專利名稱：免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法及其用途，更詳細(xì)的說(shuō)，本發(fā)明是利用不 會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段，該塵螨肽片段不會(huì)與免疫球蛋白E(IgE)結(jié)合引起過(guò)敏反 應(yīng)，再添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白來(lái)加強(qiáng)免疫反應(yīng)，此種方式具有比單獨(dú)分離自真菌免疫調(diào)節(jié) 蛋白或單獨(dú)使用塵螨肽片段，具有更好的免疫治療效果。
背景技術(shù)：
過(guò)敏性支氣管炎是最常見(jiàn)的慢性疾病之一，通常發(fā)生在兒童，其特征為第二型輔 1 T MM (Th2 immune response)弓 1 ! ^! (von MutiusE. , J. Allergy Clin. Immunol. 2004 ；113 :373-379)。因?yàn)樵黾拥牡诙洼o助T細(xì)胞和過(guò)敏免疫疾病有關(guān)，醫(yī) 學(xué)科學(xué)家推測(cè)過(guò)敏性疾病引起的原因是調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(Treg-cells)量的不足，因此調(diào)節(jié) 型T細(xì)胞無(wú)法控制第二型輔助T細(xì)胞引起的過(guò)敏免疫反應(yīng)(Curotto de Lafaille Μ. A. & LafailleJ. J.，Curr. Opin. Immunol. 2002 ；14 :771-778)。調(diào)節(jié)型T細(xì)胞是胸腺淋巴細(xì)胞具有免疫抑制特性的一個(gè)次分類(0’ GarraA. & Vieira P. Nat. Med. 2004 ； 10 :801-805)。雖然天然產(chǎn)生 CD4+調(diào)節(jié)型 T 細(xì)胞 (⑶4+Treg-cells)起源于胸腺，但這些調(diào)節(jié)型T細(xì)胞在特定條件下亦可于外圍循環(huán)系統(tǒng) 產(chǎn)生(Gavin Μ. A. et al.，Nature 2007;445:771-775)。過(guò)敏性支氣管炎的患者外圍血 液衍生的調(diào)節(jié)型T細(xì)胞能夠抑制第一型與第二型細(xì)胞激素的產(chǎn)生(Bellinghausen I.et al.，J. Allergy Clin. Immunol. 2003 ；111 :862-868)。更進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，過(guò)敏患者 調(diào)節(jié)型T細(xì)胞，特別是在花粉季節(jié)，抑制功能減弱(Grindebacke H. et al.，Clin. Exp. Allergy. 2004 ；34 :1364-1372)。標(biāo)準(zhǔn)化萃取的過(guò)敏原免疫治療是一種傳統(tǒng)治療方法，但會(huì)與細(xì)胞膜上的免疫球蛋 白E連結(jié)引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。因此使用不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)的肽片段，來(lái)避免與免疫球蛋 白E結(jié)合引起過(guò)敏的治療方式，值得進(jìn)一步探討。過(guò)敏原免疫治療的另一種免疫替代治療策略是添加免疫刺激核苷酸以增強(qiáng)抗原 疫苗功能使免疫偏向于第二型輔助T細(xì)胞且增強(qiáng)第一型輔助T細(xì)胞(Bohle B. et al. ,Eur. J. Immunol. 1999 ；29 =2344-2353)。具有豬草抗原(Pigweed Amb a 1)結(jié)合免疫刺激核苷 酸具有抑制大鼠呼吸道嗜酸性白血球增多與過(guò)度反應(yīng)的作用(Tighe H. et al.，J. Allergy Clin. Immunol. 2000 ；106 :124-134)。對(duì)豬草過(guò)敏的成人使用逐漸增加劑量的過(guò)敏原結(jié) 合免疫刺激核苷酸進(jìn)行治療，具有減低鼻黏膜嗜酸性白血球、白細(xì)胞介素_4(IL-4)的表 現(xiàn)和增加干擾素(Interferon-γ)表現(xiàn)作用(Marshall J. D. et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 2001 ；108 :191-197)。白細(xì)胞介素-10(IL-10+)具有許多種的抗過(guò)敏特性，包含抑制肥大細(xì)胞、嗜酸 性白血球與T細(xì)胞的反應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)B細(xì)胞(B cell)制造免疫球蛋白G4(IgG4) (Akdis C. A. et al.，J Clin Invest. 1998 ；102 :98-106)。最近研究指出，成功的過(guò)敏原免疫治療 能使調(diào)節(jié)型T細(xì)胞增生及分泌白細(xì)胞介素-10(Francis J. N. et al.，J. Allergy Clin.Immunol. 2003；111 :1255-1261)。真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白為分離自金針菇(Flammulina velutipes)的一種免疫調(diào)節(jié)蛋 白。金針菇的免疫調(diào)節(jié)蛋白具有許多已經(jīng)被證實(shí)的機(jī)能性，包含免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、預(yù)防腫 瘤、抗病毒、保護(hù)肝臟、抗氧化、降膽固醇、降血糖與抑制食欲。更進(jìn)一步，能抑制過(guò)敏反應(yīng)和 提高制造白細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素(IFN-γ)來(lái)防止大鼠體內(nèi)食物過(guò)敏的發(fā)展(Hsieh K. Y. et al.，Clin. Exp. Allergy. 2003 ；33 :1595-1602)。