專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于鉻渣污染場(chǎng)地修復(fù)的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于環(huán)境污染處理的菌株，特別涉及一種鉻還原功能菌。
背景技術(shù)：
六價(jià)鉻是一種毒性較大致癌、致畸、致突變劑物質(zhì)。環(huán)境中鉻污染主要來(lái) 自于電鍍、制革、油漆、印染等行業(yè)含鉻廢水的排放以及金屬鉻和鉻鹽生產(chǎn)行 業(yè)產(chǎn)生的固體廢物一一鉻渣。微生物修復(fù)鉻污染的方法由于其成本低、無(wú)二次 污染和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而日益引起廣大環(huán)保工作者極大的興趣。分離獲得高效 的鉻還原功能菌一直是研究者們致力開(kāi)展的一項(xiàng)工作。國(guó)內(nèi)外在這方面的報(bào)道 較多，已分離具有還原六價(jià)鉻能力的細(xì)菌有多種，主要有脫硫弧菌
("e5Y/7/bK27 r2》n/^ari6")、芽孢桿菌(5acW〃51 sp.)、假單胞菌(/^ew/。/77。/ as sp.)、希瓦氏菌(577e附"e7〗a sp.)、大腸桿菌(fecAerfcAia coh' sp)等。 但是，迄今為止，尚未有關(guān)于尸朋"o/L^3cterp/Lra^L^"ys還原六價(jià)鉻的報(bào)道。 因此，本發(fā)明為六價(jià)鉻污染微生物修復(fù)提供了新的微生物資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的鉻還原功能菌株，該菌株具有將六價(jià)鉻還 原為三價(jià)鉻的功能，將該菌株用于鉻污染的治理，成本低，操作簡(jiǎn)單。
發(fā)明人采集湖南鐵合金廠(chǎng)鉻渣堆放場(chǎng)污染土壤，經(jīng)過(guò)篩選、分離、馴化， 得到一種具六價(jià)鉻還原特性的菌株，經(jīng)鑒定，該菌株16s rRNA基因序列與 尸朋/70/7i6a"ar p/Lra^wYet"s sp. 16S rRNA有99%的相似性，命名為 /^朋o/ itecter p力r鄉(xiāng)M7e&s BB。該菌株已于2009年5月5日向中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)提交生物保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 3052。該菌株可廣泛用于鉻渣污染場(chǎng)地修復(fù)。
本發(fā)明中，篩選、分離、馴化該菌株的過(guò)程為采集湖南鐵合金廠(chǎng)鉻渣堆 放場(chǎng)下土壤，在液體培養(yǎng)基中，3(TC恒溫培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)3 4天；稍振蕩，上部 泥漿按稀釋梯度接種于含有50 250mg/L六價(jià)鉻濃度的固體培養(yǎng)基中，挑取不 同形態(tài)菌，于含有50 250mg/L六價(jià)鉻濃度的液體培養(yǎng)基中，3(TC振蕩培養(yǎng)； 挑取已純化的單菌落，逐步提高鉻濃度，進(jìn)行馴化。
所述液體培養(yǎng)基組成為5g/L乳酸鈉、5g/L酵母膏和2g/L氯化鈉，其余 為水，用5mol/L Na0H調(diào)節(jié)pH=9. 5 9. 8。所述固體培養(yǎng)基為5g/L乳酸鈉、5g/L酵母膏和2g/L氯化鈉，15g/L瓊脂。


圖l:本發(fā)明的菌株的菌落形態(tài)圖2:本發(fā)明的菌株形態(tài)圖3:本發(fā)明菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析樹(shù)；
圖4:用本發(fā)明菌株還原Cr(VI)的還原效果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:本發(fā)明的鉻還原菌的分離純化及馴化
采集湖南鐵合金廠(chǎng)鉻渣堆放場(chǎng)下土壤，稱(chēng)取10g鉻渣土壤于150mL已滅菌 的錐形瓶中，加入10mL滅菌液體培養(yǎng)基(5g/L乳酸鈉、5g/L酵母膏和2g/L 氯化鈉，其余為水，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)p^9.5 9.8)，于30 'C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)4天。