專利名稱：蛋白質(zhì)三聚體化模序及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)三聚體化模序，本發(fā)明還涉及該蛋白質(zhì)三聚體化模序在制
備或表達三聚體蛋白質(zhì)中的應用，屬于三聚體蛋白質(zhì)基因工程領域。
背景技術：
巻曲螺旋是一類由兩股或兩股以上右手a螺旋相互纏繞而形成的平行或反平行 的左手超螺旋結構的總稱。巻曲螺旋的特征是，螺旋每圈需要3.5個氨基酸殘基，每兩圈 形成一個循環(huán)，因此形成多個七肽單元的重復序列或稱作七重復序列(abcdefg)n。最常見 的天然巻曲螺旋一般由2-5個七重復序列組成(Vinson C， Myakishev M， Acharya A， et al.Classification of Human B_ZIPProteins Based on Dimerization Properties. Mol Cell Biol. 2002. 22(18) :6321-6335)。 七重復序列各個位置的氨基酸在形成和維持巻曲螺旋結構中發(fā)揮不同的作 用。其中a位和d位通常由疏水性氨基酸占據(jù)，通常為亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)或 異亮氨酸(Ile)。 a、 d位氨基酸構成巻曲螺旋的疏水核心，在維持巻曲螺旋方面起關 鍵作用，同時這些疏水性氨基酸側鏈的幾何結構對于形成二聚體、三聚體、四聚體或 其他寡聚體起決定性作用(Harbury PB， Zhang T， Kim PS， et al. A switch between two_， three—， and four—stranded coiled coils inGCN4 leucine zipper mutants. Science.1993.262(5138) : 1401-1407. Harbury PB， Kim PS， Alber T. Crystal structure of an isoleucine-zipper trimer. Nature. 1994. 371(6492) :80-83. Suzuki K，Hiroaki H， Kohda D， et al. An isoleucine zipperpeptide forms a native—like triple stranded coiled coil in solution. Protein Eng. 1998. 11 (11) :1051—1055.)。第二個七重復序列 的a位通常由極性氨基酸占據(jù)，常見的是天冬酰胺(Asn)、賴氨酸(Lys)或谷氨酰胺(Gin)。 除了 a、 d位以外，其他位置的氨基酸通常是極性氨基酸。其中，e、 g位通常為帶電氨基 酸，相鄰e、 g位形成螺旋間鹽橋(inter-helical salt bridge)，螺旋間鹽橋?qū)τ趲喦?旋的多聚化至關重要，常見氨基酸是谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)，常見的 e_g組合為Glu-Arg、 Glu-Lys、 Arg-Glu、 Lys-Glu (Vinson C， Myakishev M， Acharya A， et al. Classification of Human B_ZIP Proteins Based on Dimerization Properties. Mol Cell Biol. 2002.22 (18) :6321-6335. Krylov D， Mikhailenko I， Vinson C. A thermodynamic scale for leucinezipper stability and dimerization specificity : e and g interhelical interactions. EMB0 J. 1994. 13 (12) :2849—2861.)。
在異亮氨酸拉鏈(isoleucine zipper, IZ) IZm的設計中，e-b-f位以Lys-Glu-Lys 的組合形成螺旋內(nèi)鹽橋，這種鹽橋能夠提高巻曲螺旋的穩(wěn)定性。隨后對異亮氨酸拉鏈 GCN4-pl的晶體結構研究發(fā)現(xiàn)，其C末端的g、 c位的Glu、 Arg形成的鹽橋提高了模序的熱 穩(wěn)定性，而c-f-c位鹽橋的形成也能夠提高巻曲螺旋的穩(wěn)定性，因此，引入螺旋內(nèi)鹽橋是蛋 白質(zhì)寡聚化模序設計中的重要策略。 利用天然巻曲螺旋的寡聚化特性，將其與目的蛋白融合表達，已經(jīng)用于很多研究中。最常見的應用方向是以天然巻曲螺旋結構替換或部分替代目的蛋白原有的寡聚化區(qū) 域，從而改變蛋白質(zhì)的聚合形式、親和性或穩(wěn)定性。