先前的研究(臺(tái)灣專利第097874號(hào))金針菇是一種可食用性的蕈類，經(jīng)過(guò)分 離可純化得到免疫性調(diào)節(jié)蛋白，命名為飛益福(FlP-fve)。該發(fā)明揭露飛益福具有促進(jìn) 人類淋巴細(xì)胞增殖能力，抑制胎牛血清蛋白(BSA)所誘發(fā)的全身性過(guò)敏反應(yīng)(Systemic anaphylaxis)。但是在該發(fā)明中僅具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)的功效，并不具有過(guò)敏原專一性。在先前的研究中(臺(tái)灣專利第U99735號(hào))一種免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Immunomodulatory protein)，是克隆自小抱子靈芝 Ganodermamicrosporum,其基因序列 及其轉(zhuǎn)譯的蛋白質(zhì)序列，與已知靈芝G. Iucidum菌絲體中分離具有免疫功效的糖蛋白LZ-8 專利所保護(hù)的不同，且具有較LZ-8更有效率的免疫調(diào)節(jié)能力。但上述免疫調(diào)節(jié)蛋白亦未結(jié) 合其它的過(guò)敏原，來(lái)進(jìn)一步加強(qiáng)其免疫調(diào)節(jié)功效。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的主要目的為提供一種免疫調(diào)節(jié)肽的制備 方法及其用途，該免疫調(diào)節(jié)肽是一種具有過(guò)敏原專一性的免疫調(diào)節(jié)肽，其用途是在制備過(guò) 敏疾病的免疫治療藥物方面的應(yīng)用，此塵螨肽片段不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合而引起過(guò)敏反 應(yīng)，再添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，不僅安全且可加強(qiáng)過(guò)敏患者的免疫功能，是一種過(guò)敏原專一 性的免疫治療方法。為達(dá)成此發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種免疫調(diào)節(jié)肽，該塵螨肽片段不會(huì)與免疫球蛋 白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)，再添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，可作為過(guò)敏患者的一種過(guò)敏原專一性 的免疫治療方法。本發(fā)明的重組塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，不但具有免疫調(diào)節(jié)功能，而且 不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，所以本發(fā)明關(guān)于免疫調(diào)節(jié)肽組合物的制備方法與用途，為兼顧安全又 具有免疫反應(yīng)的組合物。本發(fā)明將可用于過(guò)敏個(gè)體，以皮下注射、服用、貼附皮膚或黏膜的 免疫調(diào)節(jié)肽，來(lái)達(dá)到免疫調(diào)節(jié)功能的方法。


圖1為本發(fā)明經(jīng)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加塵螨過(guò)敏原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原 加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段加真菌免疫調(diào) 節(jié)蛋白處理后，對(duì)過(guò)敏與非過(guò)敏患者的你即3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的影響。圖2為本發(fā)明經(jīng)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加塵螨過(guò)敏原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原 加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段加真菌免疫調(diào) 節(jié)蛋白處理后，對(duì)你即3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞中白細(xì)胞介素-10的影響。圖3為本發(fā)明經(jīng)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加塵螨過(guò)敏原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原 加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白處理后，對(duì)你即3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞中β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的影響。圖4為本發(fā)明分離過(guò)敏與非過(guò)敏患者調(diào)節(jié)型T細(xì)胞，培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加塵螨過(guò)敏 原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò) 敏的塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白處理后，對(duì)外圍血液?jiǎn)魏饲蚣?xì)胞增殖對(duì)調(diào)節(jié)型T細(xì) 胞的影響。圖5為為本發(fā)明經(jīng)分離過(guò)敏與非過(guò)敏患者調(diào)節(jié)型T細(xì)胞，培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加塵螨 過(guò)敏原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引 起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白處理后，對(duì)外圍血液?jiǎn)魏饲蚣?xì)胞增殖對(duì)細(xì) 胞激素分泌的影響。
