專利名稱：：重金屬污染甘蔗汁酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物能源
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體公開了一種重金屬污染甘蔗汁酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。
背景技術(shù)：
：酒精的生產(chǎn)方法可分為化學合成法和微生物發(fā)酵法兩種?；瘜W合成法是指利用石油或則天然氣的裂解氣、工礦企業(yè)的廢氣以及電石等原料，經(jīng)過化學反應(yīng)生成酒精的方法，包括乙烯水合法和乙醛加氫法等方法；微生物發(fā)酵法是指利用淀粉質(zhì)、糖質(zhì)或者纖維質(zhì)原料，通過微生物發(fā)酵作用生成酒精的方法，簡稱發(fā)酵法，普遍采用酵母菌作為發(fā)酵菌。微生物發(fā)酵法根據(jù)其原料的不同，生成的發(fā)酵酒精可分為淀粉質(zhì)原料酒精、糖質(zhì)原料酒精、纖維質(zhì)原料酒精、亞硫酸鹽紙漿廢液酒精等。糖質(zhì)原料酒精主要是利用糖蜜生產(chǎn)，糖蜜是甘蔗或甜菜糖廠制糖過程中的一種副產(chǎn)物，可分為甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。我國南方各省如廣東、廣西、福建、四川和臺灣等省都是利用甘蔗糖蜜生產(chǎn)酒精。利用甘蔗糖蜜直接生產(chǎn)酒精，其技術(shù)已經(jīng)是相當?shù)某墒?。但直接利用甘蔗汁生產(chǎn)酒精的技術(shù)報道很少，直接利用甘蔗汁生產(chǎn)酒精對菌種耐受酒精的要求很高，乙醇酵母的篩選有相當技術(shù)難度。同時，目前利用邊緣化土壤種植非良作物甘蔗并生產(chǎn)燃料乙醇，具有很高的現(xiàn)實意義和應(yīng)用前景，通過在礦區(qū)栽培甘蔗用于生產(chǎn)能源酒精是解決"能源與人爭糧"和"能源與人爭地"的好辦法。這種"能源甘蔗"受重金屬(包括銅、鋅、鎘、鉛等)污染，不能用來制糖，也就沒有產(chǎn)生糖蜜副產(chǎn)物這一過程，要求利用甘蔗汁直接生產(chǎn)乙醇。如前所述，在甘蔗汁尤其是受重金屬污染的甘蔗汁中直接生產(chǎn)乙醇，對菌種的耐受重金屬方面要求更加嚴格，所以，通過篩選獲得適于重金屬土壤能源甘蔗蔗汁發(fā)酵制備燃料乙醇的酵母菌種，是實現(xiàn)利用"能源甘蔗"汁直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇產(chǎn)生能源、提高產(chǎn)率關(guān)鍵。目前用甘蔗壓榨生產(chǎn)的蔗汁直接發(fā)酵制備燃料乙醇，已見相關(guān)報道；但在重金屬污染土壤種植的能源甘蔗有其特殊性——含有重金屬離子，利用這種甘蔗榨汁生產(chǎn)乙醇遇到了非常多的技術(shù)難題。直接影響了重金屬污染土地種植能源甘蔗的推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有利用甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)乙醇技術(shù)的不足，篩選得到適合于甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的酵母，并提供所述酵母在手重金屬污染甘蔗(能源甘蔗)汁發(fā)酵生產(chǎn)乙醇方面的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重金屬污染甘蔗汁酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)提供酵母菌S.serevisiae1384或S.serevisiae1347在利用受重金屬污染的能源甘蔗汁生產(chǎn)乙醇方面的應(yīng)用。所述的應(yīng)用更為優(yōu)選的是酵母菌為S.serevisiae1347。