專利名稱：鑒定金錢白花蛇的pcr方法及其特異引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥及中藥材鑒定技術領域，特別涉及一種能夠特異鑒定金錢白花蛇的PCR 方法及其特異引物。主要用于金錢白花蛇藥材、含有金錢白花蛇的制劑以及金錢白花蛇活體 材料的快速鑒定。
背景技術：
金錢白花蛇為《中國藥典》2005年版一部收載的一種常用中藥，來源于眼鏡蛇科動物 金錢白花蛇S朋gor船m"加'c/""附Blyth的干燥體(中國藥典.一部.2005.15)。有祛風、通絡、 止痙之功效。用于風濕頑痹，麻木拘攣，半身不遂，抽搐痙攣，瘰癘惡瘡。
金錢白花蛇作為動物藥材臨床功效確切，但商品來源復雜、藥材形態(tài)鑒別困難。經(jīng)濟利 益的驅使，市場充假現(xiàn)象極為嚴重，要求鑒別者具備豐富的鑒別經(jīng)驗，而且僅根據(jù)形態(tài)特征 很難進行準確地鑒別。王義權等使用PCR高特異性鑒別引物己鑒定出金錢白花蛇的真?zhèn)?王 義權，周開亞，徐珞珊，等.金錢白花蛇及其偽品的Cyt b基因片段序列分析和PCR鑒別研 究，藥學學報，1998， 33(12) : 941)，但所報道的混淆品數(shù)量少，有些通過形態(tài)特征即可排除， 且原有方法DNA提取時間長，操作較為繁瑣，不能滿足混偽品快速鑒定的要求。隨著分子 生物學試劑和PCR技術的不斷進步，在數(shù)小時內(nèi)快速鑒定金錢白花蛇已成為可能，越來越受 到關注。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的PCR引物及 方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種金錢白花蛇的PCR引物及其鑒定方法，該PCR鑒定方法操作簡單、 樣品量少、能快速準確的鑒定金錢白花蛇藥材、粉末制劑以及活體材料，特別適用于鑒定因 加工而導致DNA含量極少、形態(tài)破碎的中藥真?zhèn)蔚蔫b定。
一種鑒定金錢白花蛇的特異引物F1、 F2，其序列為
Fl: 5' -GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT國3， F2: 5' -GGAATCTTATCGATATCTGATTAGTA-3'
一種金錢白花蛇的PCR鑒定方法，包括下列步驟
a) 從所述材料中提取得到DNA樣品；
b) 用F1、 F2為引物進行PCR擴增，PCR反應參數(shù)為95。C預變性5min后，進行30次 循環(huán)(95°C 30s ， 55-65°C 45s )，后延伸72°C 5min,獲得擴增產(chǎn)物；
c) 電泳所述擴增產(chǎn)物，如果存在分子量565bp的單一條帶，則確定所檢材料為金錢白花
3蛇。
本發(fā)明釆用試劑盒提取DNA的方法，不需配制任何試劑，使得提取時間大大縮短，樣 品量只需0.1g，可以為蛇體的任何部分。同時采用兩步法PCR，使得PCR過程只需1.5h即 可完成，整個鑒別過程只需3h。綜上所述，本發(fā)明提供了快速準確鑒定金錢白花蛇的PCR 引物及方法，以金錢白花蛇DNA為模板，能將金錢白花蛇從與其親緣關系極近的其他的蛇 類中，高效、準確地鑒定出來，為金錢白花蛇鑒定提供了一種實用的技術。


圖1為金錢白花蛇藥材及其混淆品PCR鑒別結果
1.陽性對照2.金錢白花蛇3.虎斑頸槽蛇4.三索錦蛇5.雙全白花蛇6.灰鼠蛇7.滑鼠蛇8.紅點 錦蛇9.王錦蛇IO.赤鏈華游蛇ll.中國水蛇12.短吻蝮蛇13.百花錦蛇14.眼鏡蛇15.赤練蛇 16.鉛色水蛇17.金環(huán)蛇18.山烙鐵頭蛇19.黑眉錦蛇20.環(huán)紋華游蛇21.烏梢蛇22,.蘄蛇23.陰 性對照24.空白M.DNA分子量標準從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 畫p
圖2為13個不同批次的金錢白花蛇藥材PCR鑒別結果
l.陽性對照2-14金錢白花蛇(順序見表l) 15.陰性對照16.空白M.DNA分子量標準從上 至下依次為2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp具體實施方式
1材料
金錢白花蛇樣品來自河北安國地區(qū)、北京同仁堂藥店、北京金象大藥房、北京陽光同仁 大藥房、北京京隆堂藥店等，詳見表l。樣品均經(jīng)中國藥品生物制品檢定所中藥室標本館張 繼館長鑒定。.
