專利名稱：一種檢測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的高通量多重ldr分型試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于多重LDR分型試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的高通量 多重LDR分型試劑盒。
背景技術(shù)：
田間的多個(gè)物種對(duì)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)及其重要，它能為哪一營(yíng)養(yǎng)關(guān)系處于更重要的地 位提供指導(dǎo)，田間多個(gè)物種的檢測(cè)分型對(duì)于研究生態(tài)系統(tǒng)功能非常重要。目前國(guó)內(nèi)外已建 立了若干針對(duì)田間多個(gè)物種的檢測(cè)分型方法，但這些方法普遍存在著通量小、操作難度大、 煩瑣，提供信息量少等弱點(diǎn)，妨礙了研究機(jī)構(gòu)對(duì)田間多個(gè)物種開(kāi)展有效的科研和檢測(cè)?，F(xiàn)有 的檢測(cè)田間多個(gè)物種的方法主要分為兩種，一是傳統(tǒng)的對(duì)其腸道或排泄物進(jìn)行分析，一是 以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合連接酶檢測(cè)反應(yīng)為主要技術(shù)的高通量、高準(zhǔn)確度，高靈敏度分析法。從田間收集多個(gè)物種并對(duì)其腸道或排泄物進(jìn)行分析，其檢測(cè)手段從最初的放射性 標(biāo)記、多克隆抗體和物種的酶譜分析愈發(fā)傾向于單克隆抗體與DNA技術(shù)，檢測(cè)靶標(biāo)亦從單 一物種轉(zhuǎn)移到多物種鑒別。但因單克隆抗體制備極其煩瑣，且靶標(biāo)唯一難以實(shí)現(xiàn)高通量檢 測(cè)，故在檢測(cè)田間多個(gè)物種中其應(yīng)用方面大打折扣。而DNA技術(shù)在1997年首先在海洋生物 捕食鏈中展示其可行性后，逐漸成為脊椎動(dòng)物與無(wú)脊椎食物鏈研究的新型模式。DNA分子作 為遺傳信息的直接載體，不受環(huán)境、生物發(fā)育階段及器官組織的影響，因而能較為準(zhǔn)確地反 映出各個(gè)物種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，但常規(guī)的PCR方法需要對(duì)每個(gè)物種設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物來(lái)擴(kuò) 增，而田間物種種類繁多，無(wú)法使用多重PCR技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)多達(dá)數(shù)十種的植食者昆蟲(chóng)，故限制 了其應(yīng)用。通用引物PCR結(jié)合LDR(ligase detection reaction)技術(shù)是使用通用引物對(duì)多 物種的保守區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)種間物種特異性單核苷酸位點(diǎn)，構(gòu)建不同長(zhǎng)度的LDR物種特 異探針，利用高溫連接酶的高特異性對(duì)基因內(nèi)部的序列差異進(jìn)行檢測(cè)，因而具有高通量，高 準(zhǔn)確度，高靈敏度等特性，是一種可移植性很強(qiáng)的檢測(cè)方案。線粒體上的COI基因由于具有 獨(dú)特的遺傳特性，因此被用來(lái)分析生物遺傳多樣性和親緣關(guān)系。由于探針和引物具有高度 敏感性和特異性，使其能對(duì)多個(gè)物種進(jìn)行檢測(cè)分型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的高通量多重LDR分 型試劑盒，以克服現(xiàn)今普通的分型試劑盒只能揭示少量獵物的田間捕食規(guī)律，難以實(shí)現(xiàn)高 通量檢測(cè)的問(wèn)題。本發(fā)明的一種檢測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的高通量多重LDR分型試劑盒，包括(一)PCR擴(kuò)增體系(1)農(nóng)田16種物種的線粒體COI基因通用引物序列上游5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3‘；下游5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3‘；[OO11] (2)PCR擴(kuò)增體系試劑[OO12] 上游引物o．5 u M[OO13] 下游引物o．5 u M[O014] 10XBur’fer1>l
5]dNTPo．2rnM[OO16] M／’2．olDM[O017] ．Faq p。lymeraSeo．1 u l(o．5Unit)[OO18] H，。補(bǔ)水至10>l；[OO19] (二)多重LDR檢測(cè)體系
(1)農(nóng)田16種物種的線粒體C。工基因的特異探針序列
擬水狼蛛，LDR探針
F．FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGG(TCCTGACATATCTTTTCCTC(；AATAAATAATC
RP一．ITT(．FTTTTGGTTAI’TACCACCTTCTTTATTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Fam