本發(fā)明同時提供了一種重金屬污染甘蔗汁酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，應(yīng)用酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347進行重金屬污染甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，所述發(fā)酵方法包括以下步驟(1)菌種的活化及擴大培養(yǎng)；(2)取無重金屬污染的甘蔗汁，往甘蔗汁中加入氮源，調(diào)節(jié)pH值至3.84.2得到種子液培養(yǎng)基，將步驟(1)活化的菌種接種于種子液培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)制備得到種子液；(3)向受重金屬污染的甘蔗汁(能源甘蔗汁)中加入氮源，調(diào)節(jié)pH值，滅菌處理得到發(fā)酵液；(4)將培養(yǎng)于種子液的菌種接入發(fā)酵液中；接種后的發(fā)酵液用保鮮膜封口，靜置發(fā)酵至成熟。上述步驟(1)菌種的活化是在超凈工作臺內(nèi)按1:20的比例將酵母S.serevisiae1347或S.serevisiae1384加到裝有無菌水的三角瓶中，然后在恒溫水浴鍋中35°C38t:復(fù)水活化30min60min，活化完成，待活化好的酵母液冷卻至3(TC左右，將其接入麥芽汁常規(guī)斜面培養(yǎng)基，在3(TC條件下擴大培養(yǎng)12天得到菌種；步驟(2)所述氮源優(yōu)選尿素，按照無重金屬污染的甘蔗汁的重量的0.08%0.10%加入尿素，用甘蔗汁重量的0.30.5X的磷酸將pH值調(diào)節(jié)至3.84.2得到種子液培養(yǎng)基。將活化后的菌種一環(huán)接種于種子液培養(yǎng)基，于283(TC搖床培養(yǎng)3648小時得種子液。步驟(3)所述氮源優(yōu)選尿素，按照受重金屬污染的甘蔗汁原液重量的O.1%0.5X加入尿素，用磷酸將pH值調(diào)至3.33.6，9(TC滅菌1小時得到發(fā)酵液；按照接種量為10%將培養(yǎng)于種子液的菌種接入發(fā)酵液中；接種后的發(fā)酵液用保鮮膜封口，于3032t:靜置發(fā)酵40小時以上，搖動沒有C02產(chǎn)生即成熟。能源甘蔗總氮含量較低，發(fā)酵前添加氮源，不需要添加玉米漿。添加氮源后充分攪拌使其溶解，可以選擇檸檬酸銨、硫酸銨等作為氮源，本發(fā)明優(yōu)選的氮源是尿素。本發(fā)明通過大量的實驗總結(jié)得到，采用本發(fā)明方法的適當酸度環(huán)境。適當?shù)乃岫拳h(huán)境可抑制其它雜菌的生長，有利于本發(fā)明選用酵母的生長繁殖，因此，在加入適量的氮源后，利用磷酸調(diào)節(jié)甘蔗汁的pH值至適宜數(shù)值。發(fā)酵指標測定方法(1)發(fā)酵液殘?zhí)堑臏y定過濾發(fā)酵液，加入HC1溶液水解，調(diào)節(jié)pH至中性。以DNS法測定殘?zhí)橇俊?2)發(fā)酵液乙醇含量測定將少量發(fā)酵液12000rpm、4t:冷凍離心5分鐘，吸取上清液，以氣相色譜測量酒精成分。通過殘?zhí)呛亢鸵掖己縼碛嬎憔N的糖轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵率。(3)菌體重金屬含量測定將發(fā)酵后的發(fā)酵液經(jīng)初步過濾后離心，將離心后得到的菌體用濃硝酸和高氯酸酸解后于原子吸收光譜測定重金屬含量。本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明通過篩選合適的酵母、甘蔗汁的預(yù)處理方法及發(fā)酵工藝中pH值、發(fā)酵時間、溫度等條件的精確、嚴格確定，得到完整的技術(shù)方案，篩選得到耐受重金屬的、高乙醇發(fā)酵性能的酵母菌實現(xiàn)受重金屬污染的甘蔗汁發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，從而使得通過在礦區(qū)栽培甘蔗用于生產(chǎn)能源酒精更為實際可行。(2)本發(fā)明技術(shù)穩(wěn)定周密，簡單易行；(3)本發(fā)明提供了酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347在以重金屬污染甘蔗汁為原料生產(chǎn)乙醇方面的新應(yīng)用，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)上述酵母耐受性好，乙醇產(chǎn)率高。圖1利用本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)乙醇路線示意圖具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步詳細說明本發(fā)明。