專利名稱：：利用甲烷氧化細(xì)菌生產(chǎn)甲烷氧化菌素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用曱烷氧化細(xì)菌生產(chǎn)曱烷氧化菌素的制備方法。
背景技術(shù)：
：超氧化物歧化酶(SOD)可通過(guò)清除超氧化物自由基而達(dá)到抗氧化效果，目前已允許SOD作為食品添加劑使用，然而，SOD是一種蛋白質(zhì)酶，所以在溶液中很不穩(wěn)定，在受到外界各種物理化學(xué)因素的影響時(shí)，也會(huì)像其它酶蛋白分子那樣發(fā)生亞基的解聚、變性或其它方面的構(gòu)象變化。伴隨著結(jié)構(gòu)的改變必然導(dǎo)致酶活性的下降或喪失。另外，由于動(dòng)植物中S0D含量低，提取量非常小，因此作為食品添加劑價(jià)格過(guò)于昂貴。而釆用化學(xué)合成法生產(chǎn)的S0D模擬酶雖然產(chǎn)量可能會(huì)提高，但往往活性小、非天然、可能還具有毒性等，相比較而言，由于微生物生長(zhǎng)快、培養(yǎng)容易，容易工業(yè)化，因此利用微生物生產(chǎn)具有超氧化物歧化酶活性的天然抗氧化劑的技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。曱烷氧化菌素是一種小分子熒光蛋白，來(lái)自于甲烷氧化細(xì)菌。與銅結(jié)合后的曱烷氧化菌素具有較強(qiáng)的超氧化物歧化酶活性，分子量小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是非常有潛力的天然食品抗氧化劑資源。曱烷氧化細(xì)菌能夠通過(guò)曱烷單加氧酶開(kāi)始的一個(gè)酶系將甲烷最終代謝成二氧化碳和水，并在此過(guò)程中獲得生長(zhǎng)所需的碳源和能源，甲烷氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)和曱烷單加氧酶的合成受到銅的調(diào)節(jié)，銅在曱烷氧化細(xì)菌中扮演著重要的生物學(xué)角色。曱烷氧化細(xì)菌能夠分泌對(duì)銅具有強(qiáng)親和力的曱烷氧化菌素捕捉周圍環(huán)境中的銅，與銅結(jié)合的曱烷氧化菌素會(huì)被曱烷氧化細(xì)菌識(shí)別而重新回到細(xì)胞中從而起到富集銅的作用。當(dāng)培養(yǎng)基中銅濃度很低時(shí)，分泌的曱烷氧化菌素由于無(wú)法與銅結(jié)合而被細(xì)胞識(shí)別，在培養(yǎng)介質(zhì)中會(huì)有甲烷氧化菌素積累。但是低銅培養(yǎng)介質(zhì)中曱烷氧化細(xì)菌由于缺銅而生長(zhǎng)緩慢，甲垸氧化菌素產(chǎn)量低，導(dǎo)致發(fā)酵介質(zhì)中甲烷氧化菌素積累量低，不利于分離純化。當(dāng)培養(yǎng)基中銅濃度較高時(shí)，雖然甲烷氧化細(xì)菌生長(zhǎng)快，甲烷氧化菌素產(chǎn)量高，但分泌的甲烷氧化菌素與銅結(jié)合后會(huì)重新回到細(xì)胞中在內(nèi)膜系統(tǒng)中積累，發(fā)酵介質(zhì)中曱烷氧化菌素含量低，而結(jié)合于內(nèi)膜系統(tǒng)中的曱烷氧化菌素分離純化困難。這些已成為限制曱烷氧化菌素工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。因此，使甲烷氧化菌素在發(fā)酵介質(zhì)中大量分泌，以便采用簡(jiǎn)單的分離純化方法獲得甲烷氧化菌素對(duì)實(shí)現(xiàn)甲烷氧化菌素作為天然抗氧化劑和防腐劑應(yīng)用具有著重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種工藝較為簡(jiǎn)單、成本低廉、快速的利用曱烷氧化細(xì)菌生產(chǎn)甲烷氧化菌素的制備方法。本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的是是在常規(guī)培養(yǎng)曱烷氧化細(xì)菌的液體培養(yǎng)基中分階段添加CuS04，在發(fā)酵液中獲得曱烷氧化菌素。首先在液體培養(yǎng)基中添加5uMCuS04培養(yǎng)甲烷氧化細(xì)菌，待達(dá)到一定細(xì)胞密度后再采用低銅含量的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使甲烷氧化細(xì)菌在嚴(yán)格P艮銅的培養(yǎng)條件下向發(fā)酵液中大量分泌曱烷氧化菌素，其中，低銅培養(yǎng)液中CuS04含量范圍為0-0.05uM。