擬水狼蛛，產(chǎn)物長(zhǎng)度121bp
白背飛虱，LDR探針
FTTGGAGCACC．FGATATAG(TTTCCCCC(；AATAAA(
RP—AATATAAGATTTTGGTTA(TTCCACCCTCCTTAAT—Fam
白背飛虱，產(chǎn)物長(zhǎng)度70bp
大螟，LDR探針
F．FTTTTTAGGAG(．TATTAATTTTAI’TACAA仁；AAT‘FAT(
RP—AATATACGAC．TAAATAATTTAT(TTTTGAT()AAAT．F-Fam；大螟，產(chǎn)I彩0長(zhǎng)度7 3bp
稻沼蠅，LDR探針
F．FTTT~’TCAGCTC．TTTTA(TAC．FTI’TATCATTACC．FGTTCTC
RP—GCTGGAGCCATTAC．FATG(TTCTTACGGATC(；AAATTTTTT—Fam
稻沼蠅，產(chǎn)物長(zhǎng)度82[，p
稻縱卷葉螟，LDR探針
F．FTTTTTTT(TATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTG
RP—CC．TTTAATAT’TAGGAGCCCC．FGATATAGC．FTq’TCCTTTTTTT—Fam
稻縱卷葉螟，產(chǎn)物長(zhǎng)度851，p
稻縱卷葉螟絨繭蜂，LDR探針
] F．FTTTTTTTI’TGCC．FTTATTATAATTTTTTTTATAGT’TATACCAG
RP一．FAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAA~’TCCATTTTTTTTT—Fam
稻縱卷葉螟絨繭蜂，產(chǎn)物長(zhǎng)度88t，p
桿蠅，LDR探針
F．FTTTTTTTTTTTTTGATTAT’TACCTCCTTCAT．FAA(TTTATTAATG
RP—GC．TAGAAGTATAGTAGAAAATGGAG(．TGGAA(TGGTTTTTTTTTT—Fam
桿蠅，產(chǎn)物長(zhǎng)度91bp
褐飛虱，LDR探針
F．FTTTTTTTTTTTCAGGATTTATAGGAACCATAA(；TAGTATAAT‘FAT(R:P-CGATCAGAATTAACTCAACCAGGATCTCTAATTAATTTTTTTTTTTT-Fam ； 褐飛虱，產(chǎn)物長(zhǎng)度94bp 黑肩綠盲蝽，LDR探針
F:TTTTTTTTTTTTTTTATCACATAATGGAAGATCAGTAGATTTAGCAATC ； R:P-TTCTCACTTCACTTAGCTGGTATTTCATCAATTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 黑肩綠盲蝽，產(chǎn)物長(zhǎng)度97bp 黑尾葉蝶，LDR探針
F:TTTTTTTTTTTTTTTTACTTTTAATAAGATCTATCATTGAAATAGGAGTG ； R:P-GGAACAGGTTGAACAGTATACCCCCCCCTTTCAAGTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 黑尾葉蟬，產(chǎn)物長(zhǎng)度IOObp 灰飛虱，LDR探針
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCTGGAGTTAGATCTATTATAGGAGCTATCAAC ； R=P-TTCATTTCTACAATTATTAATATACGATCAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 灰飛虱，產(chǎn)物長(zhǎng)度103bp 搖蚊，LDR探針
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCAGGAACAGGG ； RP-TGAACTGTTTATCCTCCACTTTCATCTGGAATTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 搖蚊，產(chǎn)物長(zhǎng)度106bp 薊馬，LDR探針
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCGAAATTTGAACACTTCATTTTTTGATCCAAG ； RP-AGGAGGAGGGGATCCAGTACTTTACCAACACTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 薊馬，產(chǎn)物長(zhǎng)度109bp 水蠅，LDR探針
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTG ； R :P-CATTAACTTTATTATTAGTAAGCAGTATAGTTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT ； 水蠅，產(chǎn)物長(zhǎng)度112bp 蚜蟲(chóng)，LDR探針
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAATTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAA ； R P-CTATACCAATTGTTATTGGTGGTTTTGGAAATTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 蚜蟲(chóng)，產(chǎn)物長(zhǎng)度115bp 二化螟，LDR探針
FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCTTTAATTGGGGATGATCAAATTTATAATACC ；
