專(zhuān)利名稱(chēng)：灰飛虱從冷凍病葉中獲得水稻黑條矮縮病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種灰飛虱從冷凍病葉中獲得水稻黑條矮縮病毒的方法 及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)是一 種由灰飛虱傳播的病毒病害，侵染水稻引發(fā)水稻黑條矮縮病，水稻一旦感 病便無(wú)收獲。該病害自1963年在我國(guó)浙江省余姚縣發(fā)現(xiàn)以來(lái)，上世紀(jì)主 要在浙江南部秈稻產(chǎn)區(qū)發(fā)生危害，而在江蘇等粳稻主產(chǎn)區(qū)卻鮮有發(fā)現(xiàn)。 2004年初水稻條紋葉枯病在江蘇等省爆發(fā)成災(zāi)， 一批抗病品種迅速大面積 推廣應(yīng)用，對(duì)病害的整體防控便起到了關(guān)鍵的作用?？墒沁M(jìn)一步的研究表 明，這類(lèi)水稻條紋葉枯病抗病品種對(duì)RBSDV的抗性普遍較差，由于同一病 原引發(fā)的玉米粗縮病近年來(lái)也處于流行期為病害的發(fā)生提供了充足的毒 源，加之灰飛虱發(fā)生量的連年增加，植保專(zhuān)家預(yù)測(cè)水稻黑條矮縮病有發(fā)生 流行危害的潛在風(fēng)險(xiǎn)。果然RSV抗病品種推廣兩年后水稻黑條矮縮病便在 江蘇等粳稻主產(chǎn)區(qū)發(fā)生流行，據(jù)江蘇省植保站統(tǒng)計(jì)截止2007年病害已在 該省沿海、淮北及里下河的鹽城、連云港、泰州、淮安、揚(yáng)州和徐州等地 嚴(yán)重發(fā)生，當(dāng)年發(fā)生危害的面積達(dá)30.8萬(wàn)畝，而2008年水稻黑條矮縮病 的發(fā)生面積則超過(guò)400萬(wàn)畝，病害爆發(fā)流行的態(tài)勢(shì)一觸即發(fā)。
面對(duì)具有突發(fā)性和爆發(fā)性特點(diǎn)的病毒病害，篩選抗病品種應(yīng)用于生產(chǎn) 是最為直接有效的方法，然而水稻黑條矮縮病和水稻條紋葉枯病同為依賴(lài) 灰飛虱傳播的病毒病特點(diǎn)卻給水稻黑條矮縮病的抗性鑒定方法增添了許 多困難。由于灰飛虱不能經(jīng)卵傳播RBSDV，以病苗對(duì)灰飛虱進(jìn)行飼毒后必 須于當(dāng)代進(jìn)行接種使用，這就要求研究單位和育種單位需要盡量長(zhǎng)的時(shí)間 保存有患病的水稻或小麥植株，用于飼毒。可是患病的水稻或小麥植株往 往在表現(xiàn)嚴(yán)重矮化，長(zhǎng)勢(shì)差，很難長(zhǎng)期保存。這使得水稻黑條矮縮病的抗 性品種選育工作受到極大的限制，迫切需要發(fā)明一種水稻黑條矮縮病毒毒 源的保存的方法，既可以長(zhǎng)期保存毒源，又可以方便的使灰飛虱獲得病毒 用于接種，以協(xié)助建成更為便捷易行的水稻黑條矮縮病品種抗性鑒定方 法，為水稻抗黑條矮縮病的資源發(fā)掘篩選、品種選育和遺傳規(guī)律研究提供基本的研究手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種灰飛虱從冷凍病葉中獲得水稻黑條矮縮病毒的方法。
本發(fā)明的原理是預(yù)先采集攜帶水稻黑條矮縮病毒的植株葉片以冷凍方 法保存，通過(guò)伺喂的方法灰飛虱便能從冷凍病葉上獲得水稻黑條矮縮病 毒，再將灰飛虱轉(zhuǎn)移至不攜帶病毒的健康秧苗上喂養(yǎng)渡過(guò)病毒的循回期 后，即獲得可應(yīng)用于接種鑒定的攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱。