采用嚴(yán)格限銅的培養(yǎng)條件分段培養(yǎng)甲烷氧化細(xì)菌，從發(fā)酵液中通過(guò)離心、DianionHP-20大孔樹(shù)脂吸附和冷凍干燥獲得曱烷氧化菌素。本發(fā)明目的是在銅濃度不同的培養(yǎng)基中對(duì)甲烷氧化細(xì)菌進(jìn)行分段發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵液中通過(guò)離心、DianionHP-20大孔樹(shù)脂和冷凍干燥獲得曱烷氧化菌素。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種甲烷氧化菌素的生產(chǎn)方法，包括以下2個(gè)方面1、先在較高銅含量培養(yǎng)基(添加5uMCuS04)中使曱烷氧化細(xì)菌快速生長(zhǎng)，待達(dá)到一定細(xì)胞密度后再將其放入低銅培養(yǎng)基(添加O-O.05uMCuS04)中使其大量分泌甲烷氧化菌素(mb)，甲烷氧化細(xì)菌在低銅條件下釋放的曱烷氧化菌素不能與銅結(jié)合，不結(jié)合銅的曱烷氧化菌素由于無(wú)法被細(xì)胞識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而在介質(zhì)中大量積累。2、從發(fā)酵液中通過(guò)離心、DianionHP-20大孔樹(shù)脂和冷凍干燥獲得曱烷氧化菌素(mb)。在用本發(fā)明的方法對(duì)甲烷氧化細(xì)菌進(jìn)行分段培養(yǎng)時(shí)，甲烷氧化細(xì)菌先在較高銅含量的培養(yǎng)條件下快速生長(zhǎng)，達(dá)到一定細(xì)胞密度，然后在低銅條件下大量釋放曱烷氧化菌素，釋放的甲烷氧化菌素不能與銅結(jié)合，無(wú)法被細(xì)胞識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而在介質(zhì)中積累，解決了甲烷氧化菌素產(chǎn)量低的問(wèn)題，而且從發(fā)酵液中分離純化甲烷氧化菌素的方法筒單，具有較高的工業(yè)化應(yīng)用可行性。與常規(guī)方法相比，本發(fā)明的方法可以極大程度地提高甲烷氧化菌素的產(chǎn)量，且簡(jiǎn)化了曱烷氧化菌素分離純化的程序，基于上述優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明將在曱烷氧化菌素的應(yīng)用(如作為天然抗氧化劑和防腐劑使用等)中發(fā)揮巨大作用，應(yīng)用前景廣闊。具體實(shí)施例方式是是在常規(guī)培養(yǎng)曱烷氧化細(xì)菌的液體培養(yǎng)基中分階段添加CuS04，在發(fā)酵液中獲得曱烷氧化菌素。首先在液體培養(yǎng)基中添加5uMCuS04培養(yǎng)曱烷氧化細(xì)菌，待達(dá)到一定細(xì)胞密度后再采用低銅含量的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使甲烷氧化細(xì)菌在嚴(yán)格限銅的培養(yǎng)條件下向發(fā)酵液中大量分泌甲烷氧化菌素，其中，低銅培養(yǎng)液中CuS04含量范圍為0-0.05uM。釆用嚴(yán)格限銅的培養(yǎng)^分段培養(yǎng)甲烷氧化細(xì)菌，>^發(fā)酵液中通過(guò)離心、DianionHP-20大孔樹(shù)脂吸附和冷凍干燥獲得甲烷氧化菌素。本發(fā)明目的是在銅濃度不同的培養(yǎng)基中對(duì)曱烷氧化細(xì)菌進(jìn)行分段發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵液中通過(guò)離心、DianionHP-20大孔樹(shù)脂和冷凍干燥獲得甲垸氧化菌素。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所有百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度，所有培養(yǎng)基中的溶劑均為去離子水。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分如下(g/L):K2HP04:1.06;NaH2P04-12H20:4.34;MgS04.7H20:0.074;CaCl2.2H20:7.0;K2S04:0.34;NaN03:1.7;FeS04.7H20:0.0224;MnS04-7H20:0.446;ZnS04.7H20:0.57;Na2Mo04.2H20:0.096;H3BO3:0.124;CoCl26H20:0.096;KI:0.166;pH7.0。