專利名稱：：水稻抗條紋葉枯病主效基因位點qSTV11的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了抗水稻條紋葉枯病主效基因位點^S7W的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，專用于水稻條紋葉枯病抗性品種的選育與種質(zhì)資源的篩選利用。二
背景技術(shù)：
：水稻條紋葉枯病是由水稻條紋病毒引起的病毒病，其傳毒介體主要是灰飛虱。近年隨著免耕、稻套麥、麥套稻等輕型栽培技術(shù)以及感病高產(chǎn)品種的推廣應(yīng)用，加速了水稻條紋葉枯病的媒介灰飛虱帶毒群體的擴大和危害?；绎w虱的刺吸時間短、持久傳毒等特性，使治蟲防病十分困難，使我國水稻條紋葉枯病的發(fā)生逐年加重。特別在江蘇省已成為有史以來罕見的重大爆發(fā)性病害，全省病害的重發(fā)區(qū)包括蘇北和蘇中的淮安、連云港、宿遷、鹽城、泰州、揚州、建湖等地區(qū)以及南通的局部地區(qū)，而鎮(zhèn)江、徐州、南京等地區(qū)也呈加重趨勢。重病區(qū)發(fā)病面積占水稻種植面積的90%以上，重災(zāi)區(qū)的漏防田塊病穴率高達(dá)90%、病株率達(dá)70%以上，有的田塊基本失收，造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前生產(chǎn)上主要結(jié)合耕作制度調(diào)整、栽培技術(shù)改進，適期治蟲防病，但效果不佳，并且污染環(huán)境。最經(jīng)濟有效的方法仍是選用優(yōu)良抗病品種，利用品種自身的抗性達(dá)到主動防治的目的。因此，挖掘新抗源，培育高抗條紋葉枯病水稻新品種具有重要的理論及現(xiàn)實意義。由于條紋葉枯病表型鑒定十分困難，培育抗條紋葉枯病水稻品種的進程異常緩慢，利用分子標(biāo)記輔助選擇方法可以有效解決這一難題。三、
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供水稻抗條紋葉枯病主效基因位點^S7T"的分子標(biāo)記方法，通過檢測與該位點緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以預(yù)測水稻植株對條紋葉枯病的抗性，加快抗條紋葉枯病水稻品種的選育進度。技術(shù)方案水稻抗條紋葉枯病主效基因位點的分子標(biāo)記方法，其特征在于利用分子標(biāo)記引物R21:左端序列5'CAACGTGGTTGATTGTTC3'右端序列5'TTGCCAGGTTAGTTGTAC3'或者用分子標(biāo)記引物R22:左端序列5'GAGGCAAGCCAATGTCGT3'3右端序列5'CACAAATCAGCGAAGAAA3'或者用分子標(biāo)記引物R13:左端序列5'AACATCGGCTACCACCAAAA3'右端序列5'GAATGCTTCGTCGTTCTCAA3'或者用分子標(biāo)記引物R48:左端序歹U:5'GCCTTCATCCGTAAATCCATAAGC3'右端序列5'GAGTACCACATGGCATTATGAGAGC3'擴增水稻品種、品系或育種材料的DNA，如果用分子標(biāo)記引物R21能夠擴增出150bp，或者用分子標(biāo)記引物R22能夠擴增出170bp，或者用分子標(biāo)記引物R13能夠擴增出242bp，或者用分子標(biāo)記引物R48和能夠擴增出183bp的擴增片段，均標(biāo)志著水稻條紋葉枯病抗性位點^S7W的存在，該主效基因位點位于水稻第11染色體，利用SAS軟件測得與條紋葉枯病抗性不相關(guān)的概率戶值為0.001，對條紋葉枯病抗性的貢獻(xiàn)率為35.79%。有益效果本發(fā)明利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重組自交系群體，采用集團接種、田間鑒定和強迫飼毒的鑒定方法，在第11染色體標(biāo)記區(qū)間S2260-G257均能檢測到1個主效QTL，表明該QTL在不同的環(huán)境條件下都能穩(wěn)定表達(dá)。然而，由于與該QTL緊密連鎖的S2260和G257均為RFLP標(biāo)記，難以用于輔助選擇育種，因此篩選與該位點緊密連鎖的SSR標(biāo)記，無疑可以加速標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在條紋葉枯病抗性品種選育過程中的利用。本發(fā)明所提供水稻條紋葉枯病抗性主效基因位點《S7T77的可育種利用分子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點通過本發(fā)明分子標(biāo)記在國際上首次獲得定位了水稻品種Kasalath抗條紋葉枯病的主效基因位點，可解釋35.79%的條紋葉枯病抗性。