表1樣品來源表編號 樣品名稱來源
1 金錢白花蛇5wwganw m"/ft'cz'"c^MS河北安國
2 金錢白花蛇及附w/ft'dwcrtw北京同仁堂
■3 金錢白花蛇5. /ww加.c化cftis北京金象大藥房
4 金錢白花蛇wwWc!力chw北京陽光同仁大藥房
5 金錢白花蛇8.附w/fZc!'"crtu北京京隆堂藥店
6 金錢白花蛇及附w/ft'dwc加5北京中醫(yī)醫(yī)院
7 金錢白花蛇5.附w/"c!'wc^s保興大藥房
8 金錢白花蛇及ww/ft'c/""ws利君堂藥店
9 金錢白花蛇及ww/rtc!'"cftw東單中醫(yī)門診部
10 金錢白花蛇5.附WWC!力"M5凱而康大藥房
11金錢白花蛇5.附w/ricz'"cftis永安堂
12 金錢白花蛇及附w/ft'c/wcrtw善和康大藥房
13金錢白花蛇5. /nw/f/dHcrttf全新大藥房
414虎斑頸槽蛇"'gr/薩河北安國
15三索錦蛇￡7—e rac /ata中國藥品生物制品檢定所
16雙全fi花蛇如c/a加河北安國
17灰鼠蛇尸/^yw fewcw (Schlegel)河北安國
18滑鼠蛇^卿casMJ Zi朋wws中國藥品生物制品檢定所
19紅點錦蛇rajWorsato (Cantor)中國藥品生物制品檢定所
20王錦蛇 ￡. ca"."ato (GUenther)中國藥品生物制品檢定所
21赤鏈華游蛇&'"o"afrz'x aw2w/< ls (Hallowell)江西樟樹
22中國水蛇五.cW朋"s^河北安國
23短吻蝮蛇」gHsfroc/cw /w/少5 (Pallas)河北安國
24百花錦蛇woe〃e油W (Boettger)河北安國
25目艮鏡蛇"q/'a Linnaeus中國藥品生物制品檢定所
26赤^^蛇Z^'"06fo" rw/ozo"a似附(Cantor)江西樟樹
27鉛色水蛇五咖fiHs /7w"&eci (Boie)河北安國
28金環(huán)蛇￡w"gan 加c!.ate (Schneider)河北安國
29山烙鐵頭蛇Z/ifloe 7m'(3 mawg^awemz's河北安國
30黑眉錦蛇河北安國
31環(huán)紋華游蛇S. a，腳"'ato江西昌北
32蘄蛇爿.acwto GUenther浙江
33烏梢蛇 Za。， (i/z鵬"a血(Cantor)江西樟樹
2特異引物設計
搜索GENBANK中金錢白花蛇及其常見混淆品金環(huán)蛇、赤練蛇等20余種蛇的細胞色素b (c盧b)序列，用DNAMAN進行同源比對，根據(jù)其變異區(qū)設計一對特異引物F1、 F2 ，序列 如下
F1: 5 ， -GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT-3' F2: 5'-GGAATCTTATCGATATCTGATTAGTA-3' 3 DNA提取
采用Promega公司DNA提取試劑盒Wizard SV Genomic DNAPurification System提取各 種材料的DNA。
① 取供試品適量(約0.5g)，去除表面污染物，液氮中充分研磨使成粉末，取適量(約 O.lg)至1.5mL離心管中；
② 加入275(iL消化液，比例如下
Nuclei lysis Solution 200pL 0.5M EDTA 50pL Proteinase K (20mg/mL) 20pL
RNaseA Solution_5uL
總體積 275nL
③放置55。C水浴中溫育0.5~lh;④取出后加入250nL Wizard SV Lysis Buffer,混勻后將溶液全部轉移入過濾柱中，10
OOOrpm離心3min; 棄掉過濾液，加入800pL洗脫液，10 000rpm離心lmin;
⑥ 棄掉過濾液，反復清洗3次，每次10 OOOipm離心lmin;
⑦ 棄掉最后一次過濾液后再離心2min，將過濾柱轉移入新的離心管中，加入100pL無
菌雙蒸水，室溫放置2min后10 000rpm離心2min。濾液-20'C保存?zhèn)溆谩?4 PCR擴增