R=P-ATTGTTACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam
二化螟，產(chǎn)物長(zhǎng)度IlSbp ；
(2) LDR檢測(cè)體系試劑
混合探針0. lumol/L
IOXBuffer1 μ 1
PCR擴(kuò)增DNA模板 1 μ 1
Taq0.1 μ 1 (4Unit)
7
H2O補(bǔ)水至 10 μ 1。所用的1 X Taq DNA連接酶緩沖液具體組分為20mM Tris-HCl (pH 7. 6)，25mM KAc, IOmM Mg (Ac) 2, IOmM DTT，ImM NADfPO. Triton X100，緩沖液應(yīng)冷凍C存。所述的混合探針的方案為將16中物種探針以等濃度混合。本試劑盒主要由通用引物PCR和特異探針LDR兩部分組成。在PCR中，設(shè)計(jì)的通 用引物同時(shí)擴(kuò)增出所選物種的CO I基因序列，再經(jīng)過(guò)連接反應(yīng)，各物種特異的LDR探針達(dá) 到分型的目的。LDR信號(hào)由ABI Prism 377型核酸分析儀檢出，測(cè)得的熒光值作為定性的依 據(jù)。本試劑盒的設(shè)計(jì)原理包括以下步驟(1)靶標(biāo)基因的確定、稻田捕食者及其獵物的獲得選取的稻田捕食者為擬水狼蛛，獵物為白背飛虱、大螟、稻沼蠅、稻縱卷葉螟、稻縱 卷葉螟絨繭蜂、桿蠅、褐飛虱、黑肩綠盲蝽、黑尾葉蟬、灰飛虱、搖蚊、薊馬、水蠅、蚜蟲(chóng)和二化 螟，一共16種；選取線粒體上的CO I基因作為靶標(biāo)基因，進(jìn)行分型研究，構(gòu)建多物種聯(lián)合檢 測(cè)的PCR體系和多重LDR體系；(2)線粒體CO I基因片段的通用引物PCR擴(kuò)增及測(cè)序特異PCR引物擴(kuò)增擬水狼蛛及其獵物的CO I基因序列，將通用引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn) 物克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒里，并測(cè)序，得到包括擬水狼蛛在內(nèi)的16個(gè)物種的序列，每個(gè)物 種盡量測(cè)10個(gè)體，用于評(píng)估個(gè)體間的SNP影響；(3)序列比對(duì)及探針設(shè)計(jì)將測(cè)序的物種用DNAssist軟件比對(duì)，找出COI基因擴(kuò)增片段的種間差異，尋找種 間物種特異性單核苷酸位點(diǎn)，構(gòu)建LDR物種特異探針，選出的位點(diǎn)須經(jīng)物種個(gè)體間比對(duì)，排 除種內(nèi)SNP位點(diǎn)位于該物種特異性單核苷酸位點(diǎn)上；針對(duì)物種特異性核苷酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)LDR探針，各物種連接探針連接產(chǎn)物長(zhǎng)度為70 121bp，相鄰片段間隔為3bp;(4)探針特異性檢測(cè)及優(yōu)化抽提各物種的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，定量到統(tǒng)一濃度(IOpg/ μ L)。首先，取單模板和單探針做 探針特異性評(píng)估，經(jīng)測(cè)序儀分析，所有探針均有預(yù)測(cè)長(zhǎng)度連接產(chǎn)物生成；其次，取單模板和 多探針做探針特異性評(píng)估，經(jīng)測(cè)序儀分析，特異性良好。最后，多模板多探針檢測(cè)，將16個(gè) 物種的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒等濃度混合(總濃度IOpg/ μ L)，利用CO I的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后用多 重探針進(jìn)行檢測(cè)，得到多重探針檢測(cè)方案。有益效果本發(fā)明的試劑盒針對(duì)CO I基因的通用引物有效擴(kuò)增出所有目標(biāo)物種序列，保證了 各目標(biāo)序列以及其中低拷貝的模板可被檢測(cè)到；各目標(biāo)物種的特異探針進(jìn)一步又保證了特 異性，使各目標(biāo)序列完全區(qū)分出來(lái)，實(shí)現(xiàn)多重分型定量，從而了解田間捕食結(jié)構(gòu)的變化，維 護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。


圖1為CO I基因的通用引物PCR結(jié)合LDR檢測(cè)多個(gè)物種的示意圖；其中，(A) 16個(gè)物種的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA，⑶線粒體上CO I基因的通用引物，(C)利用CO I基因通用引物和質(zhì)粒DNA模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)，(D)針對(duì)CO I基因通用引物擴(kuò)增區(qū)段 設(shè)計(jì)的特異LDR探針，(E)針對(duì)CO I基因通用引物擴(kuò)增區(qū)段設(shè)計(jì)的不同長(zhǎng)度的特異LDR探 針，(F)進(jìn)行的是按特異探針混合方案進(jìn)行的多重LDR反應(yīng)，(G)ABI Prism 377型核酸分析 儀上獲得的單模板單探針熒光定量分型分析圖，(H)ABI Prism 377型核酸分析儀上獲得的 16個(gè)物種的多模板多探針熒光定量分型分析圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定