水稻條紋葉枯病抗性的研究十分困難，對水稻條紋葉枯病抗性位點的精確定位工作居于同領(lǐng)域前列；通過本發(fā)明分子標(biāo)記定位的主效基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測與該位點緊密連鎖的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測水稻植株的條紋葉枯病抗性，用于水稻品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有抗條紋葉枯病，進而快速篩選抗病品種或品系用于水稻育種。主效基因位點的檢測方便快速，不受環(huán)境影響；輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗病基因的親本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對條紋葉枯病抗性進行單株選擇。條紋葉枯病的抗性受環(huán)境條件的影響很大，表型鑒定的結(jié)果可靠性偏低。因此抗病育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測條紋葉枯病抗性主效基因位點，在苗期就可以鑒定出高抗條紋葉枯病的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高抗條紋葉枯病水稻品種的選擇效率。四圖1水稻主效抗條紋葉枯病位點^S7W可育種利用分子標(biāo)記R21、R22、R13、R48的指紋圖譜。標(biāo)記R21泳道1:Marker;2:抗病親本Kasalath;3:感病親本日本晴；4、9、10、12、13、14、15、19、20、22、24泳道為抗病株系；其余泳道為感病株系。標(biāo)記R22泳道1:Marker;2:抗病親本Kasalath;3:感病親本日本晴；4、9、10、12、13、14、15、19、20、22、24泳道為抗病株系；其余泳道為感病株系。標(biāo)記R13泳道1:Marker;2:抗病親本Kasalath;3:感病親本日本晴；4、9、10、12、13、14、15、19、20、22、24泳道為抗病株系；其余泳道為感病株系。標(biāo)記R48泳道1:Marker;2:抗病親本Kasalath;3:感病親本日本晴；4、10、12、13、14、15、19、20、22、24泳道為抗病株系；其余泳道為感病株系。五具體實施例方式本發(fā)明的詳細(xì)說明如下研究表明，在水稻第11染色體上相同位置存在一個控制條紋葉枯病抗性的穩(wěn)定表達(dá)的主效基因位點。MaedaH等(MaedaH,NemotoH，YagiT，F(xiàn)ukutaY.QTLanalysisforricestripediseaseresistanceusingrecombinantinbredlines(RILs)derivedfromcrossingbetweenMilyangandAkihikari.In:ChinaAssociationofAgriculturalScienceSocieties,ChinaNationalRiceResearchInstitute,ChinaNationalHybridRiceResearchandDevelopmentCenter,ChinaFoundationSocietyforAgriculturalScienceandEducation(eds).Prospectsofricegeneticsandbreedingforthe21stcentury~Papercollectionofinternationalricegeneticsandbreedingsymposium.Beijing:ChinaAgriculturalScienceTechnologyPress,1999,53~57.)利用密陽23/秋光的重組自交系群體檢測到在第11染色體上XNpb202C1172標(biāo)記之間的XNpb257附近存在抗條紋葉枯病的QTL，貢獻(xiàn)率達(dá)17.36%,其抗性基因效應(yīng)來自密陽23;Hayano-Saito等(Hayano隱SaitoY,TsujiT,FujiK,K.Saito,M.Iwasaki,A.Saito.Localizationofthericestripediseaseresistancegene,Stv-bi,bygraphicalgenotypingandlinkageanalysiswithmolecularmarkers.TheoreticalandAppliedGenetics,1998,96(8):1044-1049)利用Modan的抗性后代Asanohikari與感病粳稻Nipponbare雜交所得的F2群體，將源于秈稻Modan的抗條紋葉枯病基因S/v-^定位在第11染色體上的XNpb220與XNpb257標(biāo)記之間。本課題組曾利用Kinmaze(粳)/DV85(秈)重組自交系群體檢測到《5^77，來自抗性親本DV85，貢獻(xiàn)率高達(dá)30.9%(丁秀蘭，江玲，劉世家，王春明，陳亮明，程兆榜，范永堅，周益軍，萬建民.利用重組自交系群體檢測水稻抗條紋葉枯病抗性基因，遺傳學(xué)報，2004,31(3):287-292)，位于標(biāo)記XNpb202C1172之間。