專利名稱：利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定茶樹菇Ag·c0003的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種茶樹菇的鑒定方法，具體來說是一種利 用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定茶樹菇Ag. C0003的方法。
背景技術(shù)：
茶樹菇(Agrocybe cylindracea)又稱茶新菇、楊樹菇。菇薄柄脆，美味在柄，香淳 脆嫩。茶樹菇的營養(yǎng)豐富，所含蛋白質(zhì)中有18種氨基酸(8種為人體必須氨基酸)，含有豐 富的B族維生素，茶樹菇中鎂含量高，鎂是能量代謝、組織形成和骨骼發(fā)育的重要物質(zhì)；同 時(shí)富含鋅、鐵等礦物質(zhì)。茶樹菇中含有的茶樹菇多糖，是深受廣大市民歡迎的菇菌食品。我國食用菌資源豐富，品種比較多，但是食用菌的管理比較混亂。部分生產(chǎn)者有意 或無意的改名，使茶樹菇不同栽培菌種“異種同名、同種異名，，現(xiàn)象普遍存在。這種情況已 極大地?fù)p害了育種者和生產(chǎn)者的利益，不但給科學(xué)研究和學(xué)術(shù)交流帶來障礙，而且對規(guī)范 生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定帶來很大困難。優(yōu)質(zhì)菌種在茶樹菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，這決定了茶樹菇菌種在茶樹 菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。我國于1999年簽署了《國際植物新品種保護(hù)法》，2000年、頒布了《中 華人民共和國種子法》，并于2004年進(jìn)行了修訂，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第62號令頒布了 《食用菌菌種管理辦法》，這些法律、法規(guī)的實(shí)施，增強(qiáng)了我們對品種知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)意識， 有力地推動了我國食用菌良種選育和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)工作。然而這些法律的有效實(shí)施，需要 強(qiáng)有利的技術(shù)作支撐，就要求我們對現(xiàn)有的種質(zhì)資源進(jìn)行清查，進(jìn)一步加快菌種鑒定技術(shù) 的研究。同時(shí)隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對茶樹菇栽培菌株質(zhì)量的要求越來越 高，需要發(fā)展更為簡便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確無誤。本專 利可為茶樹菇種質(zhì)資源的利用和新品種的登記工作引進(jìn)更為有效的菌種鑒定體系，以及加 強(qiáng)對我國茶樹菇種質(zhì)資源的保護(hù)工作都具有重要意義。現(xiàn)有技術(shù)中茶樹菇的鑒定方法通常是采用形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)和出菇試驗(yàn) 方法。常規(guī)的拮抗試驗(yàn)中，拮抗表現(xiàn)形式至少有3種，甚至更多，有時(shí)表現(xiàn)形式不明顯，還受 培養(yǎng)環(huán)境的影響，拮抗表現(xiàn)不僅在種內(nèi)的不同品種之間會出現(xiàn)，同時(shí)在種間的菌株之間也 會表現(xiàn)出來，給準(zhǔn)確判斷造成困難；出菇試驗(yàn)更容易受到環(huán)境、時(shí)間等各方因素的影響，重 復(fù)性差，加大了檢測困難；形態(tài)學(xué)檢測在同一屬種內(nèi)的不同品種之間可區(qū)別的特征少，有些 甚至沒有什么差異，同時(shí)還需要判斷者具有豐富的知識與經(jīng)驗(yàn)，方可做出準(zhǔn)確的判斷。因此 上述的鑒定方法需要很大的人力和物力，當(dāng)品種多時(shí)可能使得認(rèn)定工作無法進(jìn)行。常規(guī)的 拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測和出菇試驗(yàn)則需要至少2個(gè)月的時(shí) 間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定茶樹菇Ag. C0003的方法，所述的這種 利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定茶樹菇Ag. C0003的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中鑒定茶樹菇的方法復(fù)雜、需要大量的人力和物力、鑒定時(shí)間長的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定茶樹菇Ag. C0003的方法，包括一個(gè)培 養(yǎng)與收集待檢測茶樹菇菌種的菌絲的步驟，一個(gè)提取待檢測茶樹菇菌種DNA的步驟，一個(gè) 對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增的步驟，一個(gè)對SCAR-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn) 行凝膠電泳的步驟，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)凝結(jié)電泳判定結(jié)果，在所述的一個(gè)對待檢測的茶樹菇 菌種的DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增的步驟中，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所 示(SEQ ID NO :1)，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示(SEQ ID NO :2)。