在上述方法中"攜帶水稻黑條矮縮病毒的植株葉片"是通過(guò)以下手段 獲得的。從田間釆集的具有植株顯著矮縮、平行于葉脈的短條狀葉片皺折 和白色蠟滴狀突起等水稻黑條矮縮病或小麥綠矮病癥狀的植株，也可以是 人工接種獲得水稻或小麥患病植株，采用免疫學(xué)方法或分子方法檢測(cè)確認(rèn) 其攜帶水稻黑條矮縮病毒，即獲得攜帶水稻黑條矮縮病毒的植株葉片。
在上述方法中，冷凍保存葉片的溫度是-2(TC至-8(TC。
所述用于飼喂的冷凍葉片在解凍后，放置于相對(duì)封閉的容器中，其可 以是以尼龍紗布封口玻璃杯或圓形開(kāi)口塑料容器，要求有較好的空氣流動(dòng) 性確?；绎w虱存活，同時(shí)又可防止灰飛虱逃出容器。
所述用于飼毒的灰飛虱為1-3齡，飼毒時(shí)間為2-3天，飼毒后的循 回期為10天以上，可根據(jù)操作需要、環(huán)境溫度和帶毒水稻植株的差異進(jìn) 行選擇。
所述獲得可應(yīng)用于接種鑒定的攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱需通過(guò) 以下兩種方法確認(rèn)。 一是從渡過(guò)循回期的灰飛虱群體中隨機(jī)抽取10頭以 上的灰飛虱，采用免疫學(xué)方法或分子方法檢測(cè)是否攜帶水稻黑條矮縮病 毒，若全部或部分?jǐn)y帶病毒，則確認(rèn)獲得。二是從渡過(guò)循回期的灰飛虱群 體中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的灰飛虱，釆用人工接種的方法接種感病水稻品 種，若接種后水稻品種表現(xiàn)出水稻黑條矮縮病癥狀或通過(guò)分子手段證實(shí)含 有病毒，則確認(rèn)獲得。
本發(fā)明提供了一種灰飛虱從冷凍病葉中獲得水稻黑條矮縮病毒的方 法，利用其建立的水稻黑條矮縮病的品種抗性鑒定方法可以很好的克服灰 飛虱釆用患病植株獲毒方法中患病植株難以長(zhǎng)期保存的技術(shù)瓶頸，拓寬了 品種抗性鑒定時(shí)間。這一鑒定方法可以應(yīng)用于水稻品種資源的發(fā)掘鑒定、 品種抗性評(píng)價(jià)、抗病品種選育和抗性遺傳規(guī)律研究等眾多領(lǐng)域。


圖1為冷凍病葉飼毒灰飛虱示意圖。
圖2為獲得水稻黑條矮縮病毒后灰飛虱單管單苗單蟲(chóng)接種水稻品種示 意圖。
圖3為接種水稻發(fā)病癥狀示意圖(B為感染水稻黑條矮縮病毒植株，A
為正常植株)。
圖4為接種水稻黑條矮縮病毒后水稻的RT-PCR檢測(cè)示意圖(M為 Marker III; CK為健康植株對(duì)照；1， 3， 7， 9為發(fā)病植株；2， 4， 6， 8,10， 12為 正常植株)。
具體實(shí)施方法
實(shí)施例1,灰飛虱從冷凍小麥病葉中獲得水稻黑條矮縮病毒的方法
① 攜帶水稻黑條矮縮病毒的植株葉片的獲得。
2009年5月于江蘇郅州小麥重病區(qū)釆集具有典型"綠矮"癥狀的小麥。 參照Trizol (Reagent)說(shuō)明書(shū)方法提取小麥總RM。根據(jù)已發(fā)表的RBSDV 的S9序列設(shè)計(jì)引物(引物由上海英俊生物技術(shù)公司合成)
R: 5' -GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3'
Fl: 5' -GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT -3'。