具體實(shí)施例方式為了使上述本發(fā)明和其它目的、特征與優(yōu)點(diǎn)更能夠明顯易懂，以下特舉較佳實(shí)施 例子，并配合附圖，做更進(jìn)一步說(shuō)明如下本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法及其用途，包含以下程序一、收集過(guò)敏性鼻炎的患者，該過(guò)敏性鼻炎患者定義為打噴嚏、流鼻涕、鼻腔窒悶 的病史。伴隨暴露在過(guò)敏原導(dǎo)致病情更進(jìn)一步惡化與皮膚過(guò)敏惡化的反應(yīng)。使用商業(yè)試劑 (Pharmacia, CAP System, Upppsala, Sweden)對(duì)患者進(jìn)行塵螨敏感的測(cè)試，皮膚陽(yáng)性反應(yīng)和 且具有特定塵螨免疫球蛋白E。免疫球蛋白E測(cè)定與皮膚測(cè)定，兩種反應(yīng)皆顯示陽(yáng)性患者包 含在本試驗(yàn)，兩種反應(yīng)皆為陰性患者作為對(duì)照組。臺(tái)中榮民總醫(yī)院人體試驗(yàn)委員會(huì)認(rèn)可本 發(fā)明的人體試驗(yàn)，每一位受試者皆告知此試驗(yàn)與簽署受試同意書(shū)。二、受試者使用塵螨(D.farinae)與含有重組塵螨肽片段(Der f2)進(jìn)行皮膚 針刺測(cè)試，該塵螨肽片段不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏，在最終滴定后，兩者測(cè)試 物濃度為lOOyg/ml溶解于含50%甘油的磷酸緩沖液中(Tsai J. J. et al. , Int Arch Allergy Immunol. 2000 ；121 =205-210) 0簡(jiǎn)要的說(shuō)，試驗(yàn)進(jìn)行使用滅菌可拋棄式涂抹器 (Greer Laboratories, Lenoir, NC, USA)。陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組，分別使用商業(yè)用塵螨 (D. farinae)，該萃取物的濃度為0. 8 μ g/10 μ g，磷酸甘油緩沖液含組織胺的濃度1. Omg/ ml。陽(yáng)性反應(yīng)患者的過(guò)敏反應(yīng)面積大于3X3mm2。使用Wiarmacia CAPSystem測(cè)定塵螨 (D. farinae)免疫球蛋白E含量。測(cè)定過(guò)程為自動(dòng)化進(jìn)行，以世界衛(wèi)生組織免疫球蛋白E標(biāo) 準(zhǔn)品作為結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品，濃度超過(guò)0. 35kU/L視為陽(yáng)性反應(yīng)。三、重組塵螨肽片段和真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的表現(xiàn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化(Transformation)至 酵母菌(Pichia pastoris)。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction)產(chǎn)生重組 塵螨肽片段和真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的編碼脫氧核糖核酸(Encoding DNA)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò) 增脫氧核糖核酸的片段，然后通過(guò)酶(EcoRI/NotI)切割塵螨肽片段，切開(kāi)的重組塵螨肽片 段不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)，再連結(jié)至pPIC9K載體anvitr0gen，San Diego, CA)。轉(zhuǎn)化此結(jié)構(gòu)物進(jìn)入大腸桿菌(E.coli T0P10F)，依序再一次確認(rèn)此插入物的構(gòu)造。依 照操作手冊(cè)，此PPIC9K塵螨肽片段不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的載體與真菌免 疫調(diào)節(jié)蛋白被轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母菌內(nèi)(Strain GS115, Pichia pastoris)。該重組物培養(yǎng)在酵 母萃取物培養(yǎng)基，震蕩水浴槽200rpm的轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度與持續(xù)48小時(shí)。培養(yǎng)后細(xì)胞 離心，然后轉(zhuǎn)換至甲醇緩沖液(PH 6.0)，培養(yǎng)物于培養(yǎng)后96小時(shí)收獲，接著使用50%硫酸銨進(jìn)行部份純化沉淀的步驟。該沉淀物溶于0. 02M的磷酸緩沖液(pH 7.幻，并使用Amicon Ultra PL-IO (Millipore, Bedford, ΜΑ)將樣品去鹽化。經(jīng)此步驟，重組塵螨肽片段是由塵 螨(D. farinae)過(guò)敏原前面1_63個(gè)氨基酸所構(gòu)成的肽片段，該塵螨肽片段不會(huì)與免疫球蛋 白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)。此聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物連接于pGEM-Τ載體(ftOmega，Madison, WI, USA)，使用酶(Baml/Sall)雙重水解，目標(biāo)基因亞克隆(Subclone)進(jìn)入pET_30a質(zhì)體， 使用DNA序列分析確認(rèn)此組成物基因序列。不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏的肽片段的 質(zhì)體pET-30a被轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)(Escherichia coli BL21)。