專利名稱：一種提高適冷蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適冷蛋白酶的穩(wěn)定化技術(shù)，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
(二)
背景技術(shù)：
適冷酶主要由生活在高山、極地、深海等永久性低溫環(huán)境中的適冷微生物或變溫動(dòng)物 合成或分泌的，其主要特征是在低溫下保持較高的催化活性，在0 3(TC范圍內(nèi)，適冷酶 比相應(yīng)的中溫酶具有更高的催化效率，因此，適冷酶具有廣泛的應(yīng)用前景。
但是，適冷酶也有明顯的不足之處，研究表明，適冷酶在低溫下的高催化效率，伴隨 著其熱穩(wěn)定性的降低，因此，即使在中等溫度下，適冷酶也很容易失活，給酶的保存帶來(lái) 很大的困難，從而大大限制了適冷酶的應(yīng)用。
因此，提高適冷酶的穩(wěn)定性是突破適冷酶應(yīng)用瓶頸的關(guān)鍵，目前大多采用蛋白質(zhì)定點(diǎn) 突變、定向進(jìn)化或隨即突變篩選等技術(shù)策略，并且有成功的例子，但是上述技術(shù)策略往往 導(dǎo)致在提高酶的穩(wěn)定性的同時(shí)，酶的適冷性也隨之降低。加之這些技術(shù)大多適用于實(shí)驗(yàn)室 規(guī)模，并且費(fèi)用較大，因此，很難大規(guī)模推廣應(yīng)用。
化學(xué)修飾也是用于提高適冷酶熱穩(wěn)定性的方法之一，并且己經(jīng)成功應(yīng)用于堿性磷酸 酶、適冷脂酶B，適冷胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性改造。但是，由于化學(xué)修飾的位點(diǎn)專一性較差， 因此，因此，很難達(dá)到均一。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)適冷蛋白酶結(jié)構(gòu)柔性較強(qiáng)熱穩(wěn)定性不高的技術(shù)難題,提供一種提高適冷蛋 白酶熱穩(wěn)定性的方法。
術(shù)語(yǔ)說(shuō)明
1. 適冷蛋白酶在O"C仍能保持較高的催化效率，可水解蛋白酶，釋放出具有鮮味的 氨基酸。在較高溫度下酶活性顯著降低、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。
2. 中溫蛋白酶相對(duì)于適冷蛋白酶而言，在O'C下催化效率較低，最適酶活溫度為
40-60°C。
3. Tris—HCl緩沖液是一種本領(lǐng)域常用緩沖液。配制方法稱量121.14gTris置 于1L燒杯中，然后加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，用濃HC1調(diào)節(jié)pH值至7.5， 最后將溶液定容至1U這樣配制的是lM的Tris—HCl緩沖液，用時(shí)稀釋。
4. TMAO:氧化三甲胺，白色晶體，是一種天然的滲透調(diào)節(jié)劑，現(xiàn)主要用作飼料添加劑。
5. Eppendorf管:1. 5raL的小離心管。
本發(fā)明的提高適冷蛋白酶的熱穩(wěn)定性的方法，步驟如下
(1) 將適冷蛋白酶用20mM、 pH7. 5的Tris—HCl緩沖液配制成lmg/ml的適冷蛋白酶
母液，
(2) 將氧化三甲胺(TMA0)配制摩爾濃度為5M溶液，
(3) 將步驟(1)的適冷蛋白酶母液加入到步驟(2)的氧化三甲胺(TMAO)溶液中， 再添加20mM、 pH7.5的Tris—HCl緩沖液至蛋白酶的終濃度為0.20mg/ml，氧化三甲胺的 終濃度為0. 25M—1M。本發(fā)明所述的適冷蛋白酶是具有明顯的適冷特性的蛋白酶，現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的適冷蛋白 酶均可用本發(fā)明的方法提高其熱穩(wěn)定性。例如，但不限于(1)按專利CN1336433 (01127405.0)"適冷風(fēng)味蛋白酶的制備方法及應(yīng)用"制得的適冷蛋白酶；(2)適冷菌 /^e"ofe啦朋s印.SM9915分泌的適冷蛋白酶，參見陳秀蘭等，海洋與湖沼，2003， 34(2)， 155-160); (3)北極耐冷假交替單胞菌55""0m 及^SV2氾5^分泌的適冷蛋白酶，參見曾 胤新等，高技術(shù)通訊，2007， 17 (5), 535—539。