釆用RT-PCR檢測(cè)確定病株是否攜帶水稻黑條矮縮病毒。反轉(zhuǎn)錄按照 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增體系為cDNA模板3. 0 ^L, Taq plus酶0.5 pL， dNTP (每份IO mmol.L-l) 0.5 pL, 10 xPCR緩沖液 (含Mg2+) 2. 5 |iL, 5'端引物(10 pmol. L-1) 1. 0 |uL， 3'端引物(10 pmol. L-l)l. O(iL， ddH20 16. 5 pL，合計(jì)25pL。反應(yīng)程序?yàn)?5。C預(yù)變性5min; 94。C變性lmin; 51。C退火lmin; 72。C延伸lmin; 35個(gè)循環(huán)；最后72。C延 伸10min, 4'C保存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增的目的條帶(1118bp )。 同時(shí)釆用斑點(diǎn)免疫結(jié)合法(DIBA)確定病株不攜帶水稻條紋病毒(RSV)。 挑選出6株僅含有水稻黑條矮縮病毒的小麥植株后取其葉片保存于- 0'C
冰箱中。
② 飼毒用灰飛虱的獲得
2008年4-5月從江蘇農(nóng)科院小麥田中采集灰飛虱若蟲(chóng)，在感病品種武 育粳3號(hào)上進(jìn)行飼養(yǎng)，交配后單頭雌蟲(chóng)單獨(dú)產(chǎn)卵，隨機(jī)抽取群體中10%的灰飛虱采用斑點(diǎn)免疫結(jié)合法檢測(cè)雌蟲(chóng)帶毒情況，保留不帶毒雌蟲(chóng)的后代， 以后每代次隨機(jī)抽取群體中10%的灰飛虱采用斑點(diǎn)免疫結(jié)合法檢測(cè)確保 不帶毒，即獲得不攜帶RSV的灰飛虱。為避免傳毒介體污染，每次飼毒前
取100只DIBA法檢測(cè)確定為無(wú)毒蟲(chóng)。 ③灰飛虱從冷凍病葉中獲得病毒
45天后取出適量①述病葉，-4。C放置2小時(shí)后，放置溫室中，3小時(shí) 后移入燒杯內(nèi)，每個(gè)燒杯接入60只l-2齡無(wú)毒的灰飛虱，飼毒前使其饑 餓3小時(shí)。飼毒48小時(shí)后將存活的灰飛虱移入養(yǎng)蟲(chóng)苗并記錄存活的灰飛 虱數(shù)量(如圖l)。同時(shí)分別取等量的新鮮病葉及健康葉片于燒杯內(nèi)，同樣 方法伺毒，飼毒48小時(shí)后將灰飛虱移至養(yǎng)蟲(chóng)苗中并記錄存活的灰飛虱數(shù) 量。詞毒兩天后，冷凍葉片、新鮮病葉及健康葉片存活灰飛虱數(shù)平均為35、 52. 5及54,存活率分別為58.3%, 87. 5°/ 及90%,雖然冷凍葉片飼毒灰飛 虱存活率低于新鮮葉片，但有一半以上的灰飛虱能在冷凍葉片上存活兩 天。接種后對(duì)移出的25只灰飛虱進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，冷凍葉片飼毒的灰飛 虱擴(kuò)增出目的條帶分別為6只、5只、7只，平均帶毒率為24%,新鮮葉片 飼毒灰飛虱擴(kuò)增出有目的條帶分別8只、9只，9只，平均帶毒率為34.7% (如表1 )。這表明灰飛虱能從冷凍病葉上獲得水稻黑條矮縮病毒。
表i
處理飼毒蟲(chóng)量存活蟲(chóng)量存活率帶毒率
冷凍病葉-1602847%25%
冷凍病葉-2604067%22%
冷凍病葉-3603762%23%
新鮮病葉-1605388%32%
新鮮病葉-2605083%36%
健康葉片-3605795%0%
健康葉片-1605287%0%
健康葉片-2605592%0%
④獲毒后灰飛虱的傳毒能力
