專利名稱：預(yù)防及治療輪狀病毒腹瀉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及輪狀病毒腹瀉(rotavirus diarrhoea)的預(yù)防及治療，尤其涉及嬰兒及幼兒輪狀病毒腹瀉的預(yù)防及治療。
背景技術(shù)：
腹瀉疾病仍是嬰兒及兒童生存的主要全球性威脅，且在發(fā)展中國家及工業(yè)化國家，輪狀病毒感染是該群體罹患嚴(yán)重性脫水胃腸炎的主要原因。在西方國家，輪狀病毒感染的管理成本(估計(jì)僅美國每年的成本就超過10億美元)是負(fù)擔(dān)日益增加的健保預(yù)算的主要開支。近期開發(fā)的兩種新型輪狀病毒疫苗帶來希望，但即使可獲得有效的疫苗，其使用也可能受發(fā)展中國家財(cái)政拮掘的限制。此外，其對(duì)具有營養(yǎng)不良及伴隨免疫缺陷的兒童的功效仍值得懷疑。在最近幾十年內(nèi)，益生菌作為治療胃腸疾病的安全及可利用形式已受到極大關(guān)注。已被用于治療(intervention)由病毒引起的腹瀉的細(xì)菌屬于乳桿菌屬 (Lactobacillus)及雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。已提出抵抗輪狀病毒引起的胃腸炎的某種益生菌的治療能力歸因于其穩(wěn)定及增強(qiáng)黏膜屏障、產(chǎn)生抗微生物物質(zhì)及刺激局部抗原特異性與非特異性免疫應(yīng)答的能力。也注意了與不同菌株有效性及作用模式相關(guān)的顯著差異。例如，在1990年代初期，Saavedra等人觀察到相比未接受任何益生菌者的 26個(gè)兒童，施用乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)與嗜熱鏈球菌(Sti^ptococcus thermophilus)的組合在美國醫(yī)院慢性護(hù)理病房中降低四個(gè)兒童的腹瀉發(fā)生率及輪狀病毒釋放18個(gè)月(Saavedra等人，The Lancet 344，1046 1994)。然而，在利用雙歧桿菌的其他試驗(yàn)中并未獲得明確結(jié)果。例如，對(duì)1000名法國兒童的預(yù)防研究并未顯示腹瀉發(fā)生率或持續(xù)時(shí)間的降低 CThibault 等人，J Ped Gastro Nutr 39,147:2004)。最近，W001/10453描述廣泛篩選的260種不同細(xì)菌菌株的結(jié)果，其中僅4種顯示基本抑制輪狀病毒復(fù)制。已發(fā)現(xiàn)所有這四種菌株均屬于本發(fā)明人推斷的長雙歧桿菌 (B. Iongum)或青春雙歧桿菌(B. adolescentis)物種，這些物種對(duì)預(yù)防及治療輪狀病毒腹瀉特別有效。特別強(qiáng)調(diào)了青春雙歧桿菌的一種特定菌株，青春雙歧桿菌CNCM 1-2168預(yù)防輪狀病毒感染人類細(xì)胞的能力。然而，據(jù)稱已從成人糞便中分離了該菌株，使其較不適合包含于為嬰兒設(shè)計(jì)的產(chǎn)品中。由上可見，仍然需要具有有效抗輪狀病毒活性，且適合并入嬰兒及幼兒消費(fèi)產(chǎn)品中的其他益生菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，與先前推測(cè)相反的，益生菌雙歧桿菌的抗輪狀病毒活性并非根據(jù)該菌種可預(yù)測(cè)。更特定而言，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)最初分離自人乳中的短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)的特定菌株，短雙歧桿菌CNCM 1-3865，對(duì)于預(yù)防及治療輪狀病毒腹瀉極為有效，且即使是非復(fù)制形式時(shí)，仍可保持該活性。因此，在第一方面中，本發(fā)明提供短雙歧桿菌CNCM 1-3865，其于2007年11月15 日保藏于法國微生物保藏中心。在第二方面中，本發(fā)明提供適用于預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的組合物，其包含短雙歧桿菌CNCM 1-3865。在第三方面中，本發(fā)明提供短雙歧桿菌CNCM 1-3865在制備用于預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的藥物或治療性營養(yǎng)組合物中的用途。在第四方面中，本發(fā)明提供預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的方法，其包含對(duì)需要其的嬰兒或幼兒施用治療量的短雙歧桿菌CNCM 1-3865。已知年齡為2至4周的健康、經(jīng)陰道分娩、母乳喂養(yǎng)的嬰兒的腸道小型生物群 (可將其視為此年齡組的最佳小型生物群)主要為雙歧桿菌屬，而配方食品喂養(yǎng)的嬰兒擁有較復(fù)雜的小型生物群，其通常同時(shí)存在雙歧桿菌屬、擬桿菌屬(Bacteroides)、梭菌屬 (Clostridia)及鏈球菌屬(Str印tococci)。