通過本發(fā)明水稻品種Kasalath抗條紋葉枯病主效基因位點的分子標(biāo)記開發(fā)，在第11染色體上存在穩(wěn)定主效的抗條紋葉枯病QTL《》v77可用來指導(dǎo)水稻抗條紋葉枯5病品種的選育工作，用與之連鎖的分子標(biāo)記R21、R22、R13、R48對抗病品種進行篩選，實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而大大提高育種效率。材料與方法(一)親本及Nipponbare/Kasalath//Nipponbare(由日本農(nóng)業(yè)生物資源研究所Yanot専士提《共(Lin,S.Y.,T.Sasaki,M.Yano,Mappingquantitativetraitlocicontrollingseeddormancyandheadingdateinrice.Theor.Appl.Genet1998，96,997~1003)。該群體通過由Nipponbare與Kasalath雜交，所得再與Nipponbare回交，獲得BdF!，然后由BdFi通過單粒傳法得到。構(gòu)成了包含98個家系的回交重組自交系群體(BIL群體)，對其進行表型鑒定田間鑒定選用條紋葉枯病重發(fā)區(qū)江蘇姜堰婁莊鎮(zhèn)田間試驗地。為保證獲得蟲源，選用四周為麥田的地塊種植待鑒定的材料。當(dāng)?shù)鼗绎w虱的帶毒率為39%。2007年5月10曰(麥?zhǔn)涨?周)播種。每個家系播50粒，均勻撒播1行，行長18cm，行距10cm。6月5日間苗，淘汰弱苗，各株系保留3035株，株距56cm。注意水肥管理，不噴灑任何殺蟲劑，以保證遷入充足的蟲源。2次重復(fù)。2007年6月29日(播種后7周，麥?zhǔn)蘸?周)參照Washio(WashioO.,EzukaA.，ToriyamaK"SakuraiY.TestingmethodforGeneticofandBreedingforresistancetoricestripedisease.Bull.ChugokuAgr.Exp.Sta.Series,1968,16:39-197)的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)査田間發(fā)病情況。強迫飼毒將親本和98個家系浸種催芽，分別播于直徑5.8cm、高6.0cm，盛滿營養(yǎng)土的圓形塑料缽中(缽底有一小孔，便于滲透吸水)。置65cmX44cmX14cm的塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)(保持水層約2cm)，另加抗蟲和感蟲對照各2缽。每缽播種2025粒露白發(fā)芽種子，接蟲前4天間苗，淘汰病、弱苗，每缽保留10棵整齊一致的健苗用于接蟲。2次重復(fù)。當(dāng)秧苗長至1.52.0葉時，進行接種灰飛虱鑒定?；绎w虱帶毒率為40%左右。每缽罩以透明罩，頂端紗布封口，按每苗5頭灰飛虱計算需蟲量，接入23齡帶毒灰飛虱。每天趨蟲2次，使被測稻苗均勻受毒。48h后，移走全部灰飛虱，令接種后的苗于自然光照條件下生長發(fā)病。注意水肥管理。3~4周后，待病情發(fā)展穩(wěn)定，參照Washio(1968)的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)查。集團接種將兩個親本(親本Kasalath和Nipponbare)及98個家系的種子浸種催芽后，每個品種1行，隨機播種于65cmX44cmX14cm的塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)，每行20粒；當(dāng)秧苗長至1.5-2.0葉時進行接蟲鑒定，接蟲前2天間苗，淘汰病弱苗，每個品種保留10株左右生長一致的幼苗，用于抗病性鑒定，重復(fù)兩次。鑒定時，將周轉(zhuǎn)箱放入防蟲網(wǎng)內(nèi)，按每株5頭2-3齡灰飛虱若蟲計算所需蟲量(灰飛虱帶毒率為40%左右)，將其均勻接入周轉(zhuǎn)箱內(nèi)，每天驅(qū)趕蟲2次，72h后噴灑殺蟲劑殺死接入苗箱中的灰飛虱，30天后觀察秧苗發(fā)病情況。按病害發(fā)生嚴(yán)重程度，根據(jù)Washio的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，將各苗分成A、B、Bt、Cr、C和D等級別，統(tǒng)計各家系中不同級別的株數(shù)，按下列公式計算病情指數(shù)?！猧100XA+80XB+60XBt+40XCr+20XC+5病情指數(shù)=-xioo被測總苗數(shù)xioo為排除環(huán)境的影響，再將每個株系的病情指數(shù)與感病對照品種的病情指數(shù)相比，再乘以ioo，計算出病情指數(shù)比率。(二)重組自交系群體的分子標(biāo)記分析采用QTLCartographer2.0軟件，利用復(fù)合區(qū)間作圖法分析抗條紋病毒的QTL，在整個水稻染色體組中每隔2cM對QTL存在的可能性進行掃描，以LOD=2.9(P-0.05)作為閾值判斷QTL的存在，并分析每個QTL可解釋的表型變異百分率和加性效應(yīng)值。