將③述冷凍病葉和新鮮病葉飼毒獲得的灰飛虱移入養(yǎng)蟲(chóng)苗繼續(xù)飼養(yǎng)
15天，每個(gè)重復(fù)選取25只灰飛虱，采用單苗單蟲(chóng)方法于1.5葉期時(shí)接種 感病品種華粳6號(hào)(圖2), 4天后移出全部灰飛虱，再將稻苗移栽至大田， 注意水肥管理。7天以后開(kāi)始調(diào)査，每3天調(diào)查一次，連續(xù)調(diào)查5次。調(diào)
查標(biāo)準(zhǔn)參照水稻黑條矮縮病的典型癥狀具有植株顯著矮縮、平行于葉脈 的短條狀葉片鈹折和白色蠟滴狀突起等(圖3)。結(jié)果如表2，冷凍病葉飼毒灰飛虱接種華粳6號(hào)后發(fā)病率為6.7%,新鮮病葉的發(fā)病率為10%。用① 述RT-PCR方法檢測(cè)接種后水稻葉片，有典型發(fā)病癥狀的華粳6號(hào)均能擴(kuò) 增到目的條帶，無(wú)發(fā)病癥狀的華粳6號(hào)均不能擴(kuò)增的目的條帶(圖4)。這 表明灰飛虱從冷凍病葉上獲得水稻黑條矮縮病毒后可以接種至水稻品種 上。
本發(fā)明主要服務(wù)于針對(duì)水稻黑條矮縮病開(kāi)展的抗性資源篩選發(fā)掘、抗 病品種的鑒定與評(píng)價(jià)和抗性品種的選育。同時(shí)該項(xiàng)技術(shù)還可在植物抗病性 的遺傳學(xué)和抗水稻黑條矮縮病毒轉(zhuǎn)基因的研究工作中作為生物學(xué)檢測(cè)方 法應(yīng)用，將能夠大大加快研究的進(jìn)程。
上述實(shí)施不以任何形式限定本發(fā)明。
冷凍病葉-i
冷凍病葉-2 冷凍病葉-3 新鮮病葉-1 新鮮病葉-權(quán)利要求
1、一種灰飛虱從冷凍病葉中獲得水稻黑條矮縮病毒的方法，其特征在于預(yù)先采集攜帶水稻黑條矮縮病毒的植株葉片以冷凍方法保存，通過(guò)飼喂的方法灰飛虱便能從冷凍病葉上獲得水稻黑條矮縮病毒，再將灰飛虱轉(zhuǎn)移至不攜帶病毒的健康秧苗上喂養(yǎng)渡過(guò)病毒的循回期后，即獲得可應(yīng)用于接種鑒定的攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱。
2、 l中所述冷凍方法保存，其關(guān)鍵在于冷凍保存葉片的溫度是-20 。C至—80°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種灰飛虱從冷凍病葉中獲得水稻黑條矮縮病毒的方法。本發(fā)明的原理是將攜帶水稻黑條矮縮病毒的植株葉片以冷凍方法保存，通過(guò)飼喂的方法使灰飛虱從冷凍病葉上獲得水稻黑條矮縮病毒，待灰飛虱渡過(guò)病毒的循回期后，即獲得可應(yīng)用于接種鑒定的攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱。利用本方法建立的水稻黑條矮縮病的品種抗性鑒定方法可以很好的克服采用患病植株飼喂灰飛虱獲毒方法中患病植株難以長(zhǎng)期保存的技術(shù)瓶頸，拓寬了品種抗性鑒定時(shí)間，可望加快抗病資源的篩選速度和抗病品種的選育進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12N7/00GK101633908SQ20091003414
公開(kāi)日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月1日
發(fā)明者吳麗娟, 彤 周, 周益軍, 季英華, 熊如意, 英 王, 程兆榜 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院