專利名稱：一種毛細(xì)血管模型的構(gòu)建方法及其微系統(tǒng)芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)血管模型的構(gòu)建方法及其微系統(tǒng)芯片，此模型基于 微系統(tǒng)技術(shù)結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建，可用于藥物篩選、組織工程、基礎(chǔ)細(xì) 胞生物學(xué)等方面，屬交叉學(xué)科技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
毛細(xì)血管是血液循環(huán)中的末梢，毛細(xì)血管管壁主要由一層內(nèi)皮細(xì)胞
(endothelial cell)和基膜(Basal Lamina)組成，細(xì)的毛細(xì)血管橫切面由一 個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成，較粗的毛細(xì)血管由2 3個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成。常規(guī)的毛細(xì)血管 模型一般利用生物可降解材料作為支架來(lái)培養(yǎng)血管壁的正常細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 重建和再生形成管狀模型。目前已有多種組織工程化血管構(gòu)建模式正在研究 中，并取得一定進(jìn)展，如采用交聯(lián)膠原蛋白包埋聚乙膠酯材料(PGA)為血 管支架，分層種植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的血管平滑肌、內(nèi)皮樣細(xì)胞，并 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，體外構(gòu)建組織工程化小口徑人工血管模型，應(yīng)用于臨床的血管替 代物，以期解決臨床上治療血管狹窄或閉塞導(dǎo)致的缺血性疾病自體血管移植 及血管來(lái)源有限的問(wèn)題。
近幾年，微系統(tǒng)技術(shù)的發(fā)展給基于細(xì)胞培養(yǎng)及組織工程的研究注入活力， 基于微系統(tǒng)技術(shù)的細(xì)胞構(gòu)圖(Cell Patterning)不僅可以根據(jù)不同要求控制細(xì) 胞的空間分布，還可以更好的模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的外環(huán)境(ExtracellularMatrix), 增加細(xì)胞研究的可靠性，可以集成加熱器、微環(huán)境參數(shù)測(cè)定傳感器等用于細(xì) 胞或組織功能的研究，這些在常規(guī)的細(xì)胞組織培養(yǎng)條件下是難以實(shí)現(xiàn)的。
目前，微系統(tǒng)技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞水平、分子生物學(xué)水平的研究也已有很多 的報(bào)道，但是主要還是針對(duì)單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)和相關(guān)性質(zhì)研究。實(shí) 際上，微系統(tǒng)技術(shù)不僅可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操控，也可以根據(jù)組織結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)構(gòu) 建特殊的物理微結(jié)構(gòu)，將組織細(xì)胞按照要求導(dǎo)入微結(jié)構(gòu)，并在片培養(yǎng)，形成
3具有一定組織功能的模型。目前，與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的微系統(tǒng)技術(shù)已有少量報(bào)
道，如Fidkowshi C.等在文獻(xiàn)(Fidkowski C., Kaazempur畫Mofrad M.R., Borenstein J., Vacanti J.R, Langer R.， Endothelialized Microvasculature Based on a Biodegradeble Elastomer, Tissue Engineering, 2005, 11, 302~311)中利用生物 可降解材料通過(guò)微加工技術(shù)制作微管道網(wǎng)絡(luò)，成功實(shí)現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞在微系統(tǒng) 中的培養(yǎng)；Song J.W.等在文獻(xiàn)(Song J.W.， Gu W., Futai N.， Warner K.A.， Nor J.E.