隨后取lmL泥漿按梯度稀釋成10—3、 10—4、 l(T5、 10—6、 10—7、 10—8，用 移液槍從10—6、10_7和10_8稀釋液中分別取0. lmL置于含有250mg/LCr(VI)(以 K2CrA溶液作為鉻源)的固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基組成為5g/L乳酸鈉、5g/L 酵母膏和2g/L氯化鈉，15g/L瓊脂。用三角棒充分涂勻，將平板倒置于30 °C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。用無(wú)菌的接種針挑取不同形態(tài)的菌落，劃線(xiàn)接種于含250 mg/LCr(VI)的固體培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)基組分同上。倒置，于30 。C培養(yǎng)箱培 養(yǎng)4天。
分別挑取己純化的單菌落于上述含250 mg/L Cr(VI)液體培養(yǎng)基中，液體 培養(yǎng)基組成5g/L乳酸鈉、5g/L酵母膏和2g/L氯化鈉，250 mg/LCr(VI)(以 K2Cr2(V溶液作為鉻源)，其余為水，當(dāng)培養(yǎng)基顏色從最初的黃色變?yōu)樘m灰色時(shí)， 培養(yǎng)液中Cr(VI)濃度低于檢出限。檢出限是指用分光光度法無(wú)法檢出培養(yǎng)基中 的Cr(VI)。
選取該瓶進(jìn)行轉(zhuǎn)接，逐步提高Cr(VI)濃度，從250 mg/L、 300 mg/L、 400 mg/L、 500 mg/L，每種培養(yǎng)重復(fù)2 3次。馴化結(jié)束后，取培養(yǎng)液10mL接入到 100mL培養(yǎng)液中，30 °C， 150rpm振蕩過(guò)液培養(yǎng)，取出，4'C保存。
實(shí)施例2:菌株細(xì)菌學(xué)特征及生物學(xué)鑒定
取菌液少許滴在載玻片上，使菌體附著15min，放入2. 5%的戊二醛溶液 中固定lh，酒精梯度30% 70%逐級(jí)脫水，醋酸異戊酯置換30min，臨界點(diǎn)干 燥，離子濺射，掃描電子顯微鏡觀(guān)察并拍照，見(jiàn)附圖l。 1.形態(tài)特性(1) 菌落形態(tài)特征將生長(zhǎng)有鉻還原菌的液體培養(yǎng)基通過(guò)劃線(xiàn)平板法， 接種到含有250mg/L六價(jià)鉻濃度的固體培養(yǎng)基中，將平板倒置于3(TC恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4天，觀(guān)察其菌落形態(tài)，在有Cr(VI)的平板上，菌落呈蘭 灰色，圓形，邊緣整齊，中部突起，見(jiàn)附圖l。
(2) 菌體特征該菌株屬革蘭氏陰性菌，菌體為桿狀，尾部生有鞭毛， 菌體游動(dòng)，表面粗糙且有絲狀物質(zhì)附著，參見(jiàn)附圖2。
2. 生化特性
還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，吐溫80水解、磷酸酯酶水解為陽(yáng)性反應(yīng)；甲基 紅、吲哚產(chǎn)生、3-酮基乳糖、H2S產(chǎn)生、纖維素水解、脲酶活性、白明膠水解、 淀粉水解為陰性反應(yīng)。
3. 生理生化特性
可利用D-木糖、D-葡萄糖、L-樹(shù)膠醛糖、蔗糖、乳糖產(chǎn)酸，能利用檸檬酸 鹽，D-果糖、D-半乳糖、麥芽糖為陰性反應(yīng)，生長(zhǎng)的適宜pH為9-10，適宜溫 度為3(TC，無(wú)氯化鈉可生長(zhǎng)。
_表l菌株的生理生化特性_
生理生化特性 Strain BB
檸檬酸鹽利用 +
脲酶活性 _
磷酸酯酶 +
白明膠水解 一
吐溫80水解 +
纖維素水解 一
D-木糖產(chǎn)酸 +
D-果糖產(chǎn)酸 _
D-葡萄糖產(chǎn)酸 +
L-樹(shù)膠醛糖產(chǎn)酸 +
D-半乳糖產(chǎn)酸 一
蔗糖產(chǎn)酸 +
麥芽糖產(chǎn)酸 _
乳糖產(chǎn)酸 一
甲基紅 一吲哚產(chǎn)生 _ 3-酮基乳糖 _ 硝酸鹽還原 + HzS產(chǎn)生 一 淀粉水解 _ 適宜pH 9-10 _無(wú)NaC性長(zhǎng)__
4. 16s rRNA特性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析
用接種環(huán)直接挑取一環(huán)己純化的菌落于裝有細(xì)胞裂解液移液管中，裂解液 用量為lmL(細(xì)胞裂解液的組成為100uL或10y。十二烷基磺酸鈉，20uL 40% NaOH， 880 PL無(wú)菌水)。破壁，抽絲，破壁后直接作為模板進(jìn)行16sr RNA菌 落PCR。按TIANGEN公司DNA回收試劑盒操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段割膠回收， 瓊脂糖凝膠DNA回收后的片段進(jìn)一步純化按TIANGEN公司DNA純化試劑盒操作 進(jìn)行，目的DNA片斷(割膠回收產(chǎn)物)與pGM-T載體連接，將連接產(chǎn)物進(jìn)行熱 擊轉(zhuǎn)化，挑取過(guò)夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)化平板上得到的白色菌落進(jìn)行核酸序列的測(cè)定。