PCR反應在200pLPCR反應管中進行，反應總體積25^L，包括以下試劑
IOXPCR緩沖液 2.5nL
■P (2.5mM) 2pL
引物(10nM) 0.5piL
Taq DNA聚合酶(Takara公司，ExTaq 5U' nL.') 0.2|iL
模板(約100ng) 0.5pL
無菌雙蒸水 19.3nL
總體積 25nL
PCR鑒別極易出現(xiàn)假陽性和假陰性結果，為防止誤差的產(chǎn)生，PCR鑒別須建立嚴格的陽 性、陰性及空白對照。陽性對照為經(jīng)過中國藥品生物制品檢定所提供的正品金錢白花蛇，陰 性對照為目前市場上充偽最嚴重的赤練蛇，空白對照為無菌雙蒸水。按樣品同樣的方法進行 DNA提取和PCR擴增。
PCR反應液配制完后，以4000r/min離心10s，將PCR管插入PCR儀中，進行如下反應 95。C5min;進行30次擴增反應循環(huán)(95°C3 0s， 55-65°C45s),然后7 2 。C5min。
取8pL擴增產(chǎn)物，采用1.5%的瓊脂糖凝膠，在電壓70-100V下電泳20分鐘后在凝膠成 像系統(tǒng)下觀察并拍照。金錢白花蛇及其20個相關混淆品的電泳如圖1， 13批金錢白花蛇的電 泳如圖2。結果可見，金錢白花蛇能擴增565bp的單一條帶，而混淆品沒有擴增條帶，表明 該體系能將金錢白花蛇與其混淆品準確的分開，不同來源的金錢白花蛇樣品能實現(xiàn)準確的鑒 別。SEQUENCE LISTING
<110>中國中醫(yī)科學院中藥研究所
<120>鑒定金錢白花蛇的PCR方法及其特異引物
<130> -
<160> 2
<170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213>人工合成 <400> 1
gaaatttcgg ctctatgctt ataacctgtc ttt 33
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 2
ggaatcttat cgatatctga ttagta 2權利要求
1、一種鑒定金錢白花蛇的特異引物F1、F2，其序列為F15’-GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT-3’F25’-GGAATCTTATCGATATCTGATTAGTA-3’
2、 一種金錢白花蛇的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟a) 從所述材料中提取得到DNA樣品；b) 用權利要求1所述的引物進行PCR反應，PCR反應參數(shù)為95。C預變性5min后，進 行30次循環(huán)(95。C30s， 55-65°C45s)，后延伸72°C 5min，獲得擴增產(chǎn)物；c) 電泳所述擴增產(chǎn)物，如果存在分子量565bp的單一DNA條帶，則確定所檢材料為金 錢白花蛇。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥及中藥材鑒定技術領域，特別涉及到一種能夠特異鑒定金錢白花蛇的PCR方法及其特異引物。使用此方法鑒別蘄蛇的真?zhèn)?，只通過簡單的DNA提取、PCR特異性擴增、電泳檢測即可完成對樣品真?zhèn)蔚蔫b別。具有操作簡單、特異性強、重復性好等優(yōu)點。主要用于金錢白花蛇藥材、含有金錢白花蛇的制劑以及金錢白花蛇活體材料的快速鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK101613759SQ200910148598
公開日2009年12月30日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權日2009年6月30日
發(fā)明者唐曉晶, 崔光紅, 趙靜雪, 黃璐琦 申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所