的范圍。
實(shí)施例1
(一)擬水狼蛛DNA和被食者DNA的通用引物擴(kuò)增
(1)將16個(gè)物種的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒等濃度混合，總濃度為IOpg/ μ L ；
⑵通用引物
上游5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3‘；
下游5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3‘；
(3)擴(kuò)增體系(10μ 1)
上游引物0. 5μΜ
下游引物0. 5μΜ
IOXBuffer1 μ 1
dNTP0. 2mM
Mg2+2. OmM
Taq polymerase0. 1 μ 1 (0. 5Unit)
加水至10 μ 1 ；
(4)擴(kuò)增程序
95 0C 15min
94°C 30s — 50°C Imin — 72°C 2min (35cycles)
72 °C 7min — 4°Cforever
(二)擬水狼蛛DNA和被食者DNA的連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)
(1)將通用引物擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物作為模板用于LDR信號(hào)檢測(cè)
(2) LDR 體系(10 μ1)
混合探針0.lumol/L
IOXBuffer1 μ 1
模板1 μ 1
Taq polymerase0. 1 μ 1 (4unit)
加水至10 μ 1
其中，16個(gè)物種的特異探針等濃度混合；
(3) LDR反應(yīng)程序
9
95 °C 2min94°C 30s — 60°C 2min (35cycles)。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的高通量多重LDR分型試劑盒，包括(一)PCR擴(kuò)增體系(1)農(nóng)田16種物種的線粒體CO I基因通用引物序列上游5′ GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3′；下游5′ TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3′；(2)PCR擴(kuò)增體系試劑上游引物 0.5μM下游引物 0.5μM10×Buffer 1μldNTP 0.2mMMg2+ 2.0mMTaq polymerase 0.1μlH2O補(bǔ)水至10μl(二)多重LDR檢測(cè)體系(1)農(nóng)田16種物種的線粒體CO I基因的特異探針序列擬水狼蛛，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTCCTGACATATCTTTTCCTCGAATAAATAATC；RP TTTCTTTTTGGTTATTACCACCTTCTTTATTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；擬水狼蛛，產(chǎn)物長(zhǎng)度121bp白背飛虱，LDR探針FTTGGAGCACCTGATATAGCTTTCCCCCGAATAAAC；RP AATATAAGATTTTGGTTACTTCCACCCTCCTTAAT Fam；白背飛虱，產(chǎn)物長(zhǎng)度70bp大螟，LDR探針FTTTTTTAGGAGCTATTAATTTTATTACAACAATTATC；RP AATATACGACTAAATAATTTATCTTTTGATCAAATT Fam；大螟，產(chǎn)物長(zhǎng)度73bp稻沼蠅，LDR探針FTTTTTTCAGCTCTTTTACTACTTTTATCATTACCTGTTCTC；RP GCTGGAGCCATTACTATGCTTCTTACGGATCGAAATTTTTT Fam；稻沼蠅，產(chǎn)物長(zhǎng)度82bp稻縱卷葉螟，LDR探針FTTTTTTTTCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTG；RP CCTTTAATATTAGGAGCCCCTGATATAGCTTTTCCTTTTTTT Fam；稻縱卷葉螟，產(chǎn)物長(zhǎng)度85bp稻縱卷葉螟絨繭蜂，LDR探針FTTTTTTTTTTGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCAG；RP TAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAATTCCATTTTTTTTT Fam；稻縱卷葉螟絨繭蜂，產(chǎn)物長(zhǎng)度88bp桿蠅，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTGATTATTACCTCCTTCATTAACTTTATTAATG；RP GCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACTGGTTTTTTTTTT Fam；桿蠅，產(chǎn)物長(zhǎng)度91bp褐飛虱，LDR探針FTTTTTTTTTTTTCAGGATTTATAGGAACCATAAGTAGTATAATTATC；RP CGATCAGAATTAACTCAACCAGGATCTCTAATTAATTTTTTTTTTTT Fam；褐飛虱，產(chǎn)物長(zhǎng)度94bp黑肩綠盲蝽，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTATCACATAATGGAAGATCAGTAGATTTAGCAATC；RP