16s rRNA基因序列和Genbank中己登錄的16s rRNA基因序列進(jìn)行核苷酸同 源性比較，與Pa/MOTJ'fe"er p/Lrag頂it""s 16S rRNA有99%的相似性，將該菌 株命名為尸a/wo/2j7^c^rp/Lra^u'fez^sBB。該菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析樹(shù)見(jiàn)附圖3。 實(shí)施例3:鉻還原菌還原Cr(VI)效果
細(xì)菌還原Cr(VI)條件培養(yǎng)基組分5g/L乳酸鈉，5g/L酵母膏，2g/L氯 化鈉；用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=9. 5 9. 8;溫度30 。C 。
用接種環(huán)挑取已純化的菌落于裝有100 mL滅菌培養(yǎng)基的錐形瓶中，于30 °C， 150 rpm搖床培養(yǎng)24h,然后，用滅菌移液管移取10mL該過(guò)夜生長(zhǎng)的菌液， 接種到六價(jià)鉻濃度分別為25， 50， 100， 150， 200， 300， 400和500mg/L的100mL 滅菌培養(yǎng)基中(以K2Cr207溶液作為源)，于30。C， 150 rpm，搖床培養(yǎng)72 h， 期間，分別在培養(yǎng)后0， 6， 12， 24， 36， 48， 60及72 h，用滅菌針筒取 樣，離心，上清液進(jìn)行殘余六價(jià)鉻的測(cè)定，各個(gè)時(shí)段測(cè)定Cr (VI)的結(jié)果如附圖 4所示。
權(quán)利要求
1.一種用于鉻渣污染場(chǎng)地修復(fù)的菌株，所述菌株為Pannonibacterphragmitetus BB，CGMCC No.3052，具有能將六價(jià)Cr還原為三價(jià)Cr的能力。
2. 如權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于該菌適合培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基含 5g/L乳酸鈉，5g/L酵母膏，2g/L氯化鈉;pH=9.5 9.8;溫度30。C。
3. —種分離培養(yǎng)權(quán)利要求1所述菌株的方法，其特征在于包括以下步驟采集湖南鐵合金廠(chǎng)鉻渣堆放場(chǎng)下土壤，在乳酸鈉酵母膏液體培養(yǎng)基中，3(TC 恒溫培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)3 4天;稍振蕩，上部泥漿按稀釋梯度接種于含有50 250mg/L六價(jià)鉻濃度的固體培養(yǎng)基中，挑取不同形態(tài)菌，于含有50 250mg/L六價(jià)絡(luò)濃度的培養(yǎng)基中，3(TC振蕩培養(yǎng)；挑取己純化的單菌落， 逐步提高鉻濃度，進(jìn)行馴化。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基組成為5g/L 乳酸鈉、5g/L酵母膏、2g/L氯化鈉，其余為水；所述固體培養(yǎng)基為5g/L 乳酸鈉、5g/L酵母膏、2g/L氯化鈉和15g/L瓊脂。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述馴化時(shí)Cr(VI)梯度濃度分別 為250 mg/L、 300 mg/L、 400 mg/L、 500 mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于鉻渣污染場(chǎng)地修復(fù)的菌株P(guān)annonibacterphragmitetus BB，保藏號(hào)為CGMCC No.3052。發(fā)明人采集湖南鐵合金廠(chǎng)鉻渣堆放場(chǎng)污染土壤，經(jīng)過(guò)篩選、分離、馴化，得到一種具六價(jià)鉻還原特性的菌株，該菌株具有將六價(jià)鉻還原為三價(jià)鉻的功能。將該菌株用于鉻污染的治理，成本低，操作簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101684453SQ200910043840
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者兵 彭, 楊志輝, 柴立元, 兵 王, 王云燕, 王海鷹, 蘇長(zhǎng)青, 閔小波, 黃順紅 申請(qǐng)人:中南大學(xué)