， Talayama S., Computer-Controlled Microcirculatory Support System for Endothelial Cell culture and Shearing, Anal. Chem., 2005, 77, 3993~3999)中也 成功地實(shí)現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞在微系統(tǒng)中的培養(yǎng)，并且觀察微系統(tǒng)中液體流動(dòng)對(duì)細(xì) 胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。但是，目前的研究只是局限在細(xì)胞層面，在實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì) 胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上沒(méi)有建立類似毛細(xì)血管組織的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行更深層次的組織工 程學(xué)方面的研究。
本發(fā)明擬基于微系統(tǒng)加工技術(shù)，針對(duì)簡(jiǎn)單組織毛細(xì)血管，設(shè)計(jì)制作用于 內(nèi)皮細(xì)胞有序排布和培養(yǎng)的微芯片系統(tǒng)，形成具有簡(jiǎn)單生理功能的毛細(xì)血管 模型，并且建立毛細(xì)血管功能研究和檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是利用微系統(tǒng)加工技術(shù)，設(shè)計(jì)制作用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有 序排布和培養(yǎng)的微芯片系統(tǒng)，構(gòu)建成具有一定正常生理功能的毛細(xì)血管模型。
本發(fā)明的目的是通過(guò)微系統(tǒng)芯片設(shè)計(jì)和制造、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的導(dǎo)入、 排布、固定和培養(yǎng)、毛細(xì)血管模型功能的測(cè)定三個(gè)主要步驟實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
1) 根據(jù)毛細(xì)血管的組織結(jié)構(gòu)結(jié)合微系統(tǒng)技術(shù)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)芯片， 利用微細(xì)加工技術(shù)制作細(xì)胞培養(yǎng)的微系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括下列核心單元細(xì)胞 培養(yǎng)微通道，給藥通道，給養(yǎng)分通道，出入口， NO測(cè)定電極等。根據(jù)細(xì)胞 培養(yǎng)要求，調(diào)節(jié)微系統(tǒng)中的微環(huán)境，包括流速控制、壓力控制、體積控制、 溫度控制、溶液混和、液體分配與驅(qū)動(dòng)等。
2) 采用微量注射泵將培養(yǎng)液、內(nèi)皮細(xì)胞及其它成分導(dǎo)入微系統(tǒng)中，利用 設(shè)計(jì)的物理微結(jié)構(gòu)及表面特性將細(xì)胞分布在特定的區(qū)域，利用細(xì)胞培養(yǎng)箱的 條件進(jìn)行細(xì)胞在片培養(yǎng)。3)在微芯片管道中設(shè)計(jì)制作NO微電極，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的擴(kuò)血管因子
NO的濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；在導(dǎo)入使血管舒張/收縮的藥物成分的作用下，檢 測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)變化，細(xì)胞之間的間距變化，選用特定的指示劑，測(cè)定藥 物作用前后指示劑在管內(nèi)和管外的濃度改變，判定血管壁通透性的變化。
本發(fā)明構(gòu)建的毛細(xì)血管模型可以用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和觀測(cè)， 能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的擴(kuò)血管因子NO的濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，管壁的通透性可 隨著外加剌激的不同發(fā)生改變，大致模擬正常生理?xiàng)l件下毛細(xì)血管功能，該 模型可用于心血管藥物有效成分的篩選。
本發(fā)明不僅闡述了一種基于微系統(tǒng)技術(shù)的毛細(xì)血管模型的構(gòu)建方法，還 提供一種細(xì)胞培養(yǎng)微系統(tǒng)芯片的制作方法，該微系統(tǒng)芯片適合于細(xì)胞的導(dǎo)入、 排布、固定和在片培養(yǎng)。


圖i為本發(fā)明實(shí)施例的毛細(xì)血管模型總體結(jié)構(gòu)示意圖，其中，i和r分
