專(zhuān)利名稱(chēng)：人源細(xì)胞的人線(xiàn)粒體dna特異片段擴(kuò)增檢測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別是涉及人線(xiàn)粒體DNA特異片段擴(kuò)增技術(shù)在人源細(xì) 胞檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，病毒性肝炎、艾滋病等疾病嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康與生命安全，對(duì)這些疾病 的致病機(jī)制研究迫切需要合適的動(dòng)物模型，但許多感染人類(lèi)的病毒無(wú)法感染小鼠或其他實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物，并且由于人類(lèi)和動(dòng)物免疫系統(tǒng)的差異，許多對(duì)動(dòng)物有效的藥物在臨床研究中缺沒(méi) 有顯著功效。因此，人源化動(dòng)物是感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的 臨床前動(dòng)物模型，對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。但人源化嵌合體動(dòng)物研究的發(fā)展需要一 種簡(jiǎn)便易行、且靈敏度較高的人源化細(xì)胞基因檢測(cè)技術(shù)。由于人類(lèi)Alu基因序列的高度物種特異性和可重復(fù)性，Alu基因特異性引物被許 多研究者用于混合物種樣本中人DNA的鑒定，也是目前人源化細(xì)胞檢測(cè)中最靈敏的方法。 如McKenzie等首次用32P標(biāo)記Alu探針檢測(cè)人鼠混合樣本中的人DNA的存在。Zubair等采 用Alu引物分析注射人淋巴癌細(xì)胞的小鼠組織中的人源化細(xì)胞數(shù)，但只有當(dāng)每μ g小鼠DNA 中的人DNA量達(dá)到I-IOng水平時(shí)才能檢測(cè)。Kim等的方法能夠檢測(cè)出2X IO6雞細(xì)胞中的 一個(gè)人類(lèi)細(xì)胞，但反應(yīng)體系中采用了 32P標(biāo)記dCTP，且在電泳后還需要對(duì)PCR條帶進(jìn)行密度 掃描。Schneider等以Alu基因?yàn)槟０暹M(jìn)行定量PCR，能夠檢測(cè)中1 X IO6個(gè)小鼠細(xì)胞中的一 個(gè)人類(lèi)細(xì)胞，該方法在檢測(cè)技術(shù)上有了顯著改進(jìn)，但由于費(fèi)用較昂貴，且需要LightCycler 實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)，尚不能滿(mǎn)足常規(guī)嵌合體基因型檢測(cè)的需要。動(dòng)物線(xiàn)粒體DNA(Mitochondria DNA,mtDNA)是一種共價(jià)閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子， 線(xiàn)粒體DNA為多拷貝基因，每個(gè)細(xì)胞器含有數(shù)個(gè)到上千個(gè)不等的線(xiàn)粒體，而每個(gè)線(xiàn)粒體可 含有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)不等的線(xiàn)粒體DNA分子，人類(lèi)細(xì)胞中的線(xiàn)粒體DNA基因組可以高達(dá)一萬(wàn) 個(gè)。因此，本發(fā)明利用mtDNA的高拷貝特性和種屬特異序列(相對(duì)于嚙齒類(lèi))檢測(cè)人類(lèi) mtDNA特異性保守序列PCR擴(kuò)增作為人源化動(dòng)物模型中人類(lèi)DNA檢測(cè)方法，具有比已有方法 靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
1、要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的主要目的在于提供一種高靈敏度和特異性的人源細(xì)胞檢測(cè)方法。2、技術(shù)方案(1)人類(lèi)特異性mtDNA序列和PCR引物利用DNAMAN序列分析軟件，對(duì)人類(lèi)mtDNA (GI 17981852)和小鼠mtDNA (GI 118200767)的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)下列對(duì)應(yīng)片段的序列同源性?xún)H為35%，且通過(guò)NCBI blast分析表明該人類(lèi)mtDNA片段在小鼠基因組中無(wú)同源序列。人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA (GI =17981852)的特異性序列
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小鼠線(xiàn)粒體DNA (GI 118200767)的對(duì)應(yīng)序列
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本發(fā)明針對(duì)這段特異性序列設(shè)計(jì)了人線(xiàn)粒體DNA特異性引物。引物序列
hmtDNA-FP 5'CAC CCTATTAAC CAC TCACG 3'；
hmtDNA-RP 5'ATG TCTGTGTGGAAAGCG 3'。
擴(kuò)增產(chǎn)物大小為264bp。
同時(shí)針對(duì)小鼠與人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA同源序列設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物作為內(nèi)參對(duì)照引物。引物序列如下
mtDNA-FP 5' GGA TTA GATACC CCA CTATGC3'；