(三)與QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記分析取BIL群體(backcrossinbredlines,回交重組自交系群體)的98個家系及親本的種子各20粒，浸種催芽后播于一個6X10cm的塑料小缽子，大約兩葉時剪取所有幼葉，保存于-80。C冰箱，根據(jù)Dellaporta等的方法提取DNA。在第11染色體標(biāo)記C1172-G202之間合成22對SSR引物，篩選其多態(tài)性，將有多態(tài)的SSR引物的分子數(shù)據(jù)與Yano博士提供的第11染色體的RFLP標(biāo)記的分子數(shù)據(jù)聯(lián)合起來，利用MAPMARKER/EXP3.0軟件，重新構(gòu)建第11染色體的連鎖圖譜。再利用QTLCartographer2.5軟件分析該位點。利用SASGLM程序?qū)Ω鱾€分子標(biāo)記的群體基因型資料和與其對應(yīng)每個家系的病情指數(shù)比率進行連鎖分析，進一步驗證其連鎖關(guān)系。(四)結(jié)果與分析單向方差分析測得與條紋葉枯病抗性不相關(guān)的概率P值和位點對條紋葉枯病抗性的貢獻(xiàn)率R2(表2)，戶<0.05的分子標(biāo)記即與一個主效基因位點連鎖。所得分子標(biāo)記在群體中的基因型按親本Kasalath和Nipponbare的基因型分類，如果基因型與Kasalath相同的株系表型為抗，則該標(biāo)記定位的抗病主效基因位點來自Kasalath:在Kasalath中發(fā)現(xiàn)，在不相關(guān)的概率P=0.001下，該位點對條紋葉枯病抗性的貢獻(xiàn)率為35.79%，標(biāo)記R21、R22、R13、R48標(biāo)記與條紋葉枯病抗性主效基因位點緊密連鎖，即獲得水稻Kasalath抗條紋葉枯病主效基因位點^S7T//的分子標(biāo)記。通過上述分子標(biāo)記鑒定主效基因位點來預(yù)測水稻植株抗性，預(yù)計可迅速提高我國水稻條紋葉枯病抗性品種的育種進程。表i.標(biāo)記引物的序列及擴增片段大小名稱前引物序列后引物序列大小(bp)R215'CAACGTGGTTGATTGTTC3'5'TTGCCAGGTTAGTTGTAC3'1507R225'GAGGCAAGCCAATGTCGT3'5'CACAAATCAGCGAAGAAA3'170R135'AACATCGGCTACCACCAAAA3'5'GAATGCTTCGTCGTTCTCAA3'242R485'GCCTTCATCCGTAAATCCATAAGC3'5'GAGTACCACATGGCATTATGAGAGC3'183表2.水稻Kasalath抗條紋葉枯病主效基因位點的單向方差分析主效基因位點標(biāo)記病情指數(shù)比率i2(%)R21、R22、R13、R480.00135.79P:表示與條紋葉枯病抗性不相關(guān)的概率，PO.05表示該標(biāo)記與條紋葉枯病抗性緊密連鎖W2:位點對條紋葉枯病抗性的貢獻(xiàn)率，值越大，表明與條紋葉枯病抗性越相關(guān)利用4個選擇標(biāo)記對300份衍生于越光(是日本福井縣農(nóng)業(yè)試驗場于20世紀(jì)50年代育成的早熟優(yōu)質(zhì)粳稻品種)/Kasalath的置換系34號(RiceGenomeResourceCenter.2003.Koshihihari/KasalatathChromosomeSegmentSubstitutionLines(CSSLs)39lines[online].Availableatwww.rgrc.dna.affrc.go.ip/index.html.en(accessed1April2006).NationalInstituteofAgrobiologicalScience,Tsukuba.)與越光回交的次級F3:4群體的基因型和單標(biāo)記選擇效率(表3)。利用標(biāo)記選擇的流程概述如下首先利用四個選擇標(biāo)記分別選擇F3群體中帶型為Kasalath的單株，然后收獲F3:4的種子用于表型鑒定，表型鑒定方法為田間鑒定、集團接種和強迫飼毒，三種方法各2個重復(fù)。三種方法接種鑒定后表型值發(fā)病百分率和病情指數(shù)分別小于30%的株系標(biāo)記為高抗。表34個標(biāo)記選擇效率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>單標(biāo)記選擇的條件下，選擇準(zhǔn)確率均高于95%,其中標(biāo)記R22選擇效率最高為98.90%。雙標(biāo)記選擇條件下選擇準(zhǔn)確率均高于97%(表4)，其中標(biāo)記R22+R22選擇效率最高為100%;由于單、雙標(biāo)記選擇效率均高于95%，故單標(biāo)記和雙標(biāo)記選擇均可達(dá)到符合標(biāo)記輔助選擇的要求。由于選擇的4個標(biāo)記距離很近，所以雙標(biāo)記選擇和單標(biāo)記選擇的差異不大，一般情況下單標(biāo)記就可以高效的選擇抗病的株系。