別為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及培養(yǎng)基的進(jìn)口和出口； 2和2'分別為毛細(xì)血管內(nèi)基 質(zhì)的進(jìn)口和出口； 3和3'分別為毛細(xì)血管外基質(zhì)的進(jìn)口和出口。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)芯片A-A'截面圖，其中，4為聚合物 PDMS芯片；5為載波片；6為培養(yǎng)中的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。
圖3為本發(fā)明實(shí)施例毛細(xì)血管模型芯片的俯視圖，其中，7為NO測(cè)定 電極；8為毛細(xì)血管外基質(zhì)；9為單層排列毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞；10為毛細(xì)血 管內(nèi)基質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的一種具體實(shí)施過(guò)程。 在下述實(shí)施例中，使用的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)指的分別是兩排細(xì)胞 外側(cè)和內(nèi)側(cè)的溶液環(huán)境。
如圖2所示，本方面提供的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片，由聚二甲基硅氧烷(PDMS) 芯片和載玻片通過(guò)鍵合形成，該P(yáng)DMS芯片包括PDMS基底以及位于其上的 2對(duì)(4個(gè))微壩結(jié)構(gòu)，2對(duì)微壩結(jié)構(gòu)間距為100-120um，每對(duì)微壩結(jié)構(gòu)包括2個(gè)間距為的30-40um的微壩，該微壩與載玻片間間隙高度為3-5um，從而， 微壩結(jié)構(gòu)內(nèi)的空間可用于細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞的固定培養(yǎng)，以形成2排(每個(gè) 微壩結(jié)構(gòu)內(nèi)可形成l排)單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而培養(yǎng)基及藥物可以自由通過(guò)。
由于PDMS芯片和載玻片進(jìn)行了鍵合，因此，如圖1所示，PDMS芯片 上的微壩結(jié)構(gòu)將所述細(xì)胞培養(yǎng)微芯片隔成5個(gè)通過(guò)微壩與載玻片間間隙相通 的微管道，分別是2對(duì)微壩結(jié)構(gòu)之間的細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)微管道(即毛細(xì)血管內(nèi)基 質(zhì)進(jìn)口 2和出口 2'間的管道，寬度為100-120um，可用于加入細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)、 藥物和/或檢測(cè)標(biāo)記物)，微壩結(jié)構(gòu)內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)微管道各1條(即毛細(xì) 血管內(nèi)皮細(xì)胞及培養(yǎng)基進(jìn)口 l和出口 l，間的管道，寬度為30-40um，可用于 加入培養(yǎng)基和/或藥物)，以及位于2條內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)微管道各自外側(cè)的細(xì)胞 外基質(zhì)微管道各1條(即毛細(xì)血管外基質(zhì)進(jìn)口 3和出口 3'間的管道，寬度為 200-500um，可用于加入細(xì)胞外基質(zhì)、藥物和/或檢測(cè)標(biāo)記物)。
如圖3所示，該芯片還可以包括用于測(cè)定毛細(xì)血管內(nèi)溶液和/或毛細(xì)血管 外溶液的物質(zhì)濃度的檢測(cè)電極，如NO電極7等。
微芯片選用具有良好透氣性和生物相容性的聚二甲基硅氧垸(PDMS) 材料與常規(guī)載波片鍵合形成細(xì)胞培養(yǎng)微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。微通道和壩型微結(jié)構(gòu) 采用聚合物微加工工藝(Poly-MEMS)制作，制作過(guò)程包括SU-8模具制造， PDMS塑性成型及與載玻片鍵合三個(gè)關(guān)鍵步驟，制造過(guò)程簡(jiǎn)單闡述如下在 硅片正面甩涂一層SU-8 2050光刻膠，前烘固化；將第一塊掩膜板與基片對(duì) 準(zhǔn)，紫外線曝光，微管道圖形轉(zhuǎn)移到第一層SU-8光刻膠上；后烘后，在第 一層SU-8表面再甩涂一層SU-8 2005光刻膠，前烘固化；將第二塊掩膜板與 基片對(duì)準(zhǔn)，紫外線曝光，將掩膜板上的壩型微結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到第二層SU-8光刻 膠上；第二層SU-8光刻膠后烘；用SU-8顯影液對(duì)兩層SU-8結(jié)構(gòu)同時(shí)顯影， 異丙醇沖洗，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈桑坏玫蕉鄬覵U-8模具。將PDMS前 聚體和固化劑混合物倒入SU-8模具中，放入65。C烘箱中，烘焙l小時(shí)；將 固化后的PDMS芯片4從模具上揭下來(lái)，打孔后備用。