實施例1酵母菌的篩選及發(fā)酵實驗(1)選擇常規(guī)的S.cerevisiae1827、S.cerevisiae1693、S.cerevisiae1425、S.cerevisiae1347、S.cerevisiae1384進行活化培養(yǎng)在超凈工作臺內(nèi)按l:20的比例將上述酵母分別加到裝有無菌水的三角瓶中，然后在恒溫水浴鍋中35t:復(fù)水活化60min，活化完成，待活化好的酵母液冷卻至3(TC左右，將其接入麥芽汁斜面培養(yǎng)基，在3(TC條件下培養(yǎng)2天得到菌種；(2)以無污染的甘蔗汁按甘蔗汁重量的0.08%加入尿素，按甘蔗汁重量的0.3%加入磷酸，調(diào)節(jié)PH值至3.8左右，得到種子液培養(yǎng)基，將活化后的菌種接種一環(huán)于種子液培養(yǎng)基，于28t:搖床培養(yǎng)48小時得種子液。(3)以含鋅、銅、鎘、鉛等重金屬含量較高的韶關(guān)大寶山為試點，取礦山污染區(qū)種植的粵糖94-128甘蔗榨汁，在甘蔗汁中加入0.1%的尿素，用磷酸把pH值調(diào)至3.6，9(TC滅菌l小時。將培養(yǎng)于種子液的所有菌種接入發(fā)酵液中，接種量為10%。將接種后的發(fā)酵液用保鮮膜封口，3032t:靜置發(fā)酵40小時以上，搖動沒有C02產(chǎn)生即成熟。(4)發(fā)酵結(jié)果測定方法1發(fā)酵液殘?zhí)堑臏y定過濾發(fā)酵液，加入HC1溶液水解，調(diào)節(jié)pH至中性。以DNS法測定殘?zhí)橇俊?發(fā)酵液乙醇含量測定將少量發(fā)酵液12000rpm、4t:冷凍離心5分鐘，吸取上清液，以氣相色譜測量酒精成分。通過殘?zhí)呛亢鸵掖己縼碛嬎憔N的糖轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵率。菌體重金屬含量測定將發(fā)酵后的發(fā)酵液經(jīng)初步過濾后離心，將離心后得到的菌體用濃硝酸和高氯酸酸解后于原子吸收光譜測定重金屬含量。采用上述方法測量各菌種發(fā)酵后的發(fā)酵液糖轉(zhuǎn)化率，菌體重金屬的含量，結(jié)果見表l:表1各菌種發(fā)酵后的發(fā)酵液糖轉(zhuǎn)化率和菌體重金屬的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通過比較分析得到，S.cerevisiae1384和S.cerevisiae1347具有很好的乙醇發(fā)酵效率，更為優(yōu)良的的是S.cerevisiae1347。實施例3應(yīng)用S.cerevisiae1384生產(chǎn)乙醇的試點實驗如附圖1所示，酵母菌經(jīng)活化擴大培養(yǎng)后接種于能源甘蔗汁中進行發(fā)酵得到含酒精的發(fā)酵液，發(fā)酵液檢驗合格后經(jīng)過常規(guī)的蒸餾脫水(常規(guī)技術(shù)，圖中未標出)可得到燃料酒精成品。能源甘蔗汁的壓榨、過濾和澄清采用常規(guī)技術(shù)。具體操作步驟如下(1)菌種S.cerevisiae1384的活化方法同時實施例1或2;(2)取無重金屬污染的甘蔗汁，按照甘蔗汁重量的0.09X加入尿素，調(diào)節(jié)pH值至4，得到種子液培養(yǎng)基，將步驟(1)活化的菌種接種于一環(huán)于種子液培養(yǎng)基，于283(TC搖床培養(yǎng)38小時得種子液；(3)取含鋅、銅、鎘、鉛等重金屬含量較高礦山污染區(qū)種植的粵糖94-128甘蔗榨汁，其中含鋅5.24mg/L、銅1.08mg/L、鎘0.21mg/L、鉛2.05mg/L。在甘蔗汁中加入0.1%的尿素，用磷酸調(diào)節(jié)PH值至3.6，9(TC滅菌1小時得發(fā)酵液；(4)將培養(yǎng)于種子液的菌種S.cerevisiae1384接入發(fā)酵液中，接種量為種子液占發(fā)酵液的10%。將接種后的發(fā)酵液用保鮮膜封口，3032t:靜置發(fā)酵40小時以上，搖動沒有C02產(chǎn)生即成熟。發(fā)酵完畢后，測得發(fā)酵液中乙醇體積分數(shù)為8.9%。實施例4應(yīng)用S.cerevisiae1347生產(chǎn)乙醇的試點實驗(1)菌種S.cerevisiae1347的活化方法同時實施例1或2;(2)取無重金屬污染的甘蔗汁，按照甘蔗汁重量的0.08X加入尿素，調(diào)節(jié)pH值至3.8左右，得到種子液培養(yǎng)基，將步驟(1)活化的菌種接種于一環(huán)于種子液培養(yǎng)基，于283(TC搖床培養(yǎng)40小時得種子液；(3)取含鋅、銅、鎘、鉛等重金屬含量較高礦山污染區(qū)種植的粵糖94-128甘蔗榨汁，其中含鋅65.72mg/L、銅0.25mg/L、鎘0.12mg/L、鉛2.05mg/L，按照甘蔗汁重量的中0.2%往甘蔗汁中加入尿素，用磷酸把pH值調(diào)至3.6，9(TC滅菌1小時得發(fā)酵液；(4)將培養(yǎng)于種子液的菌種S.cerevisiae1347接入發(fā)酵液中，接種量為種子液占發(fā)酵液的10%。