mtDNA-RP 5' GCT ACA CCT TGA CCTAACGT3'。
PCR產(chǎn)物大小為268/273bp (人/小鼠)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定例1.對(duì)人鼠混合DNA樣本具有特異性在小鼠DNA 中分別添加 0. 01%,0. 05%,0. 1%,0. 5%、1%、5%和 10%的人DNA樣 本時(shí)，分別采用人線(xiàn)粒體DNA特異性引物和人鼠線(xiàn)粒體DNA通用引物對(duì)梯度稀釋的人DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物電泳條帶的亮度隨樣本中人DNA含量的增加而增加，當(dāng)混 合樣本中的人DNA量為0. 01%時(shí)也能夠檢測(cè)到清晰而特異性的PCR產(chǎn)物電泳條帶。例2.比Alu序列檢測(cè)靈敏性高根據(jù)文獻(xiàn)合成人類(lèi)Alu基因特異性引物hAlu-FP 5' -CTG GGC GAC AGA ACG AGA TTC TAT-3 ' ；hAlu-RP 5' -CTC ACT ACT TGG TGA CAG GT TCA-3 ‘，PCR 產(chǎn)物大小 224bp。同時(shí)采用hmtDNA特異性引物和hAlu引物對(duì)嵌合小鼠DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明hmtDNA 引物PCR擴(kuò)增的電泳條帶亮度極顯著高于hAlu引物的PCR擴(kuò)增電泳條帶。例3.可檢測(cè)低嵌合率的人源化小鼠經(jīng)EasyS印負(fù)選人造血干祖細(xì)胞試劑盒分選獲得人造血干祖細(xì)胞，囊胚顯微注射 法，將顯微注射后重新擴(kuò)張的囊胚移植到假孕2. 5d子宮中，獲得人造血干細(xì)胞嵌合體小 鼠。分別提取出生lw、2w、4w和8w的小鼠鼠尾DNA，用hmtDNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在 110只小鼠中檢測(cè)到25只嵌合體陽(yáng)性小鼠，陽(yáng)性率為23%。參考文獻(xiàn)[l]McKenzie ΒΑ, Barrieux A, Varki NM. A novel detection system for submicroscopic human metastasis in athymic mice[J]. Cancer Commun,1991,3 (1) 15-19.[2]Zubair AC, Ali SA, Rees RC et al. Investigation of the effect of BB-94(batimastat)on the colonization potential of human lymphoma cells in SCID mice [J], Cancer Lett,1996,107(1) :91_95.[3]Kim J, Yu W, Kovalski K et al. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by anovel semiquantitative PCR-based assay[J], Cell,1998,94(3) :353_362.[4] Schneider T, Osl F, Friess T, et al. Quantification of human Alu sequences by real-time PCR-an improved method to measure therapeutic efficacy of anti-metastatic drugs in human xenotransplants[J]. Clin ExpMetastasis, 2002, 19 :571-582.
權(quán)利要求
以人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA特異性片段為引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為人源細(xì)胞DNA檢測(cè)方法的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA特異性片段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在人源細(xì)胞DNA檢 測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于引物序列不僅包括本方法中所述片段，也包括本方法所述人類(lèi) 線(xiàn)粒體DNA特異性片段內(nèi)的其他引物序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別是涉及人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA特異性片段擴(kuò)增技術(shù)在人源細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。所述人類(lèi)線(xiàn)粒體DNA特異片段PCR擴(kuò)增技術(shù)在人源細(xì)胞DNA檢測(cè)中具有良好的特異性，該方法的靈敏度比常用人類(lèi)基因組Alu基因序列特異性引物PCR擴(kuò)增的靈敏度要高，且操作簡(jiǎn)便、節(jié)約時(shí)間、費(fèi)用低廉，能夠滿(mǎn)足常規(guī)嵌合體基因型檢測(cè)的需要，因此，人mtDNA特異性保守序列PCR擴(kuò)增是一種理想的人源細(xì)胞檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101988123SQ20101026120
公開(kāi)日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者馮娟, 張連峰, 梁虹, 陳煒 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所