進(jìn)一步的，在所述的一個(gè)對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增的步驟 中，SCAR-PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C Imin ；94°C 45second, 64°C 45second, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72 °C 5min。本發(fā)明還提供了一種鑒定茶樹菇Ag. C0003的引物，述的上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID NO 1所示(SEQ ID NO 1 )，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示 (SEQ ID NO :2)。本發(fā)明的檢測方法以基因組DNA為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，不易受外界因素 等的影響，同時(shí)它的639bp的顯性標(biāo)記使的判斷一目了然，減少人為判斷的偏差，大大提高 了準(zhǔn)確性。本發(fā)明的方法得到的顯性標(biāo)記可減少茶樹菇新品種認(rèn)定的工作量，檢測時(shí)該方 法只需要1個(gè)陽性菌株和1個(gè)陰性菌株對照便可快速比較。本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)效果是顯著的。本發(fā)明的檢測方法的靈敏度 高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，本發(fā)明的檢測方法 所需時(shí)間只需要2 — 3天，時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是采用JG C0003專用檢測引物1 (SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2)對茶樹菇 菌株進(jìn)行SCAR - PCR擴(kuò)增圖譜。其中M M為泳道編號；右側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量，第3號泳道的639bp 的特異DNA條帶，為茶樹菇菌種JG C0003的標(biāo)志。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)試劑
1、CTAB抽提液(pH 8.0) 100 mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB，20 mmol/L EDTA, 1. 4 mol/L NaCl；
2、CTAB沉淀液(ρΗ8·0) 50 mmol/L Tris-HCl, 1. 0% CTAB，10 mmol/L EDTA;
3、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；
4、TE緩沖液10mmol/L Tris HCl，1 mmol/L EDTA ；
5、0·5XTBE :44· 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3U mmol/L EDTA;
6、6X溴酚藍(lán)上樣緩沖液0.15%溴酚藍(lán)，40%蔗糖；
7、EB 10 mg/ml 溴化乙錠。實(shí)施例1 茶樹菇菌絲培養(yǎng)與收集
用接種耙耙碎含菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接入250 ml三角瓶(含100 ml PDA液體)培養(yǎng)
4基中；
放置在25°C搖床上，轉(zhuǎn)速9(Tl30 r/min培養(yǎng)疒10 d ； 用紗布過濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干； 稱取0. 8^1. 3g菌絲，用濾紙包好，保存于_20°C備用。實(shí)施例2 茶樹菇基因組DNA的提取(對菌絲體和子實(shí)體均適用)
1、取保存?zhèn)溆玫木zι包或0.8^1. 3g的子實(shí)體，放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末， 轉(zhuǎn)入7ml的離心管；
2、加2.5mL 65°C預(yù)熱的抽提液，同時(shí)加入50 μ 1巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質(zhì)變性
沉淀；
3、65°C水浴lh，每隔IOmin振蕩1次；
4、加入2.5 ml的(氯仿異戊醇=24:1)混勻，除去蛋白質(zhì)； 5,8000 r/min, 4°C離心 IOmin,取上清到 7ml 管；
6、加1/5體積65°C預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5 ml的(氯仿異戊醇=24:1)混勻；
7、10000r/min,4°C離心 lOmin，取上清；
8、加入2.5 ml 65°C預(yù)熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65°C水浴Ih至沉淀可見(可過夜);
9、12000r/min，4°C離心IOmin后，小心去除上清液；
10、用0.5ml TE溶液(或無菌水)溶解沉淀IOmin ；
11、加入0.25ml飽和酚和0. 25m L (氯仿異戊醇=24:1),混勻；