依據(jù)使用者操作手 冊(cè)純化蛋白質(zhì)(Novagen，Valencia, CA, USA)，此塵螨肽片段不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合引起 過(guò)敏表現(xiàn)為六倍組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)(6x His-tagged proteins)。四、使用含有肝素的針筒收集50ml血液樣品用于細(xì)胞分離與培養(yǎng)，通過(guò) Ficoll-Paque Plus 密度梯度離心(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)分離夕卜圍血 液?jiǎn)魏饲蚣?xì)胞。再通過(guò)陰極免疫磁性選擇法分離CD4+T細(xì)胞；通過(guò)陽(yáng)極磁性細(xì)胞篩選分離 CD25+T細(xì)胞(MACS ；Miltenyi, Gladbach, Germany)。細(xì)胞培養(yǎng)在5ml試管中，細(xì)胞數(shù)目為 lX106/ml，培養(yǎng)基(RPMI1640)添加青霉素、鏈霉素與谷胺酰胺(Gibco，Grand Island, NY, USA)，持續(xù)培養(yǎng)六天。⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞使用培養(yǎng)基(Medium)、培養(yǎng)基添加塵螨過(guò)敏原(Der f2)、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FlP-fve)、塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(Der f2+FIP-fve)、 不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白共同培養(yǎng)(Der f2 N ρ印tide+FIP-fve)。外圍血液?jiǎn)魏饲蚣?xì)胞(50 μ g/ml)與絲裂霉素C(Mitomycin C)共同培養(yǎng)對(duì)⑶4+⑶25+T細(xì)胞是作為存在的抗原細(xì)胞。細(xì)胞使用anti-⑶4-PE-Cy5與 anti-⑶25-APC作為細(xì)胞表面標(biāo)記，然后R)xp3-FITC作為轉(zhuǎn)錄因子。在第六天，添加植物 性血液凝集素A(Phytohemagglutinin A, 1 μ g/ml)于培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)二天。使用三色 細(xì)胞流變儀(FACSCalibur ；Becton-Dickinson, Heidelberg, Germany)運(yùn)用下列的單株 抗體CD4-藻紅蛋白-Cy5(CD4-phycoerythrin-Cy5(CD4-PE-Cy5))小鼠 IgGl、CD25-別 藻藍(lán)蛋白(CD25-allophycocyanine (CD25-APC))小鼠 IgGl (BD Pharmingen, San Diego, CA)與 Foxp3_ 異硫氰酸焚光素(Foxp3-f luorescein isothiocyanate (Foxp3_FITC)) (eBioscience, San Diego, CA)分析調(diào)節(jié)型 T 細(xì)胞，以確認(rèn) CD4+CD25+Foxp3+ 調(diào)節(jié)型 T 細(xì) 胞在⑶4+⑶25+T細(xì)胞占有百分比。使用兩種蛋白質(zhì)MAb IL-IO-多甲藻黃素葉綠素蛋白 (IL-10-peridinin chlorophyll protein (IL-lO-PerCP))與MAb TGF-β-多甲藻黃素葉綠 素蛋白(TGF-β-peridininchlorophyll protein(TGF-β-PerCP))依序作為第四種顏色以 區(qū)分IL-IO+與TGF- β +調(diào)節(jié)型T細(xì)胞。五、分析⑶4+⑶25+Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞占有⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞之百分比。 ⑶4+⑶25+Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞與絲裂霉素C經(jīng)單株抗體處理后培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加塵螨 過(guò)敏原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引 起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白處理后共同培養(yǎng)。數(shù)據(jù)表示為平均值士七 位過(guò)敏與非過(guò)敏患者樣本平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。與培養(yǎng)基對(duì)照組比較，*p = 0.01。結(jié)果顯示， Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞培養(yǎng)后數(shù)目增加。與對(duì)照組比較，培養(yǎng)基含有塵螨過(guò)敏原加真菌免疫 調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白共同 培養(yǎng)，過(guò)敏患者的⑶4+⑶25+Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞百分比顯著增加(p = 0. 01)。但是非過(guò)敏患者對(duì)過(guò)敏原刺激，則無(wú)顯著增加。僅含有塵螨過(guò)敏原或真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的刺激組別， 過(guò)敏患者或非過(guò)敏患者的⑶4+⑶25+Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞百分比皆無(wú)顯著增加(如圖一所 示)°六、分析白細(xì)胞介素-10(IL-10+)在⑶4+⑶25+Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞占有百分比。 