(甲烷氧化細(xì)菌M"/c力os/or/"巡0B3b培養(yǎng)基)NH3C1:0.5;K2HP04:0.49;KH2P04.7H20:0.40;MgS047H20:0.3;CaCl2.2H20:0.02;KN03:1.6;NaCl:0.3;FeS04'71120:0.004;MnS04仏0:0.0004;ZnS04-7H20:0.00034;Na2Mo04.2H20:0.00024;pH7.0(甲烷氧化細(xì)菌"/c力o;y/7or/咖3011培^基)實(shí)施例1、本發(fā)明的甲烷氧化菌素的生產(chǎn)以曱烷氧化細(xì)菌^r/c力o^or/iM70B3b和^r/c力05"/7or/w/z3011為例，具體過(guò)禾呈如下曱烷氧化細(xì)菌在不同銅濃度下分段培養(yǎng)將曱烷氧化細(xì)菌M^r/cMs/oW咖0B3b或W"力yA"./7f/5"^r/c力o^7or/咖IMV3011以10%接鐘量接種在含有添加5uMCuS04的100毫升無(wú)菌液體培養(yǎng)基的500毫升密閉的三角瓶中，采用抽真空法將空氣置換為曱烷-氧氣(l:10,V/V)的混合氣，32攝氏度，300轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24小時(shí)取樣進(jìn)行細(xì)胞密度測(cè)定，當(dāng)培養(yǎng)液中OD600達(dá)到0.8-1.l時(shí)，以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心得到菌體，將其添加到CuS04濃度為0.OluM的低銅新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)培^液+OD600達(dá)到O.8-1.2時(shí)，如果培養(yǎng)介質(zhì)呈現(xiàn)黃色，則收獲細(xì)胞，否則繼續(xù)用低銅培養(yǎng)基替換，直至介質(zhì)中呈現(xiàn)黃色，即表明曱烷氧化菌素在發(fā)酵介質(zhì)中累積。細(xì)胞密度測(cè)定采用光密度法，在SP-756P型分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)600納米處的光密度值(0D600)。曱烷氧化菌素的定量測(cè)定采用DiaionHP-20大孔吸附樹(shù)脂層析后凍干稱重法。具體步驟如下將培養(yǎng)好的發(fā)酵液離心去除細(xì)胞，剩余介質(zhì)以13000xg二次離心20分鐘，上清液用DiaionHP-20大孔吸附樹(shù)脂層析，然后用體積比60%甲醇和40%水的溶液洗提DiaionHP-20，洗提液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到曱烷氧化菌素固體。由于曱烷氧化菌素與銅結(jié)合后會(huì)變成黃色，在394-422nm處有最大吸收，因此也可以在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)采用分光光度法進(jìn)行定量測(cè)定。實(shí)施例2、本發(fā)明的甲烷氧化細(xì)菌培養(yǎng)方法與曱烷氧化細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)方法在發(fā)酵介質(zhì)中獲得甲烷氧化菌素的比較甲烷氧化細(xì)菌"/c力ospoW咖0B3b和Ve^rA^/zzM"/c力owor/"邁IMV3011進(jìn)行本發(fā)明培養(yǎng)方法與曱烷氧化細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)方法在發(fā)酵介質(zhì)中獲得甲烷氧化菌素的比較，具體過(guò)程如下1.曱烷氧化細(xì)菌M"/'c力o^70,/wz/0B3b和Ve^j^oW/7"s"/c力^pw/咖IMV3011的常規(guī)培養(yǎng)，用常規(guī)方法對(duì)曱烷氧化細(xì)菌MWc力os/7oW咖0B3b和jffe/力y/o"'/ziAy"yc/ros/7or/"邁IMV3011進(jìn)行培養(yǎng),具體方法為將曱烷氧化細(xì)菌#e^r/o^//7^"/c力os/7oWwz7IMV3011以10%接鐘量接種在含有添加5uM或0.01uMCuS04的100毫升無(wú)菌液體培養(yǎng)基的500毫升密閉的三角瓶中，采用抽真空法將空氣置換為甲烷-氧氣(1:10，V/V)的混合氣，32攝氏度，300轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24小時(shí)取樣進(jìn)行細(xì)胞密度測(cè)定，并采用抽真空法置換入新鮮的曱烷-氧氣(l:10，V/V)的混合氣，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)72~96小時(shí)后中止培養(yǎng)。