另外，特殊巻曲螺旋與目的蛋白融合后， 可以模擬目的蛋白的天然構象，使蛋白質(zhì)處于活性狀態(tài)，有利于蛋白質(zhì)結構和功能的研究。 尤其對于那些體外重組表達后很難維持天然構象的蛋白，巻曲螺旋融合表達是解決方案之 目前應用最多的模式化三股巻曲螺旋結構是GCN4亮氨酸拉鏈(leucinezipper， LZ)和異亮氨酸拉鏈(isoleucine zi卯er，IZ) 。GCN4是酵母細胞轉錄激活蛋白，其C末端序 列GCN4-pl(MetLysGlnLeuGluAspLysValGluGluLeuLeuSerLysAsnTyrHisLeuGluAsnGluValA laArgLeuLysLysLeuValGlyGluArg) (GenBank NP_010907)為a螺旋結構，通常以二聚體巻 曲螺旋形式存在。由于七重復序列的a位均為亮氨酸，也稱為亮氨酸拉鏈(LZ) (Landschulz 冊，Johnson PF，McKnight SL The leucinezipper :a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science. 1988 Jun 24 ;240(4860) :1759—1764.)。 IZ是LZ的一個衍生物，將LZ的a位亮氨酸殘基替換為異亮氨酸殘基，并在d位引入疏水 性氨基酸。這些修飾使得GCN4 LZ二聚體轉變?yōu)榫哂腥刍瘍A向的GCN4 IZ(MetLysGlnl 1 eGluAsoLysIleGluGluIleLeuSerLys TleTvrHisIleGluAsnGluIleAlaArglleLvsLvsLeu IleGlyGluVal)(Harbury PB， Zhang T， Kim PS， Alber T. A switchbetween two_， three-， and four—stranded coiled coils in GCN4 leucine zippermutants. Science. 1993 Nov 26 ;262(5138) :1401-1407)。這種修飾不僅改變了巻曲螺旋的聚合狀態(tài)，而且增加了巻曲 螺旋結構的穩(wěn)定性，為設計蛋白質(zhì)三聚化模序提供了理論指導。 2001年，國際知識產(chǎn)權組織(World Intellectual PropertyOrganization，WIP0) 公開了一種利用GCN4 IZ穩(wěn)定HIV-1三聚化包膜糖蛋白(envelope glycoprotein, Env) 的方法(WO/2001/019958)，其構建方法是刪除Env的跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)C末端七重 復序列(CHR)，保留胞外區(qū)N末端七重復序列(NHR)，并在其羧基末端引入GCN4 IZ序列， 作為Env蛋白的三聚化模序，融合后擴展了 Env NHR序列，從而穩(wěn)定三聚化Env蛋白的結 構。2002年，WIPO公開了一組以IZN17為代表的三聚化多肽(WO/2002/024735)，其構建 方法是向HIV-l Env NHR的氨基末端引入GCN4-pIQI序列(ArgMetLysGlnGluAspLysGluGl uIleLeuSerLysGlnTyrHisGluAsnGluIleAlaArgAsp)或其衍生物，擴展NHR序列，穩(wěn)定三聚 化多肽。其中GCN4-pIQI及其衍生物的序列源自GCN4 IZ，但進行了點突變或刪除等修飾。 2005年，WIP0公開了另一種穩(wěn)定三聚化多肽的方法(WO/2005/118886)，其核心思想是在 (WO/2002/024735)所描述的多肽IZN17的基礎上，向其C末端引入分子間二硫鍵，通過共價 鍵作用維持三聚化多肽的穩(wěn)定性。 上述三項專利申請均利用了GCN4 IZ的三聚化傾向從而穩(wěn)定三聚體蛋白或多肽， 但該模序具有一定的限制性。首先，GCN4蛋白天然以二聚體形式存在，經(jīng)過a、d位修飾后 雖然具有三聚化傾向，但其形成二聚體或其他寡聚體的趨勢仍然保留，因此降低了產(chǎn)物中 三聚體的比例及產(chǎn)品的純度。更重要的是，在穩(wěn)定三聚體蛋白或多肽的研究中，三聚體的形 成及其穩(wěn)定性的維持必須依賴于Env gp41自身三聚化序列N36和C34的聚合作用，在此過 程中，GCN4主要是通過延長NHR序列起到促進聚合和穩(wěn)定蛋白的作用，并非三聚化過程始 動因素。因此，GCN4模序只能應用于含有自身三聚化模序的蛋白或多肽的研究，當試圖研 究不攜帶自身三聚化模序的目的蛋白時，該序列不是完全令人滿意的。