TTCTCACTTCACTTAGCTGGTATTTCATCAATTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；黑肩綠盲蝽，產(chǎn)物長(zhǎng)度97bp黑尾葉蟬，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTTACTTTTAATAAGATCTATCATTGAAATAGGAGTG；RP GGAACAGGTTGAACAGTATACCCCCCCCTTTCAAGTTTTTTTTTTTTTTT Fam；黑尾葉蟬，產(chǎn)物長(zhǎng)度100bp灰飛虱，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCTGGAGTTAGATCTATTATAGGAGCTATCAAC；RP TTCATTTCTACAATTATTAATATACGATCAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTT Fam；灰飛虱，產(chǎn)物長(zhǎng)度103bp搖蚊，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCAGGAACAGGG；RP TGAACTGTTTATCCTCCACTTTCATCTGGAATTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；搖蚊，產(chǎn)物長(zhǎng)度106bp薊馬，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCGAAATTTGAACACTTCATTTTTTGATCCAAG；RP AGGAGGAGGGGATCCAGTACTTTACCAACACTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；薊馬，產(chǎn)物長(zhǎng)度109bp水蠅，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTG；RP CATTAACTTTATTATTAGTAAGCAGTATAGTTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；水蠅，產(chǎn)物長(zhǎng)度112bp蚜蟲(chóng)，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAATTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAA；RP CTATACCAATTGTTATTGGTGGTTTTGGAAATTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；蚜蟲(chóng)，產(chǎn)物長(zhǎng)度115bp二化螟，LDR探針FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCTTTAATTGGGGATGATCAAATTTATAATACC；RP ATTGTTACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；二化螟，產(chǎn)物長(zhǎng)度118bp；(2)LDR檢測(cè)體系試劑混合探針0.1umol/L10×Buffer 1μlPCR擴(kuò)增DNA模板 1μlTaq 0.1μlH2O 補(bǔ)水至10μl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的高通量多重LDR分型試劑盒，其特 征在于所述的IXTaq DNA連接酶緩沖液具體組分為20mM pH 7. 6Tris_HCl，25mM KAc, IOmM Mg (Ac) 2, IOmM DTT，ImM NAD 和 0. 1% Triton X100，緩沖液冷凍C存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的高通量多重LDR分型試劑盒，其特 征在于所述的混合探針的方案為將16中物種探針以等濃度混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的高通量多重LDR分型試劑盒，包括農(nóng)田16種物種的線粒體COI基因通用引物，上游5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；下游5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；農(nóng)田16種物種的線粒體COI基因的特異探針序列；以及PCR擴(kuò)增和LDR檢測(cè)程序所用試劑。本發(fā)明的試劑盒針對(duì)COI基因的通用引物有效擴(kuò)增出所有目標(biāo)物種序列，保證了各目標(biāo)序列以及其中低拷貝的模板可被檢測(cè)到；各目標(biāo)物種的特異探針進(jìn)一步又保證了特異性，使各目標(biāo)序列完全區(qū)分出來(lái)，實(shí)現(xiàn)多重分型定量，從而了解田間捕食結(jié)構(gòu)的變化，維護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921828SQ201010102179
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者葉恭銀, 周宇荀, 李凱, 田俊策, 肖君華, 趙麗亞, 陳強(qiáng) 申請(qǐng)人:東華大學(xué)