已假設(shè)由于母乳哺育的嬰兒比配方食品喂養(yǎng)的嬰兒較少罹患腹瀉感染，因此以雙歧桿菌為主的小型生物群必定提供抗輪狀病毒感染的保護(hù)作用。然而，由美國疾病控制中心(US Centers for Disease Control)在孟加拉國進(jìn)行的一系列研究并未證實(shí)母乳哺育的嬰兒比配方食品喂養(yǎng)的嬰兒較少罹患輪狀病毒感染 (Glass等，Acta Paediatr. Scand. 75，713-718 ； 1986)。因此，流行病學(xué)數(shù)據(jù)并不支持雙歧桿菌大體上抗輪狀病毒腹瀉的保護(hù)作用。本發(fā)明人已證實(shí)盡管已于數(shù)種雙歧桿菌屬中發(fā)現(xiàn)抗輪狀病毒活性，但該活性并非物種特有特征。這表示盡管尚未闡明針對(duì)所觀察到的作用的機(jī)制，但介導(dǎo)抗輪狀病毒性質(zhì)的基因可能不屬于該物種的共享核心基因組部分。附圖簡(jiǎn)述

圖1比較感染猿猴輪狀病毒并接受不同益生菌治療的四組小鼠隨時(shí)間的腹瀉癥狀的程度。圖2比較感染猿猴輪狀病毒及接受呈未處理及經(jīng)熱處理形式的相同益生菌治療的三組小鼠隨時(shí)間的腹瀉癥狀的程度。發(fā)明詳述在本說明書中，以下術(shù)語具有以下含義“嬰兒”意指年齡為12個(gè)月以下的兒童；“益生菌，，意指對(duì)宿主的健康或康樂具有有益效果的微生物細(xì)胞制備物或微生物細(xì)胞組分° (Salminen S. > Ouwehand A.、Benno Y.等人，"Probiotics :how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999 10 107-10)；“幼兒”意指年齡為一至六歲的兒童。除非另外說明，否則所有百分比是重量比。益生菌短雙歧桿菌CNCM 1-3865可作為藥物對(duì)嬰兒或幼兒施用，例如以相當(dāng)于 IOelO cfu的每日劑量溶解于水中并用匙施用?；蛘?，其可方便地在嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品或成長乳中，以相當(dāng)于10e3至10el2 cfu/g(基于干重)的量施用，更優(yōu)選以相當(dāng)于10e7至10el2 cfu/g的量施用。術(shù)語“相當(dāng)于的量”包括下列可能性細(xì)菌是活的、非復(fù)制的或死的或甚至以片段形式(如DNA或細(xì)胞壁物質(zhì))存在。換言之，細(xì)菌數(shù)量是以假如所有細(xì)菌均是活的時(shí)該數(shù)量的細(xì)菌的菌落形成能力表示，而不論其是否真正是活的、非復(fù)制的或死的、片段的或任何或所有這些狀態(tài)的混合物。根據(jù)本發(fā)明嬰兒配方食品可包含蛋白質(zhì)源，其含量不超過2.0g/100kcal，優(yōu)選 1.8至2. Og/kcal。雖然優(yōu)選以乳清作為超過50wt%的蛋白質(zhì)源，但只要能滿足必需胺基酸的最小需求并可確保令人滿意的生長，蛋白質(zhì)的種類并不認(rèn)為是本發(fā)明的關(guān)鍵。因此，可使用基于乳清、酪蛋白及其混合物的蛋白質(zhì)源及基于大豆的蛋白質(zhì)源。至于所關(guān)注的乳清蛋白，該蛋白質(zhì)源基于酸乳清或甜乳清或其混合物，且可包括期望的任何比例的α-乳清蛋白及β-乳球蛋白。蛋白質(zhì)是完整或水解的蛋白質(zhì)或完整蛋白質(zhì)與水解蛋白質(zhì)的混合物。希望提供部分水解的蛋白質(zhì)(水解度是2至20%之間)，以例如用于據(jù)信具有發(fā)生牛奶過敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的嬰兒。若需要水解蛋白，則水解過程可按期望的方式進(jìn)行，且其是本領(lǐng)域中已知的。例如， 乳清蛋白水解物可依一或多個(gè)步驟，用酶促水解乳清部分制得。若作為起始材料的乳清部分實(shí)質(zhì)上不含乳糖，則發(fā)現(xiàn)在水解過程期間，該蛋白質(zhì)較少受到賴氨酸阻斷。這能使賴氨酸阻斷的程度從約15wt%的總賴氨酸減少至低于約10wt%的賴氨酸；例如，約7wt%的賴氨酸可極大改善蛋白源的營養(yǎng)品質(zhì)。該嬰兒配方食品可包含糖類來源。盡管優(yōu)選糖類來源是乳糖，但仍可使用任何常見于嬰兒配方食品中的常用糖類來源，例如乳糖、蔗糖、麥芽糖糊精、淀粉及其混合物。優(yōu)選地，糖類來源提供該配方食品總能量的35至65%。嬰兒配方食品可包含脂質(zhì)來源。脂質(zhì)來源可以是適用于嬰兒配方食品的任何脂質(zhì)或脂肪。優(yōu)選的脂肪來源包括棕櫚油精、高油酸向日葵油及高油酸紅花油。亦可添加必需脂肪酸(亞油酸及α-亞麻酸)及少量含有大量預(yù)形成花生四烯酸及二十二碳六烯酸的油，例如魚油或微生物油。總之，脂肪含量優(yōu)選是提供配方食品總能量的30至55%的含量。