專利名稱：應(yīng)用酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵酸度生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的方法
應(yīng)用酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵酸度生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)乳酸鏈球菌素(Nisin)的方法，具體說是利用酵母和乳 酸乳球菌混菌發(fā)酵來達到控制發(fā)酵體系的pH值，避免使用堿液中和調(diào)節(jié)pH值生產(chǎn) 乳酸鏈球菌素的方法。
背景技術(shù)：
乳酸鏈球菌素是某些乳酸乳球菌乳酸亞種(Zac/ococc"s /flcto subsp丄actis)產(chǎn) 生的一種細菌素，首次發(fā)現(xiàn)于1928年。隨著食品天然化的發(fā)展趨勢，天然防腐劑 倍受青睞。目前，乳酸鏈球菌素作為一種天然的抗菌物質(zhì)，已被50多個國家和地 區(qū)批準使用于食品防腐并表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用在乳制品、肉制 品、罐頭制品、果汁和酒精飲料等多種食品中。隨著應(yīng)用研究的深入己經(jīng)擴展到 醫(yī)藥、造紙、活性食品包裝、農(nóng)業(yè)飼料等領(lǐng)域。
由于乳酸鏈球菌素的產(chǎn)生菌是乳酸菌，發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致pH降低， 抑制了菌體生長，同時抑制了乳酸鏈球菌素的合成，工業(yè)生產(chǎn)中需要向發(fā)酵液中 加入堿液或加入CaC03的方法來控制發(fā)酵液的pH值，但生成的乳酸鹽對乳酸菌的 生長也有抑制作用。而加入CaC03的辦法不利于后續(xù)的分離提取。所以如何消除 發(fā)酵液中的乳酸對乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸鏈球菌素來說至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題本發(fā)明設(shè)計了一種通過酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵過程中發(fā)酵液 的酸度，高效率生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的方法。該方法利用酵母和乳酸乳球菌的混菌培養(yǎng) 來控制發(fā)酵液pH值，克服了工業(yè)上用補加堿來控制發(fā)酵液的pH值，從而引起的乳酸鹽 對乳酸菌的生長抑制作用或加入CaC03的方法引起的分離提取困難的問題。
為實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明公開了一種應(yīng)用酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵酸度生產(chǎn) 乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于分別制備酵母和乳酸乳球菌種子液，兩種種子 液各按照體積百分數(shù)1-5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中混菌發(fā)酵，得到乳酸鏈球 菌素。
所述的酵母為釀酒酵母Sacc/2"rw^c^ cerev"ffle，是公認安全的菌株；所述乳 酸鏈球菌素產(chǎn)生菌為乳酸乳球菌乳酸亞種丄fl"ococc";y /ac"s subsp.lactis。
3在傳統(tǒng)的乳酸鏈球菌素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，由于乳酸鏈球菌素產(chǎn)生菌乳酸乳球 菌是同源乳酸產(chǎn)生菌，會將部分底物轉(zhuǎn)化為乳酸，從而導(dǎo)致發(fā)酵體系的pH值降低。 因此，在發(fā)酵過程中需要補給堿(如CaC03等)的方法來控制發(fā)酵體系的pH值， 此時生成的乳酸鹽對乳酸菌的生長也有抑制作用，并且加入CaC03后，不利于后 續(xù)乳酸鏈球菌素的分離純化。
本發(fā)明使用乳清粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基，同時，選擇一株不利用乳糖，但利用乳 酸的酵母，以便不與乳酸菌競爭利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳糖，而酵母利用乳酸菌在 發(fā)酵生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的乳酸為碳源，達到了不用外加堿方法來控制發(fā)酵體系pH的 目的，不僅促進了乳酸菌的生長，同時也達到了促進乳酸鏈球菌素產(chǎn)生的目的， 并且有利于環(huán)境。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，酵母與乳酸菌混菌發(fā)酵的有益之處在于酵母菌利用乳酸 菌產(chǎn)生的乳酸，解除了乳酸的積累對乳酸菌生長和對乳酸鏈球菌素生產(chǎn)造成的抑 制作用。發(fā)酵過程中兩株菌互利共生，達到高效率生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的效果。在 我們的實驗中產(chǎn)率提高2倍多。乳清培養(yǎng)基成本比原有發(fā)酵培養(yǎng)基成本降低20%。
以下結(jié)合本發(fā)明的實施例進行詳細敘述。
具體實施方式
本發(fā)明生產(chǎn)乳酸鏈球菌素方法可以是如下具體步驟
1) 種子液制備
酵母種子培養(yǎng)基采用YEPD培養(yǎng)基或麥芽汁培養(yǎng)基，乳酸乳球菌種子培養(yǎng)基 采用CM培養(yǎng)基或脫脂乳培養(yǎng)基，兩種種子培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后，將兩種菌種分別 接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期；
2) 混菌發(fā)酵-
按步驟l)制得的種子液按照比例同時接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行混菌發(fā)酵， 發(fā)酵時間18-28小時。
本發(fā)明生產(chǎn)乳酸鏈球菌素方法還可以是如下具體步驟