2007年，WIP0公開了一種制備三聚體蛋白的方法(WO/2007/030803)，其構建策略 是以一個或多個病毒的部分跨膜蛋白作為三聚化模序，并將其引入外源性目的蛋白的羧基 末端，利用模序的三聚化傾向引導外源蛋白形成三聚體。此專利中所涉及的三聚化模序均 來自病毒跨膜蛋白，具有較強的三聚化能力，但是同樣具有局限性。上述的三聚化模序均屬 于病毒抗原，某些病毒如流感病毒包膜血凝素((hemagglutinin, HA)抗原，在人群中具有 較高的抗體滴度，因此利用這種三聚化模序制備的三聚體融合蛋白不能直接作為免疫原使 用，只能用于蛋白質(zhì)結構和功能的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有三聚體蛋白制備技術中所存在的三聚化
模序聚合能力弱、三聚體產(chǎn)物比例低、應用范圍窄等缺點，提供了一種高聚合力、可廣泛應 用的蛋白質(zhì)三聚化模序，采用該蛋白質(zhì)三聚化模序所制備的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中三聚體比例大， 純度高。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的 —種蛋白質(zhì)三聚體化模序(MTQ)，其氨基酸序列為SEQ ID NO :2所示；編碼SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID N0:1)、含有該核苷酸
序列的原核或真核表達載體以及含有原核或真核表達載體的宿主細胞也當然屬于本發(fā)明
的保護范疇之列。 本發(fā)明蛋白質(zhì)三聚化模序MTQ根據(jù)天然三聚體巻曲螺旋的序列特征而設計，序列 更加優(yōu)化。本發(fā)明在設計蛋白質(zhì)三聚化模序的過程中，充分考慮了各個氨基酸形成寡聚體 的傾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的氨基酸，提高了產(chǎn)品三聚化成分 純度。 本發(fā)明三聚化模序MTQ的氨基酸序列的核心是四個七重復序列GluIleAlaLysIl eLysGluGluGlnAlaLysIleLysGluLysIleAlaGluIleGluLysArglleAlaGluIleGluLys ;上述七 重復序列的七個氨基酸殘基依次用g-a-b-c-d-e-f表示，本發(fā)明中，將異亮氨酸(lie)引 入中a、 d位，形成巻曲螺旋的疏水核心，該穩(wěn)定的核心對于三聚體的形成有利；將谷氨酰 胺(Gin)引入第二個七重復序列的a位，利于巻曲螺旋的聚合數(shù)目和聚合方向，形成平行 巻曲螺旋結構，對三聚體的形成有利；g-c-f位Glu-Lys-Glu組合的目的是為了形成螺旋 內(nèi)鹽橋，提高三聚化模序的穩(wěn)定性。第4個七重復序列的g位精氨酸(Arg)在三聚體形成 中具有重要意義，因此選擇Arg占據(jù)該位置，提高模序的三聚化能力。N末端g位之前的 Ile-Lys-Glu，以及C末端f位之后Arg-Ile-Ala為"保護性氨基酸"，其作用是使內(nèi)部氨基 酸形成七重復序列的巻曲螺旋結構。模序N末端Ile-Lys-Glu上游的Gly-Gly-Ser-Gly-Gly 序列是模序與目的蛋白之間的連接序列(linker)，它的作用一方面保持三聚化模序與目的 蛋白的結構相對獨立，另一方面也可以作為N末端的"保護性氨基酸"，增加巻曲螺旋中螺 旋的成分，使螺旋結構更加穩(wěn)定。 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是將上述蛋白質(zhì)三聚體化模序應用于制備蛋 白質(zhì)三聚體； 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的
本發(fā)明蛋白質(zhì)三聚體化模序在制備蛋白質(zhì)三聚體中的應用，包括
(1)將本發(fā)明蛋白質(zhì)三聚體化模序基因序列與目的蛋白基因相連接，得到融合基 因；二者的連接次序是該蛋白質(zhì)三聚體化模序基因所編碼的蛋白質(zhì)的氨基末端與目的基 因所編碼的蛋白的羧基末端相連接； (2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核或真核表達載體，構建得到融合蛋 白原核或真核表達載體； (3)將所構建的原核或真核表達載體在體內(nèi)或體外表達融合蛋白，即得；