脂肪來源中η-6對(duì)η-3脂肪酸的比例優(yōu)選為約5 1至約15 1，例如約8 1至約 10 1。嬰兒配方食品還可含有所有被認(rèn)為是每天膳食所必需及營養(yǎng)上有效量的維生素及礦物質(zhì)。已針對(duì)某些維生素及礦物質(zhì)建立最低需求。礦物質(zhì)、維生素及任選存在于嬰兒配方食品中的其他營養(yǎng)素的實(shí)例包括維生素Α、維生素Bi、維生素Β2、維生素Β6、維生素Β12、 維生素Ε、維生素K、維生素C、維生素D、葉酸、肌醇、煙酸、生物素、泛酸、膽堿、鈣、亞磷、碘、 鐵、鎂、銅、鋅、錳、氯、鉀、鈉、硒、鉻、鉬、牛磺酸、及L-肉堿。礦物質(zhì)通常是以鹽形式加入。特定礦物質(zhì)及其他維生素的存在及量將依旨在施用的嬰兒群而變化。若須要，嬰兒配方食品可含有乳化劑及穩(wěn)定劑，如大豆卵磷脂、單-及二-檸檬酸甘油酯等。嬰兒配方食品可任選含有其他具有有益效果的物質(zhì)，如纖維、乳鐵蛋白 (Iactoferrin)、核苷酸、核苷等。上述嬰兒配方食品可以由任何合適的方法制備。例如，可由蛋白質(zhì)、糖類來源和脂肪來源以合適比例混合在一起而制備。若使用乳化劑，則可在此時(shí)添加。維生素及礦物質(zhì)可在此時(shí)添加，但通常是稍后添加，以避免熱降解。可在混合之前，先將任何親脂性維生素、 乳化劑等溶解于脂肪來源中。然后可將水，優(yōu)選是已接受反滲透處理的水混合至其中，形成液體混合物。水溫宜約50°C至約80°C，以輔助這些成分分散?？墒褂檬惺鄣囊夯瘎┬纬梢后w混合物。然后例如以兩個(gè)階段使該液體混合物均化。
然后可通過例如在約5秒至約5分鐘內(nèi)，將該液體混合物快速加熱至約80°C至約 150°C范圍內(nèi)的溫度來熱處理該液體混合物，以減少細(xì)菌量(load)?？赏ㄟ^蒸汽噴射、高壓滅菌器或通過熱交換器，例如，平板熱交換器進(jìn)行此過程。然后可通過例如急驟冷卻，將該液體混合物冷卻至約60°C至約85°C。接著，可例如以兩個(gè)階段再次使該液體混合物均化，第一階段是于約IOMI5a至約30MI^下，第二階段于約2MPa至約IOMI^a下。然后，進(jìn)一步冷卻該均化混合物，以添加熱敏組分，例如維生素及礦物質(zhì)。此時(shí)，適宜調(diào)整該均化混合物的PH及固體含量。將該均化混合物轉(zhuǎn)移至合適的干燥裝置(例如噴霧干燥器或冷凍干燥器)，并轉(zhuǎn)化為粉末。該粉末應(yīng)具有少于約5wt%的水分含量。短雙歧桿菌CNCM 1-3865可根據(jù)任何合適方法培養(yǎng)并通過例如冷凍干燥器或噴霧干燥器制備，以添加至嬰兒配方中?，F(xiàn)將參考以下實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例1根據(jù)本發(fā)明嬰兒配方的組合物實(shí)例如下所示。此組合物僅以舉例方式給出。
權(quán)利要求
1.短雙歧桿菌CNCM1-3865。
2.適用于預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的組合物，其包含短雙歧桿菌CNCM1-3865。
3.權(quán)利要求2的組合物，其是嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品或成長乳。
4.權(quán)利要求3的組合物，其包含基于干重，相當(dāng)于10e3至10el2cfu/g的量的短雙歧桿菌 CNCM 1-3865。
5.權(quán)利要求3或4的組合物，其包含相當(dāng)于10e7至10el2cfu/g的量的短雙歧桿菌 CNCM 1-3865。
6.權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)的組合物，其還包含至少一種益菌素，其量為該組合物的 0. 3 至 6wt%。
7.權(quán)利要求2的組合物，其是補(bǔ)充劑且每單位劑量包含IO4至IO12cfu的短雙歧桿菌 CNCM 1-3865。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的組合物的用途，其用于制備預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的藥物或治療性營養(yǎng)組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)CNCM I-3865、包含短雙岐桿菌CNCM I-3865的組合物，以及短雙岐桿菌CNCM I-3865用于預(yù)防或治療輪狀病毒腹瀉的用途。
文檔編號(hào)A23C9/12GK102325458SQ200980157146
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者C·卡瓦迪尼, F·阿里戈尼, H·布魯索, N·佩奇 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司