1)種子液制備
酵母種子培養(yǎng)基采用YEPD培養(yǎng)基或麥芽汁培養(yǎng)基，乳酸乳球菌種子培養(yǎng)基 采用CM培養(yǎng)基或脫脂乳培養(yǎng)基，兩種種子培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后，將兩種菌種分別 接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期；2)混菌發(fā)酵
按步驟l)制得的種子液按照比例先后接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，首先在發(fā)酵培養(yǎng)
基中接入酵母菌種子液，在其后〉0-5小時再接入乳酸乳球菌種子液，進行混菌發(fā) 酵，發(fā)酵時間18-28小時。
在所述制備方法中，所述YEPD培養(yǎng)基蛋白胨2%、酵母膏1%和葡萄糖2%， pH為6.0，在12rC滅菌20min制得。
所述麥芽汁培養(yǎng)基大麥芽加4倍水,在65'C糖化4小時，過濾后稀釋，自然 pH，在12rC滅菌20min制得。
所述CM培養(yǎng)基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2% 和MgSO4 0.02%， pH為6.8，在12rC滅菌20min制得。
所述脫脂乳培養(yǎng)基脫脂乳10%，自然pH，在115t:滅菌15min制得。
本發(fā)明提供用酵母和乳酸乳球菌混菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的方法，按照常 規(guī)方法制備酵母菌和乳酸菌種子液，按照一定比例接種混菌發(fā)酵。混菌發(fā)酵使用 的酵母可以利用乳酸乳球菌在發(fā)酵時產(chǎn)生的乳酸作為碳源，而又不利用發(fā)酵培養(yǎng) 基中的乳糖，既避開了與乳酸菌競爭碳源，還可以達到消除發(fā)酵液中乳酸的目的， 從而達到控制發(fā)酵液pH值的目的，兩菌互利共生，促進了乳酸鏈球菌素的生產(chǎn)。
實施例l、
1) 將酵母菌CICC 1.383在下述種子培養(yǎng)基中3(TC，培養(yǎng)8小時； 酵母培養(yǎng)基蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%， pH6.0， 12rC滅菌20min ;
2) 將乳酸菌TCCC 12001在下述種子培養(yǎng)基中3(TC，培養(yǎng)6小時；
乳酸菌培養(yǎng)基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2%、 MgSO4 0.02%， pH6.8， 121。C滅菌20min;
3) 制備下述發(fā)酵培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基6%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 110'C滅菌20min;
4) 混合菌種發(fā)酵首先取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的酵母菌的種子液，離心棄去上 清液，按照5%的接種量將菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后再接入3%的對數(shù)期乳酸菌 種子液繼續(xù)培養(yǎng)，混合菌種發(fā)酵到16小時結(jié)束。
實施例2、1) 將酵母菌CICC 1.346在下述種子培養(yǎng)基中3(TC，培養(yǎng)8小時； 酵母培養(yǎng)基蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%， pH6.0， 12rC滅菌20min 。
2) 將乳酸菌CGMCC 1.2829在下述種子培養(yǎng)基中30'C，培養(yǎng)6小時；
乳酸菌培養(yǎng)基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2%、 MgSO4 0.02%， pH6.8, 121 。C滅菌20min;
3) 制備下述發(fā)酵培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基6%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 110'C滅菌20min;
4) 混合菌種發(fā)酵首先取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的酵母菌的種子液，按照3%的 接種量將菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3小時，然后再接入3%的對數(shù)期乳酸菌種 子液繼續(xù)培養(yǎng)，混合菌種發(fā)酵到18小時結(jié)束。
實施例3、
1) 將酵母菌CGMCC2.407在下述種子培養(yǎng)基中30'C，培養(yǎng)10小時；
麥芽汁培養(yǎng)基大麥芽加4倍水。65。C糖化4小時，過濾后稀釋，自然pH， 121 r滅菌20min;
2) 將乳酸菌CGMCC 1.2030。在下述種子培養(yǎng)基中30。C ，培養(yǎng)5小時； 脫脂乳培養(yǎng)基脫脂乳10%，自然pH， 115'C滅菌15min;
3) 制備下述發(fā)酵培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基7%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 11(TC滅菌20min;
4) 混合菌種發(fā)酵首先取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的酵母菌的種子液，按照5%的 接種量將菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2小時，然后再接入3%的對數(shù)期乳酸菌種 子液繼續(xù)培養(yǎng)，混合菌種發(fā)酵到20小時結(jié)束。
實施例4、
1) 將酵母菌CGMCC2.407在下述種子培養(yǎng)基中3(TC,培養(yǎng)10小時； 酵母培養(yǎng)基蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%， pH6.0， 12rC滅菌20min ;
2) 將乳酸菌CGMCC 1.2829在下述種子培養(yǎng)基中30'C，培養(yǎng)6小時；