將接種后的發(fā)酵液用保鮮膜封口，3032t:靜置發(fā)酵40小時以上，搖動沒有C02產(chǎn)生即成熟。發(fā)酵完畢后，測得發(fā)酵液中乙醇體積分數(shù)為10.5%。權(quán)利要求酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347在重金屬污染甘蔗汁酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇方面的應(yīng)用。2.酵母S.serevisiae1347在重金屬污染甘蔗汁酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇方面的應(yīng)用。3.—種重金屬污染甘蔗汁酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于包括以下步驟(1)酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347菌種的活化及擴大培養(yǎng)；(2)取無重金屬污染的甘蔗汁，往甘蔗汁中加入氮源，調(diào)節(jié)pH值至3.84.2得到種子液培養(yǎng)基，將步驟(1)活化的菌種接種于種子液培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)制備得到種子液；(3)向受重金屬污染的甘蔗汁中加入氮源，調(diào)節(jié)pH值，滅菌處理得到發(fā)酵液；(4)將培養(yǎng)于種子液的菌種接入發(fā)酵液中；接種后的發(fā)酵液用保鮮膜封口，靜置發(fā)酵至成熟。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)所述氮源為尿素，按照無重金屬污染的甘蔗汁的重量的0.08%0.10%加入；用甘蔗汁重量的0.30.5%的磷酸將pH值調(diào)節(jié)至3.84.2。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)所述搖床培養(yǎng)是于283(TC培養(yǎng)3648小時。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(3)所述氮源為尿素，按照受重金屬污染的甘蔗汁原液重量的0.1%0.5%加入。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(3)所述pH值調(diào)至3.33.6;所述滅菌處理是在9(TC滅菌1小時。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(4)所述接種量為10%。9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(4)靜置發(fā)酵是于3032t:靜置發(fā)酵40小時以上。全文摘要本發(fā)明公開了重金屬污染甘蔗汁酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。本發(fā)明具體提供了酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347在利用受重金屬污染的甘蔗汁發(fā)酵制備乙醇方面的應(yīng)用，并提供了利用受重金屬污染的甘蔗汁生產(chǎn)乙醇的方法。本發(fā)明實現(xiàn)了利用能源甘蔗汁直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，從而使得通過在礦區(qū)栽培甘蔗用于生產(chǎn)能源酒精更為實際可行。文檔編號C12P7/08GK101698857SQ20091019369公開日2010年4月28日申請日期2009年11月6日優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日發(fā)明者馮蕾,徐寧,徐曉立,朱睿,羅思施,謝君,陳國濤,陳曉陽申請人:華南農(nóng)業(yè)大學