本發(fā)明的方法處理后的產(chǎn)品首先用CD光譜、熒光光譜檢測(cè)TMAO的加入是否對(duì)其結(jié)構(gòu) 有明顯影響，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)加入不同濃度的TMAO的適冷蛋白酶其光譜呈現(xiàn)了很好的吻合性 (如圖1、圖2),說(shuō)明TMAO不會(huì)影響適冷蛋白酶的結(jié)構(gòu)，然后分別檢測(cè)它的酶活性，酶 學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，熱力學(xué)參數(shù)，熱穩(wěn)定性，以及變構(gòu)溫度(如圖3、圖4)。
測(cè)定樣品的準(zhǔn)備在0. 5ml的Eppendorf管中分別加入0—400u 1 TMAO濃溶液，然 后在每個(gè)管中加入100ul的蛋白酶母液，所有管最后加入蛋白酶所對(duì)應(yīng)的緩沖液補(bǔ)足到 500yl。蛋白酶的終濃度為0.20mg/ml, TMAO的終濃度為0M—1M。配好的待測(cè)樣品混勻， 在4。C分別放置120分鐘，然后進(jìn)行光譜測(cè)定和酶學(xué)測(cè)定。具體方法如下
A適冷酶活性穩(wěn)定性檢測(cè)，酶活測(cè)定方法采用以酪蛋白為底物的福林酚法。
以合成短肽,Succiny1-Phe-Ala-Ala-Phe-;^nitroanilide(FAAF)為底物。熱力學(xué)參 數(shù)Kra的測(cè)定以不同濃度的FAAF為底物，然后根據(jù)0—3(TC的A^值計(jì)算出的fe anAcat= lnA-Ea/RT).其它熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)根據(jù)下列公式計(jì)算△ ^ = -RT In [a。at . A)/(KB .T)]; △ Y=^ - R7; and △ 5* = (A#- △ 60/T, T表示溶液溫度，力是Planck常數(shù)(6.63 x 10-34 Js), KB是Boltzman常數(shù)(l. 38 x l(T23 JK—') R是Universal Gas常數(shù)(8.314 JK—1 mol一1)。
么適冷蛋白酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測(cè)
CD光譜的檢測(cè)在Jasco J—810上進(jìn)行，光譜儀上裝備有Peltier型溫控系統(tǒng)。數(shù)據(jù) 摩爾橢圓率〔6 )單位deg cnfdmo廠1,通過(guò)公式〔6 ) = 100 0 /(cX1)計(jì)算，c表示蛋白 的摩爾濃度，1表示比色杯的厚度cm。檢測(cè)波長(zhǎng)遠(yuǎn)一UV CD從190mn—260nm,近一UV CD 從240nm—340nm。檢測(cè)步長(zhǎng)為2nm，狹縫寬度為4nm，掃描速度為200nra/min,每個(gè)樣品 都是掃描3次的平均值，除去蛋白以外的相同溶液作為背景扣除。
熒光光譜的檢測(cè)在Jasco FP—560熒光光譜儀上進(jìn)行檢測(cè)，該儀器配有循環(huán)水浴溫控 系統(tǒng)。分別用278nm和295nm的波長(zhǎng)來(lái)激發(fā)樣品，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍分別為290nm—400nm 和300nm—400nm。檢測(cè)步長(zhǎng)為0. 2nm，狹縫寬度為3nm,檢測(cè)靈敏度為中度靈敏，掃描速 度為1000nm/min。每個(gè)樣品都是掃描3次的平均值，除去蛋白以外的相同溶液作為背景扣 除。
適冷蛋白酶熱變構(gòu)溫度的檢測(cè) 運(yùn)用CD光譜檢測(cè)適冷蛋白酶的熱變構(gòu)溫度，將適冷蛋白酶樣品及加入TMAO的適冷蛋 白酶樣品放在不斷升溫的CD光譜議中進(jìn)行掃描，每升溫2"C掃描一次，以220nm處的峰值 變化繪制出適冷蛋白酶的變溫曲線(如圖3),然后由變溫曲線讀出適冷蛋白酶的熱變構(gòu)的 Tm值，加入TMAO后其Tm值明顯升高。 么適冷蛋白酶熱穩(wěn)定性的檢測(cè)