2.曱烷氧化細(xì)菌tr/cMy/w/咖做J6和yl/e^Aj70"'/7w"r/c力o577oW咖IMV3011的限銅分段培養(yǎng)5具體方法如實(shí)施例1采用限銅分段培養(yǎng)曱烷氧化細(xì)菌，其發(fā)酵介質(zhì)中的甲烷氧化菌素的產(chǎn)量高于以正常銅含量和低銅含量培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)的曱烷氧化菌素的產(chǎn)量，這主要是由于分段限銅培養(yǎng)方法首先保證了正常銅含量下曱烷氧化細(xì)菌的快速生長(zhǎng)，達(dá)到一定細(xì)胞密度后在低銅下分泌到介質(zhì)中的甲烷氧化菌素不能與銅結(jié)合被細(xì)胞識(shí)別而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而在介質(zhì)中大量累積。結(jié)果如表1所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種利用甲烷氧化細(xì)菌生產(chǎn)甲烷氧化菌素的制備方法，其特征在于是是在常規(guī)培養(yǎng)甲烷氧化細(xì)菌的液體培養(yǎng)基中分階段添加CuSO4，在發(fā)酵液中獲得甲烷氧化菌素。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用甲烷氧化細(xì)菌生產(chǎn)曱烷氧化菌素的制備方法，其特征在于首先在液體培養(yǎng)基中添加5uMCuS04培養(yǎng)曱烷氧化細(xì)菌，待達(dá)到一定細(xì)胞密度后再采用低銅含量的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使曱烷氧化細(xì)菌在嚴(yán)格限銅的培養(yǎng)條件下向發(fā)酵液中大量分泌曱烷氧化菌素，其中，低銅培養(yǎng)液中CuS04含量范圍為0-0.05uM。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種利用甲烷氧化細(xì)菌生產(chǎn)曱烷氧化菌素的制備方法，其特征在于采用嚴(yán)格P艮銅的培養(yǎng)M分段培養(yǎng)甲烷氧化細(xì)菌，從發(fā)酵液中通過(guò)離心、DianionHP-20大孔樹(shù)脂吸附和冷凍干燥獲得甲烷氧化菌素。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用甲烷氧化細(xì)菌生產(chǎn)甲烷氧化菌素的制備方法。其特點(diǎn)是是在嚴(yán)格限銅的培養(yǎng)基中對(duì)甲烷氧化細(xì)菌進(jìn)行分段發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵液中通過(guò)離心、DianionHP-20大孔樹(shù)脂吸附和冷凍干燥獲得甲烷氧化菌素。在用本發(fā)明的方法對(duì)甲烷氧化細(xì)菌進(jìn)行分段培養(yǎng)時(shí)，甲烷氧化細(xì)菌先在較高銅含量的培養(yǎng)條件下快速生長(zhǎng)，待達(dá)到一定細(xì)胞密度后，在低銅培養(yǎng)條件下大量釋放甲烷氧化菌素，釋放的甲烷氧化菌素不能與銅結(jié)合，無(wú)法被細(xì)胞識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而在發(fā)酵介質(zhì)中積累。從發(fā)酵介質(zhì)中獲得甲烷氧化菌素，解決了甲烷氧化菌素進(jìn)入細(xì)胞后結(jié)合于內(nèi)膜系統(tǒng)而分離純化困難的問(wèn)題。與常規(guī)生產(chǎn)方法相比，本發(fā)明的方法可以極大程度地提高甲烷氧化菌素的產(chǎn)量，且簡(jiǎn)化了甲烷氧化菌素分離純化的程序，基于上述優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明將在甲烷氧化菌素的應(yīng)用中發(fā)揮巨大作用。文檔編號(hào)C12N9/08GK101519654SQ20091007172公開(kāi)日2009年9月2日申請(qǐng)日期2009年4月3日優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日發(fā)明者艷王,靜董,辛嘉英申請(qǐng)人:哈爾濱商業(yè)大學(xué)