經(jīng)單株抗體處理后的CD4+CD25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞與絲裂霉素C，培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加塵螨過(guò) 敏原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起 過(guò)敏的塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-fve+N-termial)處理后共同培養(yǎng)。數(shù)據(jù) 表示為平均值士七位過(guò)敏與非過(guò)敏患者樣本平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。與培養(yǎng)基對(duì)照組比較，*P < 0. 01。結(jié)果顯示，白細(xì)胞介素-10在對(duì)照組過(guò)敏患者與非過(guò)敏患者，此二組別無(wú)顯著差 異。經(jīng)塵螨過(guò)敏原添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽 片段加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白刺激后，過(guò)敏患者白細(xì)胞介素-10顯著的增加(p<0. 05)。然而， 非過(guò)敏患者的白細(xì)胞介素-10，試驗(yàn)期間并未顯著增加(如圖二所示)。七、分析β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF- β +)調(diào)節(jié)型T細(xì)胞在⑶4+⑶25+Foxp3+調(diào)節(jié)型 T細(xì)胞占有百分比。經(jīng)單株抗體處理后的⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞與絲裂霉素C，培養(yǎng)基、 培養(yǎng)基添加塵螨過(guò)敏原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫 球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏的塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白處理后共同培養(yǎng)。分析β型 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)型T細(xì)胞占R)xp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞增加的百分比。數(shù)據(jù)表示為平均值士 七位過(guò)敏與非過(guò)敏患者樣本平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差。與培養(yǎng)基對(duì)照組比較，*p<0.01。結(jié)果顯 示，β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)型T細(xì)胞在對(duì)照組過(guò)敏患者與非過(guò)敏患者，此二組別無(wú)顯著差 異。經(jīng)塵螨過(guò)敏原添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽 片段加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白刺激后，過(guò)敏患者β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)型T細(xì)胞顯著的增加(ρ <0.05)。然而，非過(guò)敏患者的β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)型T細(xì)胞，試驗(yàn)期間并未顯著增加。 僅過(guò)敏患者組別經(jīng)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白刺激后，過(guò)敏患者調(diào)節(jié)型T細(xì)胞顯著的增加(如圖三 所示)。八、依據(jù)使用者手冊(cè)，植物性血液凝集素A刺激外圍血液?jiǎn)魏饲蚣?xì)胞與調(diào)節(jié)型 T細(xì)胞，分離過(guò)敏與非過(guò)敏患者調(diào)節(jié)型T細(xì)胞，培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加塵螨過(guò)敏原、真菌免 疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏的塵螨 肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白處理后共同培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)七日，然后使用BrdU流變商業(yè) 套組(Becton-DickinsonWiarmingen)試劑固定與滲透性。打開(kāi)合并的BrdU，使用脫氧 核糖核酸水解酶(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)分解 DNA 在 37 °C 持續(xù)一小 時(shí)。使用連結(jié)FITC特異性抗體(Anti-BrdU Ab)染色后，使用細(xì)胞流變儀(FACSCalibur， Becton-Dickinson)，運(yùn)用 CellQuest 軟件分析試驗(yàn)結(jié)果(Becton-Dickinson)。分析塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的 塵螨肽片段加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白刺激后對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示，塵螨過(guò)敏原或真菌免 疫調(diào)節(jié)蛋白刺激周邊血液?jiǎn)魏饲蚣?xì)胞能抑制植物性血液凝集素A刺激外圍血液?jiǎn)魏饲蚣?xì) 胞增殖(如圖四所示)。九、使用商業(yè)用試劑(A bead-based Flowcytomix)分析細(xì)胞培養(yǎng)基上層液的四種 細(xì)胞激素(IL-2，IL-5，IL-IO與IFN-Y)。