運(yùn)用CD光譜檢測(cè)酶結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，將適冷蛋白酶溶液及加入TMAO的適冷蛋白酶溶液在40°C保溫30min，每隔1分鐘測(cè)量樣品在222nm處的CD值，然后繪制曲線，如圖4所示。
本發(fā)明的有益效果
TMAO是在海洋生物中發(fā)現(xiàn)的一種天然的滲透調(diào)節(jié)劑，可以很好的提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定 性，本發(fā)明以深海細(xì)菌分泌的熱穩(wěn)定性不高的適冷蛋白酶為處理對(duì)象，應(yīng)用TMAO對(duì)其加 以保護(hù),通過(guò)酶活力檢測(cè)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測(cè)，表明TMAO可以很好的增強(qiáng)適冷蛋白酶的熱穩(wěn) 定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。為適冷蛋白酶的廣泛的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì) 效益。本發(fā)明采用TMAO做為穩(wěn)定試劑用于解決適冷蛋白酶熱穩(wěn)定性差的關(guān)鍵問(wèn)題，從而 為適冷蛋白酶的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
(四)


圖1顯示了實(shí)施例1適冷蛋白酶MCP-Ol在添加了不同濃度的TMAO后其CD光譜沒有 明顯變化，圖2顯示了適冷蛋白酶MCP-01在添加了不同濃度的TMAO后其熒光光譜沒有明 顯變化，說(shuō)明TMAO對(duì)其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。
圖3顯示了實(shí)施例1適冷蛋白酶MCP-01在不同TMAO濃度下的熱變構(gòu)曲線。由圖上 可以很清楚的看出，TMA0對(duì)MCP-01的穩(wěn)定性有明顯的增強(qiáng)作用，在沒有TMAO存在的條件 下，適冷蛋白酶變性一半的7fe值為49. 5'C，在含有0. 25M的TMAO溶液中，MCP-01的變 性溫度升高為54. 5'C，在含有0. 5M的TMAO溶液中，MCP-01的變性溫度升高為57. 5'C, 繼續(xù)增加TMA0的濃度，變性溫度的升高就不是太明顯了， MCP-01在0. 75M和1. 0M的TMA0 溶液中的變性溫度分別為58.3'C和59.3'C，隨著TMAO濃度的增加，適冷蛋白酶的變性溫 度已經(jīng)接近中溫蛋白酶5"w6 "7iw'/ CaWWarg。
圖4為實(shí)施例1適冷蛋白酶MCP-01在TMA0 (1M)中在40°C下保溫1小時(shí)CD光譜在 222nm處的變化情況。隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，適冷蛋白酶在222nm處的負(fù)峰逐漸減小，在 20分鐘左右二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上完全消失；TMA0(1M)對(duì)MCP-01的保護(hù)作用明顯，在1個(gè)小時(shí) 內(nèi)，加入TMA0 (1M))的適冷蛋白酶溶液在222nm處CD峰沒有明顯的變化，與中溫酶 SubtilisinCarlsberg的保溫實(shí)驗(yàn)類似，說(shuō)明TMAO明顯改善了適冷蛋白酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性， 隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)負(fù)峰逐漸減小，但始終保持較高的a —螺旋含量。
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。在以下實(shí)施例中對(duì)照用中溫蛋白 SubtilisinCarlsberg,購(gòu)自Sigma公司。氧化三甲胺(TMAO)杭州康德權(quán)科技有限公司產(chǎn) 售。實(shí)施例1適冷蛋白酶(編號(hào)MCP-01)的制備按申請(qǐng)人的專利CN1336433 ( 01127405. 0) "適冷風(fēng)味蛋白酶的制備方法及應(yīng)用"。實(shí)施例2適冷菌尸se"f/湖o朋s邵.SM9915分泌適 冷蛋白酶的制備參照論文陳秀蘭等，海洋與湖沼，2003， 34(2), 155-160。