電極7采用lift-off技術(shù)制作在載玻片5上。制作過(guò)程簡(jiǎn)單闡述如下首 先，將載玻片清洗烘干；甩涂正性光刻膠AZ4620,烘干，曝光，顯影；電 子束蒸發(fā)金屬層Pt;最后在丙酮中剝離多余金屬形成電極7的圖形。在載玻 片5上制備電極7后將其烘干備用。最后，將制備好的PDMS和載玻片5鍵合形成完整的細(xì)胞培養(yǎng)芯片。 在內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)入之前將制作好的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片用75%的酒精浸潤(rùn)，然 后放入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)皿(polystyrene Petri dish)中，用紫外線照射lh，進(jìn)行 消毒。為利于細(xì)胞在微通道內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，在微通道內(nèi)導(dǎo)入含血清的培養(yǎng)液浸 潤(rùn)過(guò)夜，使芯片表面包被蛋白。
細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM (Gibco)，加入10%的胎牛血清(杭州四季青生物 工程材料有限公司)和100ul/ml的鏈青霉素(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司， 杭州)，消化液為0.25%的胰酶和0.02%的EDTA (吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公 司，杭州)。
由微量注射泵將培養(yǎng)基和內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)入微芯片，在C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培 養(yǎng)，每隔48小時(shí)更新一次培養(yǎng)液。待芯片內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞6分裂、增值、遷移 形成緊密的雙排單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)9，如圖3所示，建立起類似毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)的 模型，進(jìn)行毛細(xì)血管功能學(xué)方面的研究。
圖1中的1 口為剌激藥物的導(dǎo)入口，可分別選用止血類藥物，如安絡(luò)血、 維生素K等，能降低毛細(xì)血管的通透性，促使毛細(xì)血管收縮，或者選用胰激 肽原酶等可以引起毛細(xì)血管擴(kuò)張的藥物導(dǎo)入微系統(tǒng)中，觀察毛細(xì)血管模型的 反應(yīng)。在圖1中2 口處加入熒光標(biāo)記的殼聚糖大分子物質(zhì)，通過(guò)每隔半小時(shí) 在熒光顯微鏡中觀察圖3中8和IO兩處的熒光強(qiáng)度比值分析毛細(xì)血管模型的 通透性，也可在圖1中1 口導(dǎo)入異硫氰酸熒光黃標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽孵育，觀察 內(nèi)皮細(xì)胞骨架的變化，驗(yàn)證毛細(xì)血管模型的功能。同時(shí)可利用圖3中NO電 極7所示的測(cè)定電極測(cè)試在刺激情況下內(nèi)皮細(xì)胞代謝的NO濃度變化。
本發(fā)明提供的微芯片可用于構(gòu)建毛細(xì)血管模型，以進(jìn)行觀測(cè)，該模型可 以大致模擬正常生理?xiàng)l件下的毛細(xì)血管功能，并用于心血管藥物有效成分的 篩選。
雖然本發(fā)明只提供了圖2所示的具有2對(duì)微壩結(jié)構(gòu)的芯片，但對(duì)于本領(lǐng) 域的技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明提供的教導(dǎo)和暗示，根據(jù)實(shí)際需要，可制造 具有l(wèi)對(duì)或更多對(duì)微壩結(jié)構(gòu)的芯片，是顯而易見(jiàn)的，因此，也是本發(fā)明所需 要保護(hù)的內(nèi)容。所述芯片可用于細(xì)胞培養(yǎng)，以形成1排或多排緊密單層細(xì)胞 結(jié)構(gòu)，構(gòu)建所需要的模型，然后利用藥物進(jìn)行刺激，以檢測(cè)所述細(xì)胞結(jié)構(gòu)2 側(cè)溶液或進(jìn)行其他的研究。
權(quán)利要求