分離過(guò)敏與非過(guò)敏患者調(diào)節(jié)型T細(xì)胞，培養(yǎng)基、 培養(yǎng)基添加塵螨過(guò)敏原、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白、塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白處理后共同培養(yǎng)。測(cè)定植 物性血液凝集素A刺激外圍血液?jiǎn)魏饲蚣?xì)胞的細(xì)胞激素分泌，比較每一試驗(yàn)組別培養(yǎng)基上 層液四種細(xì)胞激素(11^-2，仏-5，11^-10與0^-^)的濃度。簡(jiǎn)述此流程，每一個(gè)測(cè)試物與細(xì) 胞激素05 μ 1)加入96孔盤中連結(jié)抗體的小珠(25 μ 1)。培養(yǎng)一小時(shí)之后，清洗孔盤，加入 50 μ 1聚合生物素2級(jí)抗體溶液，再繼續(xù)培養(yǎng)一小時(shí)?？妆P清洗后加入50 μ 1蛋白質(zhì)抗原的 聚合物質(zhì)(抗生物素蛋白鏈菌素綴合的抗生物素蛋白鏈菌素(Mr印tavidin-conjugatedp hycoerythrin))，接著再繼續(xù)培養(yǎng)一小時(shí)。最終清洗后，每一孔盤使用測(cè)試緩沖液使內(nèi)容物 懸浮，放于聚苯乙烯小管，再用FACScan細(xì)胞流變儀讀取數(shù)據(jù)。該細(xì)胞流變儀配備雷射檢測(cè) 488nm波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)575和685nm。細(xì)胞激素濃度的計(jì)算，以細(xì)胞激素標(biāo)準(zhǔn)品做成標(biāo)準(zhǔn)曲 線后比較，計(jì)算其濃度。塵螨過(guò)敏原加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白或不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨 肽片段加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白刺激后，測(cè)定細(xì)胞激素，結(jié)果顯示，四種細(xì)胞激素(IL-2，IL-5， IL-10與IFN-γ)濃度沒(méi)有顯著差異。同時(shí)在過(guò)敏患者或非過(guò)敏患者亦無(wú)顯著差異(如圖 五所示)O以上所述僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例，不能以此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍。凡依本發(fā)明 要求保護(hù)的技術(shù)方案所做的均等變化與修飾，均應(yīng)屬本發(fā)明專利涵蓋的范圍之內(nèi)。<110>行政院國(guó)軍退除役官兵輔導(dǎo)委員會(huì)臺(tái)中榮民總醫(yī)院<120>免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法及其用途<130>TI09-1655-XC49<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>63<212>PRT<213>人工序列<220><223>塵螨肽片段<400>1Asp Gln Val Asp Val15Met Val Asp Gly Cys20Lys pro Phe Thr Leu35Thr Ala Lys lie Glu50<210>2<211>115<212>PRT
9
Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu lie Lys Lys Val
1015
His Gly Ser Asp Pro Cys lie lie His Arg Gly
2530
Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
4045
lie Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu lie 5560
<213>人工序列
<220>
<223>真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白
<400>2
Met Ser Ala ThrSerLeuThr PheGlnLeuAlaTyrLeuValLys
151015
lie Asp Phe AspTyrThrPro AsnTrpGlyArgGlyThrProSer
202530
Tyr lie Asp AsnLeuThrPhe proLysValLeuThrAspLysLys
354045
Ser Tyr Arg ValValValAsn GlySerAspLeuGlyValGluSer
505560
Phe Ala Val ThrProSerGly GlyGlnThrlieAsnPheLeuGln
657075
Asn Lys Gly TyrGlyValAla AspThrLysThrlieGlnValPhe
859095
Val lie Pro AspThrGlyAsn SerGluGluTyrlielieAlaGlu
100105110
Lys Lys Thr
11權(quán)利要求
1.一種免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增脫氧核糖核酸的片段，通 過(guò)酶切割塵螨肽片段，切開(kāi)的重組塵螨肽片段不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)，再 連結(jié)至載體，轉(zhuǎn)化此結(jié)構(gòu)物進(jìn)入大腸桿菌；此塵螨肽片段的載體與真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白被轉(zhuǎn) 化進(jìn)入酵母菌內(nèi)，該重組物培養(yǎng)在培養(yǎng)基，培養(yǎng)后細(xì)胞離心，轉(zhuǎn)換至緩沖液，培養(yǎng)物于培養(yǎng) 后收獲，接著進(jìn)行部份純化沉淀的步驟，該沉淀物溶于磷酸緩沖液，將樣品去鹽化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)肽制備方法，其特征在于，該免疫調(diào)節(jié)肽制備方法 其中包括不與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段或以其它一種或一種以上塵 螨過(guò)敏來(lái)源，經(jīng)酶切除特定引起過(guò)敏的免疫球蛋白E連接的過(guò)敏原的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)肽制備方法，其特征在于，其中包括一種不會(huì)引起 過(guò)敏反應(yīng)的肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)肽制備方法，其特征在于，其中包含不與免疫球蛋 白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。