12,12000 r/min，4°C離心lOmin，取上清，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻；
13、放置-20°C冰箱Ih(可過夜)；
14、12000r/min，4°C離心 10 min，棄上清；
15、(可選做)加0.5 1 mL 70%乙醇洗滌，12000 r/min，4°C離心8min，棄上清；重
復(fù)一次
16、自然風(fēng)干沉淀，用30μ1TE溶液(或無菌去離子水)溶解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3 SCAR-PCR擴(kuò)增
SCAR-PCR 擴(kuò)增體系SCAR-PCR 擴(kuò)增體系為 IOXPCR buffer 2. 5 μ 1，25mmol/L MgCL2 1 μ 1, 2. 5 m mol/L dNTP 2 μ 1,5 U/ul Taq DNA Polymerase 0. 3 μ 1,10 μ mol/ L檢測引物各1 μ 1，Ing IOng/ μ 1模板DNA (茶樹菇AG. C0003提取的DNA)和實(shí)施例2 提取的待檢測菌種DNA 1 μ 1，ddH20 16.2 μ 1 ；
SCAR-PCR 反應(yīng)條件為 94°C Imin ；94°C 45second, 64°C 45second, 72°C lmin，30 個(gè)循 環(huán)；72°C 5min。實(shí)施例4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
法一取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μ 1力卩上1. 5 μ 1 6 X溴酚藍(lán)上樣緩沖液，混勻，在1. 0%瓊 脂糖凝膠(含GoldviewTMDNA染料)進(jìn)行電泳，5V/cm恒壓電泳50 min，通過紫外凝膠成像系 統(tǒng)觀察并照像。法二 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8 μ L，與1. 5 μ L 6 X溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1%的 瓊醋糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，5V/cm恒壓電泳0. 5 lh，電泳結(jié)束后，用EB染色， 然后在凝膠成像儀上照相。結(jié)果只有茶樹菇AG. C0003菌株能擴(kuò)增出分子量為639bp特有的DNA條帶(如
5圖1中箭頭標(biāo)注所示)。如果擴(kuò)增出的DNA條帶的大小為639bp，則表示該菌株為茶樹菇 AG. C0003,反之則為其它菌株。
權(quán)利要求
一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定茶樹菇Ag.c0003的方法，其特征在于包括一個(gè)培養(yǎng)與收集待檢測茶樹菇菌種的菌絲的步驟，一個(gè)提取待檢測茶樹菇菌種DNA的步驟，一個(gè)對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進(jìn)行SCAR PCR擴(kuò)增的步驟，一個(gè)對SCAR PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳的步驟，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)凝結(jié)電泳判定結(jié)果，在所述的一個(gè)對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進(jìn)行SCAR PCR擴(kuò)增的步驟中，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定茶樹菇Ag.C0003的方法，其特征在 于在所述的一個(gè)對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增的步驟中，SCAR-PCR擴(kuò) 增的反應(yīng)條件為94°C Imin ；94°C 45second, 64°C 45second, 72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
3.一種鑒定茶樹菇Ag.c0003的引物，其特征在于所述的上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定茶樹菇Ag·c0003的方法，包括一個(gè)培養(yǎng)與收集待檢測茶樹菇菌種的菌絲的步驟，一個(gè)提取待檢測茶樹菇菌種DNA的步驟，一個(gè)對待檢測的茶樹菇菌種的DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增的步驟，一個(gè)對SCAR-PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳的步驟，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)凝結(jié)電泳判定結(jié)果，本發(fā)明的檢測方法的靈敏度高，所需要的DNA用量少，與常規(guī)檢測方法相比，本發(fā)明的檢測方法所需時(shí)間只需要2－3天，時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、容易判斷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK101962687SQ20101054398
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者楊開耀, 鄧優(yōu)錦 申請人:上海百茸食用菌有限公司