本發(fā)明蛋白質(zhì)三聚化模序(MTQ)可廣泛用于天然構象為三聚體的蛋白質(zhì)的結構 和功能研究?？捎糜隗w外表達天然以三聚體形式存在的蛋白質(zhì)，進而用于篩選和三聚體形 式目的蛋白相互作用的配體分子。 本發(fā)明蛋白質(zhì)三聚化模序(MTQ)可用于構建和表達天然以三聚體形式存在的病 毒表面抗原，產(chǎn)物可作為DNA免疫原，用于體內(nèi)表達，構建候選基因疫苗；表達產(chǎn)物可作為 蛋白免疫原，構建候選亞單位疫苗，有潛在的遠期社會和經(jīng)濟效益。本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì) 三聚化模序MTQ可用于天然以三聚體形式存在的病毒表面蛋白的表達，表達產(chǎn)物可用于診 斷試劑的開發(fā)并應用于病毒性疾病的診斷，將產(chǎn)生較大的經(jīng)濟效益。


圖l是三聚化模序MTQ引入目的蛋白羧基末端的模式圖。將三聚化模序MTQ引入
目的蛋白的羧基末端而獲得的融合蛋白。 圖2是將融合蛋白基因引入表達載體的模式圖。 圖3是三聚化融合蛋白在293T細胞中瞬時表達及鑒定的結果圖。用融合蛋白 (HA1-MTQ)表達載體瞬時轉染293T細胞后收獲培養(yǎng)上清液。第一泳道是用變性SDS-PAGE 檢測到的變性后的目的蛋白；第二泳道是用非還原PAGE檢測到的目的蛋白天然三聚化形 式；第三泳道是陰性對照。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
實施例1 本實施例中的蛋白質(zhì)三聚化模序MTQ氨基酸序列為Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys_Glu_Glu_Ile_Ala_Lys_Ile_Lys_Glu_Glu_Gln_Ala_Lys_Ile_Lys_Glu_Lys_Ile_Ala_G lu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO :2)。 —、流感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin, HA)HA1亞基與MTQ的融合重組體 HA 1-MTQ的構建 1.獲取HA1基因首先提取流感病毒A/Hong Kong/8/68 (購自美國ATCC)總RNA， 以獲得的總RNA為模板，進行RT反應產(chǎn)生cDNA ;再以cDNA為模板，利用引物HAIUP(TAC AGGATCCGCCATGAAGACTATCATTGCT)和HA1D0WN(TCTAGCTAGCAGTTTGTTTCTCTGGTACATTTCGC)PCR擴增HA1基因，反應條件為98°C 15s，60°C 10s，72°C 2min，共30個循環(huán)，DNA聚合酶為 PrimeStarHS DNA Polymerase (購自日本TaKaRa)。 2. HA1-MTQ融合重組體的構建將編碼MTQ蛋白的基因(GGGGGTTCTGGCGGAATCAAG
AATCGAAAAGAGAATTGCTGGTGGATGTTGC) (SEQ ID NO :1)合成于載體pcDNA3. 1 (+)(購自美國 Invitrogen)的多克隆位點EcoR I、Xho I之間獲得載體pcMTQ，再將純化后的HA1基因克隆 至含有MTQ基因的pcMTQ載體上，其中，HA1基因C末端與MTQ基因N末端相連，并位于同一 讀碼框內(nèi)，獲得HA1-MTQ融合蛋白表達載體；將純化后的HAl基因克隆至載體pcDNA3. 1(+) (購自美國Invotrogen)上獲得不含MTQ基因的單純HA1表達載體。
二融合蛋白的表達 1.真核細胞轉染實驗將人胚腎293T細胞(購自美國ATCC)以5X 105個/孔的 密度鋪于6孔板內(nèi)，置于37°C、5% C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細胞生長面積為孔板底面 積的85% -90%時，將4 g HA1-MTQ融合蛋白表達載體轉染至293T細胞內(nèi)，所用的轉染試 劑為Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen)，轉染操作參考試劑說明書。
2.表達產(chǎn)物的收獲轉染后72h，將293T細胞培養(yǎng)上清轉移至2. Oml離心管內(nèi)， 3000 X g離心5min，棄去細胞碎片，將離心上清分裝于0. 5ml離心管中，于-4(TC保存。
三、利用特異性抗體通過western blotting方法檢測產(chǎn)物中的HA1重組蛋白