5.根據(jù)申請(qǐng)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)肽制備方法，其特征在于，其中包含不與免疫 球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段，該肽片段1-63個(gè)氨基酸序列識(shí)別編號(hào)1 DQVDVKDCAN NEIKKVMVDG CHGSDPCIIHRGKPFTLEAL FDANQNTKTA KIEIKASLDGLEIο
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)肽制備方法，其特征在于，其中包含真菌免疫調(diào)節(jié) 蛋白1-115個(gè)氨基酸序列識(shí)別編號(hào)2 MSATSLTFQL AYLVKKIDFDYTPNWGRGTPSSYIDNLTFP KVLTDKKYSYRVVVNGSDLGVESNFAVTPS GGQTINFLQYNKGYGVADTKTIQVFVVIPD TGNSEEYIIAEffKKTο
7.一種免疫調(diào)節(jié)肽的組成物的用途，其中包含不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段添加真 菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有調(diào)節(jié)型T細(xì)胞增生與分泌的效果，其在制備調(diào)節(jié)過(guò)敏患者免疫功能的 藥物方面的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫調(diào)節(jié)肽的組成物的用途，其特征在于，其中包含不與免 疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段添加不同來(lái)源真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，其在制備預(yù) 防過(guò)敏反應(yīng)的藥物方面的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫調(diào)節(jié)肽的組成物的用途，其特征在于，其在制備治療過(guò) 敏反應(yīng)的藥物方面的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫調(diào)節(jié)肽的組成物的用途，其特征在于，其在制備過(guò)敏患 者的一種過(guò)敏原專一性的免疫治療藥物方面的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫調(diào)節(jié)肽的組成物的用途，其特征在于，所述個(gè)體應(yīng)用用 途其中包含以皮下注射、服用、貼附皮膚或黏膜免疫調(diào)節(jié)肽或與真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白混合的方式，以達(dá)到免疫調(diào)節(jié)功能之方法。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫調(diào)節(jié)肽的組成物的用途，其特征在于，其中包含過(guò)敏性 來(lái)源的疾病，該疾病包含過(guò)敏性鼻炎、支氣管氣喘、過(guò)敏性支氣管炎或鼻竇炎。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫調(diào)節(jié)肽的組成物的用途，其特征在于，其用于制備醫(yī)藥 品、飲料、化妝品或食品或者作為添加于這些制品或原料物中的添加物中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫調(diào)節(jié)肽的組成物的用途，其特征在于，其在作為具有抗 發(fā)炎的免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法及其用途，此免疫調(diào)節(jié)肽為一種不會(huì)與免疫球蛋白E結(jié)合引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段，再添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的合成蛋白。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，培養(yǎng)基中含有不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白共同培養(yǎng)，過(guò)敏患者不僅CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞顯著的增加，而且抑制免疫反應(yīng)的功能也增加。培養(yǎng)基中含有不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)的塵螨肽片段添加真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白共同培養(yǎng)，過(guò)敏患者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞會(huì)分泌白細(xì)胞介素-10與β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的百分比也顯著增加。因此本發(fā)明具有調(diào)節(jié)型T細(xì)胞增生與分泌的效果，可調(diào)節(jié)過(guò)敏患者免疫功能，以此治療過(guò)敏。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102061306SQ200910224659
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者蔡肇基 申請(qǐng)人:臺(tái)中榮民總醫(yī)院