1、一種細(xì)胞培養(yǎng)微芯片，其特征在于，所述芯片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片和載玻片鍵合形成，所述PDMS芯片包括PDMS基底以及位于其上的1對(duì)或多對(duì)微壩結(jié)構(gòu)，所述微壩結(jié)構(gòu)包括2個(gè)間距為的30-40um um微壩，所述微壩與載玻片間間隙高度為3-5um。
2、 如權(quán)利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片包括2對(duì)間距為 100-120um的微壩結(jié)構(gòu)。
3、 如權(quán)利要求2所述的芯片，其特征在于，所述微壩結(jié)構(gòu)將所述細(xì)胞培 養(yǎng)微芯片隔成5個(gè)通過(guò)微壩與載玻片間間隙相通的微管道，所述微管道分別 為2對(duì)微壩結(jié)構(gòu)之間的細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)微管道，微壩結(jié)構(gòu)內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)微管 道各1條，以及位于2條內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)微管道各自外側(cè)的細(xì)胞外基質(zhì)微管道 各1條。
4、 如權(quán)利要求3所述的芯片，其特征在于，所述芯片還包括用于測(cè)定細(xì) 胞內(nèi)基質(zhì)溶液和/或細(xì)胞外基質(zhì)溶液的物質(zhì)濃度的檢測(cè)電極。
5、 如權(quán)利要求4所述的芯片，其特征在于，所述檢測(cè)電極為NO檢測(cè)電 極。
6、 如權(quán)利要求1一5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)微芯片的制備方法，其特 征在于，所述方法包括SU-8模型制備、PDMS塑性成型以及PDMS芯片與 載玻片鍵合的步驟。
7、 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 在硅片正面甩涂一層SU-8 2050光刻膠，前烘固化；將第一塊掩膜板與基片對(duì)準(zhǔn)，紫外線曝光，微管道圖形轉(zhuǎn)移到第一層SU-8光刻膠上；后烘后， 在第一層SU-8表面再甩涂一層SU-8 2005光刻膠，前烘固化；將第二塊掩膜 板與基片對(duì)準(zhǔn)，紫外線曝光，將掩膜板上的壩型微結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到第二層SU-8 光刻膠上；第二層SU-8光刻膠后烘；用SU-8顯影液對(duì)兩層SU-8結(jié)構(gòu)同時(shí) 顯影，異丙醇沖洗，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈桑坏玫蕉鄬覵U-8模具。將PDMS 前聚體和固化劑混合物倒入SU-8模具中，放入65t:烘箱中，烘焙l小時(shí)； 將固化后的PDMS芯片從模具上揭下來(lái)，打孔后和載玻片鍵合形成細(xì)胞培養(yǎng)心片o
8、 如權(quán)利要求l一5中任一項(xiàng)所述的芯片用于細(xì)胞培養(yǎng)形成1排或多排 緊密單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)后進(jìn)行刺激，并檢測(cè)所述細(xì)胞結(jié)構(gòu)2側(cè)溶液的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明闡述了一種毛細(xì)血管模型的構(gòu)建方法及其微系統(tǒng)芯片，利用微系統(tǒng)加工技術(shù)，設(shè)計(jì)制作用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有序排布和培養(yǎng)的微芯片系統(tǒng)。通過(guò)微系統(tǒng)芯片設(shè)計(jì)和制造、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的導(dǎo)入、排布、固定和培養(yǎng)、毛細(xì)血管模型功能的測(cè)定三個(gè)主要步驟，構(gòu)建成具有一定正常生理功能的毛細(xì)血管模型。該毛細(xì)血管模型可以用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和觀測(cè)，能對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的擴(kuò)血管因子NO的濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定，管壁的通透性可隨著外加刺激的不同發(fā)生改變，大致模擬正常生理?xiàng)l件下毛細(xì)血管功能，可用于心血管藥物有效成分的篩選。
文檔編號(hào)C12M3/00GK101451105SQ200810208130
公開(kāi)日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者吳建璋, 趙建龍, 邵建波, 鄭允煥, 金慶輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所