1.聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳向125iU收獲的細胞上清中加入25iU 6X loading buffer (0.35M Tris-HCl p朋.8， 30 %甘油，10 % SDS， 0. 012 %溴酚藍，6 % P-巰基乙醇)或6Xnon-reduced loading buffer (0. 35MTris_HCl pH6. 8， 30%甘油，10% SDS，O. 012%溴酚藍)，充分混勻，IO(TC煮沸2min，4。C 8000Xg，離心10min，蛋白樣品加載 至8% SDS-PAGE凝膠中，160V電泳lh。 2. Western blotting :電泳結束后，將蛋白質(zhì)轉印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉于 37t:封閉2h。封閉后的PVDF膜與兔抗HA單克隆抗體(1 : 1000，購自美國CST)于4t:過 夜孵育，再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG于37t:孵育lh。加入過氧化物酶 底物，顯示蛋白條帶。 試驗結果見圖3.從試驗結果可見，本發(fā)明所表達的融合蛋白產(chǎn)物三聚體比例大， 純度高。 序列表 〈110〉哈爾濱醫(yī)科大學 〈120〉蛋白質(zhì)三聚體化模序及其應用 〈130>KLPI08098 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211>129
〈212>DNA 〈213>artifical sequences
〈220〉
〈221>CDS <222>(1). (129) 〈223〉 〈400〉 1 gggggttctg gcgg朋tc朋ggemgagatt gcca肪atte 3ggagg肌ca 50 3gct朋朋te 3肌g3g朋g3 tegctga朋t cg3g朋朋ga attgcag朋3 100 tcgaaaagag aattgctggt ggatgttgc 129 〈210>2 〈211>43 <212>PRT 〈213>artifical sequences 〈400>2 Gly Gly Ser Gly Gly lie Lys Glu Glu lie Ala Lys lie Lys Glu Glu 15 10 15 Gin Ala Lys lie Lys Glu Lys lie Ala Glu lie Glu Lys Arg lie Ala
20 25 30 Glu lie Glu Lys Arg lie Ala Gly Gly Cys Cys
35 40
8
權利要求
一種蛋白質(zhì)三聚體化模序，其特征在于其氨基酸序列為SEQ IDNO2所示。
2. 編碼權利要求1所述蛋白質(zhì)三聚體化模序的核苷酸序列。
3. 按照權利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于其堿基序列為SEQID No :1所示。
4. 含有權利要求2或3所述核苷酸序列的表達載體。
5. 含有權利要求3所述表達載體的宿主細胞。
6. 權利要求1所述的蛋白質(zhì)三聚體化模序在制備或表達蛋白質(zhì)三聚體中的應用。
7. 權利要求2或3所述的核苷酸序列在制備或表達蛋白質(zhì)三聚體中的應用。
8. 按照權利要求7所述的的應用，包括(1) 將權利要求2或3所述的核苷酸序列與目的基因相連，得到融合基因；二者的連接 次序為權利要求2或3所述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基末端與目的基因所編碼的蛋 白的羧基末端相連接；(2) 將步驟(1)所得到的融合基因克隆至原核表達載體或真核表達載體，構建得到融 合蛋白原核表達載體或真核表達載體；(3) 將所構建的原核或真核表達載體在體內(nèi)或體外表達融合蛋白，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白質(zhì)三聚體化模序及其應用。該三聚體化模序的氨基酸序列為SEQ ID No2所示。本發(fā)明蛋白質(zhì)三聚化模序根據(jù)天然三聚體卷曲螺旋的序列特征而設計，序列更加優(yōu)化。在設計蛋白質(zhì)三聚化模序的過程中，充分考慮了各個氨基酸形成寡聚體的傾向，排除了那些可能具有二聚化、四聚化等寡聚能力的氨基酸，提高了產(chǎn)品三聚化成分純度。本發(fā)明蛋白質(zhì)三聚化模序可廣泛用于天然構象為三聚體的蛋白質(zhì)的結構和功能研究，可用于體外表達天然以三聚體形式存在的蛋白質(zhì)，進而用于篩選和三聚體形式目的蛋白相互作用的配體分子。本發(fā)明蛋白質(zhì)三聚化模序可用于構建和表達天然以三聚體形式存在的病毒表面抗原，構建候選基因疫苗或亞單位疫苗。
文檔編號C12N5/10GK101724027SQ20091022385
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月24日 優(yōu)先權日2009年11月24日
發(fā)明者凌虹, 周海舟, 李妍, 王甲業(yè), 鐘國才 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學