實(shí)施例l、提高適冷蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法
1. 適冷蛋白酶MCP-01的制備
適冷蛋白酶MCP-01來(lái)源于深海適冷菌假交替單胞菌(尸se"Gta3^eiTM o/7assp. SM9913) 分泌的一種胞外蛋白酶，具有明顯的適冷特性，在較高溫度下酶活性顯著降低，結(jié)構(gòu)不穩(wěn) 定。適冷蛋白酶MCP-01的制備參見申請(qǐng)人的專利CN1336433 ( 01127405. 0)"適冷風(fēng)味蛋
白酶的制備方法及應(yīng)用"。
2. 適冷蛋白酶MCP-01的穩(wěn)定化處理
5將適冷蛋白酶MCP-03用Tris—HCl緩沖液(20mM, pH7. 5)配制成lmg/ral的適冷蛋白酶母液，將氧化三甲胺(TMAO)配制摩爾濃度為5M溶液。將適冷蛋白酶母液加入到配制好的5M氧化三甲胺(TMAO)溶液中，再添加Tris—HCl緩沖液(20mM,pH7. 5)至蛋白酶的終濃度為0. 20mg/ml,氧化三甲胺的終濃度為0. 25M— 1M。
3.穩(wěn)定化處理后適冷蛋白酶穩(wěn)定性的測(cè)定
在0. 5ml的E卯endorf管中分別加入0 — 400 y 1 TMAO (5M)濃溶液，然后在每個(gè)管中加入100u 1的濃度lmg/ml蛋白酶母液，所有E卯endorf管最后加入蛋白酶所對(duì)應(yīng)的緩沖液補(bǔ)足到500ii1。蛋白酶的終濃度為0.20mg/ml, TMA0的終濃度為0M—1M。檢測(cè)不同濃度的TMA0對(duì)適冷蛋白酶MCP—03結(jié)構(gòu)的影響，如圖l、 2所示。然后分別檢測(cè)它們的酶活性，熱力學(xué)參數(shù)，熱穩(wěn)定性，以及變構(gòu)溫度。酶活性測(cè)定采用以酪蛋白為底物的福林酚法，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性光譜檢測(cè)同圖3、 4所示。
實(shí)施例2、提高適冷蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法，方法如下
如實(shí)施例1所述，所不同的是適冷蛋白酶是另外一種適冷菌/^et/t/o/ 7朋as sp. SM9915蛋白酶，由一株來(lái)源于深海的適冷菌——假單胞菌SM9915 (/^e"ob歷朋as sp. SM9915)分泌的另一種胞外蛋白酶，具有適冷性，其制備參照論文陳秀蘭等，海洋與湖沼，2003，34(2), 155-160。
權(quán)利要求
1、提高適冷蛋白酶的熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于步驟如下(1)將適冷蛋白酶用20mM、pH7.5的Tris—HCl緩沖液配制成1mg/ml的適冷蛋白酶母液，(2)將氧化三甲胺(TMAO)配制摩爾濃度為5M溶液，(3)將步驟(1)的適冷蛋白酶母液加入到步驟(2)的氧化三甲胺(TMAO)溶液中，再添加20mM、pH7.5的Tris—HCl緩沖液至蛋白酶的終濃度為0.20mg/ml，氧化三甲胺的終濃度為0.25M—1M。
全文摘要
一種提高適冷蛋白酶熱穩(wěn)定性的方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。將適冷蛋白酶用Tris-HCl緩沖液配制成1mg/ml的適冷蛋白酶母液，加入到摩爾濃度為5M氧化三甲胺溶液中，再添加Tris-HCl緩沖液至蛋白酶的終濃度為0.20mg/ml，氧化三甲胺的終濃度為0.25M-1M。本發(fā)明方法應(yīng)用氧化三甲胺對(duì)適冷蛋白酶加以保護(hù)，通過(guò)酶活力檢測(cè)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性檢測(cè)，表明能很好的增強(qiáng)適冷蛋白酶的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12N9/96GK101481683SQ200910013658
公開日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者何海倫, 周百成, 張熙穎, 張玉忠, 陳秀蘭 申請(qǐng)人:山東大學(xué)