乳酸菌培養(yǎng)基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2%、 MgSO4 0.02%， pH6.8， 12rC滅菌20min;
63) 制備下述發(fā)酵培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基6%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 110'C滅菌20min;
4) 混合菌種發(fā)酵首先取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的酵母菌的種子液，按照3%的 接種量將菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后再接入2%的對數(shù)期乳酸菌種子液繼續(xù)培 養(yǎng)，混合菌種發(fā)酵到22小時結(jié)束。
實施例5、
1) 將酵母菌CICC 1.346在下述種子培養(yǎng)基中30'C，培養(yǎng)8小時； 酵母培養(yǎng)基蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%， pH6.0, 12rC滅菌20min ;
2) 將乳酸菌TCCC 12001在下述種子培養(yǎng)基中30'C，培養(yǎng)6小時；
乳酸菌培養(yǎng)基蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母粉1%、 K2HP041%、 NaC10.2%、 MgSO4 0.02%， pH6.8， 12rC滅菌20min;
3) 制備下述發(fā)酵培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基7%乳清粉+1%酵母膏。初始pH值6.5。 11(TC滅菌20min;
4) 混合菌種發(fā)酵首先取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的酵母菌的種子液，按照5%的 接種量將菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2小時，然后再接入4%的對數(shù)期乳酸菌種 子液繼續(xù)培養(yǎng)，混合菌種發(fā)酵到18小時結(jié)束。
權(quán)利要求
1、一種應(yīng)用酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵酸度生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于分別制備酵母和乳酸乳球菌種子液，兩種種子液各按照的體積百分數(shù)1-5％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中混菌發(fā)酵，得到乳酸鏈球菌素。
2、 根據(jù)政利要求l所述的應(yīng)用酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵酸度生產(chǎn)乳酸鏈球菌 素的方法，其特征在于所述酵母為釀酒酵母Sacc/wro/nyc"cerev/w》e;所述乳酸鏈 球菌素產(chǎn)生菌為乳酸乳球菌乳酸亞種丄a"ococc^ subsp.lactis。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵酸度生產(chǎn)乳酸鏈球菌 素的方法，其特征在于所述方法的具體步驟如下1) 種子液制備酵母種子培養(yǎng)基采用YEPD培養(yǎng)基或麥芽汁培養(yǎng)基，乳酸乳球菌種子培養(yǎng)基 采用CM培養(yǎng)基或脫脂乳培養(yǎng)基，兩種種子培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后，將兩種菌種分別 接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期；2) 混菌發(fā)酵按步驟l)制得的種子液按照比例同時接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行混菌發(fā)酵， 發(fā)酵時間18-28小時。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵酸度生產(chǎn)乳酸鏈球菌 素的方法，其特征在于所述方法的具體步驟如下1) 種子液制備酵母種子培養(yǎng)基采用YEPD培養(yǎng)基或麥芽汁培養(yǎng)基，乳酸乳球菌種子培養(yǎng)基 采用CM培養(yǎng)基或脫脂乳培養(yǎng)基，兩種種子培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后，將兩種菌種分別 接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期；2) 混菌發(fā)酵按步驟l)制得的種子液按照比例先后接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，首先在發(fā)酵培養(yǎng) 基中接入酵母菌種子液，在其后〉0-5小時再接入乳酸乳球菌種子液，進行混菌發(fā) 酵，發(fā)酵時間18-28小時。
全文摘要
本發(fā)明是一種應(yīng)用酵母控制乳酸乳球菌發(fā)酵酸度生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的方法。是利用酵母和乳酸菌的混合發(fā)酵來達到控制發(fā)酵體系的pH值，避免使用堿液中和調(diào)節(jié)pH值，以高效率生產(chǎn)乳酸鏈球菌素。本發(fā)明混合發(fā)酵使用的酵母可以利用乳酸菌產(chǎn)生的乳酸作為碳源，而不利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳糖，避開了與乳酸菌競爭碳源，可以達到消除發(fā)酵液中乳酸的目的，從而控制住發(fā)酵液的pH值。通過兩菌互利共生，達到有效促進乳酸鏈球菌素生產(chǎn)的目的。該方法利用酵母和乳酸菌的混合培養(yǎng)來控制pH值，避免使用堿液中和調(diào)節(jié)，對保護環(huán)境有重要意義。
文檔編號C12P39/00GK101649343SQ20091007040
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日 公開號200910070406.發(fā)明者賈士儒, 趙樹欣, 郭淑文 申請人:天津科技大學(xué)