得分子的生物活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道，一般情況下在多肽的非必需區(qū)域進(jìn)行單氨基酸取代基本不會(huì)改變生物活性。參見，例如，WatSOn，et al.， "Molecular Biology of the Gene, ”第4版，1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co. ,Menlo Park, CA，第 2 頁(yè)。有關(guān)賴氨酰氧化酶型酶的其它信息，參見，例如Rucker et al. , Am. J. Clin. Nutr. 67 :996S-1002S(1998)和 Kagan et al.，J. Cell. Biochem 88 :660-672(2003) 還可參見被共同持有的US 2009/00532^(2009年2月洸日)和US 2009/0104201 (2009年4 月23日)；其公開的內(nèi)容在此參考并入。賴氨酰氧化酶型酶調(diào)節(jié)劑賴氨酰氧化酶型酶調(diào)節(jié)劑包括活化劑(激動(dòng)劑)和抑制劑(拮抗劑)，可以通過(guò)多種篩選方法對(duì)其進(jìn)行選擇。在一個(gè)實(shí)施例中，調(diào)節(jié)劑可以通過(guò)確定待測(cè)化合物是否與賴氨酰氧化酶型酶結(jié)合對(duì)其進(jìn)行鑒別；其中，如果發(fā)生了結(jié)合，則將該化合物認(rèn)定為候選調(diào)節(jié)劑?？蛇x地，可以對(duì)該候選調(diào)節(jié)劑進(jìn)行其它檢測(cè)。可選地，將候選化合物與賴氨酰氧化酶型酶接觸，再檢測(cè)賴氨酰氧化酶型酶的生物活性，能夠改變賴氨酰氧化酶型酶生物活性的化合物就是賴氨酰氧化酶型酶調(diào)節(jié)劑。一般情況下，能夠降低賴氨酰氧化酶型酶生物活性的化合物是該酶的抑制劑。在某些實(shí)施例中，生物活性為脫氨基；在另外一些實(shí)施例中，其為生成過(guò)氧化物。用于鑒別賴氨酰氧化酶型酶的其它方法包括將候選化合物在含有一種或多種賴氨酰氧化酶型酶的細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)，再對(duì)細(xì)胞的一種或多種生物活性或特性進(jìn)行檢測(cè)。 能夠改變培養(yǎng)細(xì)胞生物活性或特性的化合物即為賴氨酰氧化酶型酶的潛在調(diào)節(jié)劑。能夠被檢測(cè)的生物學(xué)活性包括，例如，賴氨酰氧化酶活性(例如，脫氨基，生成過(guò)氧化物)、賴氨酰氧化酶型酶水平、編碼一種或多種賴氨酰氧化酶型酶的mRNA水平和/或賴氨酰氧化酶型酶的一種或多種特異性功能。在上述檢測(cè)的另外實(shí)施例中，當(dāng)未與候選化合物接觸時(shí)，一種或多種生物活性或細(xì)胞特性與賴氨酰氧化酶型酶的水平或活性相關(guān)。例如，生物活性可以是細(xì)胞功能，如遷移、趨化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化或間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化，通過(guò)與一個(gè)或多個(gè)對(duì)照或參比樣品進(jìn)行比較確定變化情況。例如，陰性對(duì)照樣品包括候選化合物加入后賴氨酰氧化酶型酶的水平或活性降低的培養(yǎng)物；或培養(yǎng)物中賴氨酰氧化酶型酶的量與待測(cè)培養(yǎng)物相同，但是未加入候選化合物。在某些實(shí)施例中，賴氨酰氧化酶型酶水平不同的分離的培養(yǎng)物分別與候選化合物接觸。如果觀察到培養(yǎng)物的生物活性變化，且該變化高于含有更高水平或活性賴氨酰氧化酶型酶的培養(yǎng)物時(shí)，則可鑒定該化合物屬于賴氨酰氧化酶型酶調(diào)節(jié)劑?？梢酝ㄟ^(guò)化合物誘導(dǎo)后的表型確定化合物是賴氨酰氧化酶型酶的活化劑還是抑制劑，或者還可以進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，如檢測(cè)化合物對(duì)賴氨酰氧化酶活性的影響。獲得賴氨酰氧化酶型酶的方法(生物化學(xué)法或重組法)，以及上文所述的通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)和酶學(xué)檢測(cè)鑒別賴氨酰氧化酶型酶調(diào)節(jié)劑的方法均為本領(lǐng)域的公知常識(shí)。能夠通過(guò)多種不同的方法測(cè)定賴氨酰氧化酶型酶的酶活性。例如，可以通過(guò)以下方法測(cè)定酶活性對(duì)過(guò)氧化氫、銨離子和/或醛產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和/或定量，對(duì)賴氨酸氧化反應(yīng)和/或膠原交聯(lián)情況進(jìn)行檢測(cè)，或測(cè)定細(xì)胞侵襲能力、細(xì)胞粘附、細(xì)胞生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)情況。參見，例如，Trackman et al. (1981) Anal. Biochem. 113 :336-342 ；Kagan et al. (1982) Meth. Enzymo 1. 82A :637-649 ；Palamakumbura et al. (2002) Anal. Biochem. 300 :245-251 ； Albini et al. (1987)Cancer Res. 47 :3239-3245 ；Kamath et al. (2001)Cancer Res. 61 5933-5940 ；U. S.專利，專利號(hào) 4，997，854 和 U. S.專利申請(qǐng)，
發(fā)明者D·馬歇爾, I·斯托曼斯, T·范·博根, V·史密斯 申請(qǐng)人:吉聯(lián)亞生物科技有限公司