表4雙標(biāo)記選擇效率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻抗條紋葉枯病主效基因位點qSTVll的分子標(biāo)記方法<130>說明書<140>00<141>2009-02-17<160>8<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工<220><221>分子標(biāo)記引物R21左端序列<222>(1),.(18)<223><400〉1caacgtggttgattgttc18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工<220><221>分子標(biāo)記引物R21右端序列<222>(1)..(18)<223><400>2ttgcc鄉(xiāng)ttagttgtac18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工合成<220><221>分子標(biāo)記引物R22左端序列<222>(1)..(18)<223><400>3gaggcaagecaatgtcgt18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工合成<220><221>分子標(biāo)記引物R22右端序列9<222>(1)..(8)<223><400>4cacaaatcagcgaagaaa18<210>5<211>20<212>DNA<213>人工<220><221>分子標(biāo)記引物R13左端序列<222>(1)..(20)<223><400>5aacatcggctaccaccaaaa20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工<220><221>分子標(biāo)記引物R13右端序列<222>(1)..(20)<223><400>6gaatgcttcgtcgttctcaa20<210>7<211>24<212>DNA<213>人工<220><221>分子標(biāo)記引物R48左端序列<222>(1)..(24)<223><400>7gccttcatccgtaaatccataagc24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工<220><221>分子標(biāo)記引物R48右端序列<222>(1)..(25)<223><400>8gagtaccacatggcattatgagagc2510權(quán)利要求1、水稻條紋葉枯病抗性主效基因位點qSTV11的分子標(biāo)記方法，其特征在于利用分子標(biāo)記引物R21左端序列5′CAACGTGGTTGATTGTTC3′右端序列5′TTGCCAGGTTAGTTGTAC3′或者用分子標(biāo)記引物R22左端序列5′GAGGCAAGCCAATGTCGT3′右端序列5′CACAAATCAGCGAAGAAA3′或者用分子標(biāo)記引物R13左端序列5′AACATCGGCTACCACCAAAA3′右端序列5′GAATGCTTCGTCGTTCTCAA3′或者用分子標(biāo)記引物R48左端序列5′GCCTTCATCCGTAAATCCATAAGC3′右端序列5′GAGTACCACATGGCATTATGAGAGC3′擴增水稻品種、品系或育種材料的DNA，如果用分子標(biāo)記引物R21能夠擴增出150bp，或者用分子標(biāo)記引物R22能夠擴增出170bp，或者用分子標(biāo)記引物R13能夠擴增出242bp，或者用分子標(biāo)記引物R48和能夠擴增出183bp的擴增片段，均標(biāo)志著水稻條紋葉枯病抗性位點qSTV11的存在，該主效基因位點位于水稻第11染色體，利用SAS軟件測得與條紋葉枯病抗性不相關(guān)的概率P值為0.001，對條紋葉枯病抗性的貢獻(xiàn)率為35.79％。全文摘要本發(fā)明涉及水稻條紋葉枯病抗性主效基因位點qSTV11的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。以水稻品種Nipponbare為母本，Kasalath為父本，進行雜交，再與Nipponbare回交，衍生獲得回交重組自交系，對各家系的基因型和相應(yīng)的病情指數(shù)比率進行遺傳連鎖分析，檢測到抗條紋葉枯病主效基因位點qSTV11，來自Kasalath的等位基因具有抗性效應(yīng)，通過篩選，獲得可育種利用的分子標(biāo)記R21、R22、R13、R48。利用這四個分子標(biāo)記來檢測Kasalath及其衍生品種(系)中是否含有該主效基因位點，可預(yù)測其條紋葉枯病抗性水平，顯著提高抗條紋葉枯病水稻品種的選擇效率。文檔編號C12Q1/68GK101487050SQ200910024610公開日2009年7月22日申請日期2009年2月25日優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日發(fā)明者萬建民,喜劉,劉世家,張迎信,玲江,琦王,王寶祥,陳亮明申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)