專利名稱：一種高效發(fā)酵生產(chǎn)l-谷氨酸的方法
一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，屬于發(fā)酵法 生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
在整個(gè)氨基酸生產(chǎn)工業(yè)中，谷氨酸的生產(chǎn)占有極為重要的地 位，其產(chǎn)量約占氨基酸總產(chǎn)量的2/3以上。谷氨酸單鈉即味精，具有強(qiáng)烈的 鮮味，是目前世界上用量最大的調(diào)味品。此外，谷氨酸在醫(yī)藥、化妝品和工 業(yè)上也有著廣泛的應(yīng)用。谷氨酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，1957年Kinoshita 等人首次成功以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸后，微生物發(fā)酵法成為谷氨酸生產(chǎn) 的主要方法，其工業(yè)化規(guī)模也逐年擴(kuò)大。目前，谷氨酸發(fā)酵的生產(chǎn)技術(shù)已相 當(dāng)成熟。近年來(lái)，隨著原材料價(jià)格的不斷上漲和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的愈加激烈，為了 在提高谷氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的同時(shí)能夠降低生產(chǎn)成本，仍有大量關(guān)于谷氨酸 發(fā)酵方面的研究報(bào)道，主要集中在基因工程手段定向選育谷氨酸高產(chǎn)菌株、 發(fā)酵過(guò)程控制與優(yōu)化和新原料的開發(fā)等方面。谷氨酸生產(chǎn)菌屬于營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，能在胞外大量積累谷氨酸是由于菌 體的代謝處于異常狀態(tài)，對(duì)環(huán)境條件非常敏感。發(fā)酵條件如生物素、碳源、 氮源、無(wú)機(jī)鹽、pH、溫度及溶氧等對(duì)谷氨酸的合成都具有重要影響。其中， 底物(如葡萄糖)濃度是控制菌體代謝過(guò)程的一個(gè)重要參數(shù)，主要通過(guò)控制 相關(guān)酶的合成或活性影響菌體的代謝途徑。葡萄糖可通過(guò)"葡萄糖效應(yīng)"阻 遏、抑制多種酶的合成，如氨基酸合成酶等，這種阻遏作用主要是其分解代 謝物引起的。在以葡萄糖為碳源的谷氨酸發(fā)酵中，葡萄糖的分解代謝物阻遏 會(huì)引起多種副產(chǎn)物如乳酸的積累，從而影響糖酸轉(zhuǎn)化率。此外.，溶氧也是一 個(gè)至關(guān)重要的因素，雜酸的產(chǎn)生和碳架的浪費(fèi)與溶解氧濃度密切相關(guān)。因此在發(fā)酵過(guò)程中必須恰當(dāng)控制溶氧，以改變代謝流分布，增大L-谷氨酸產(chǎn)率，減 少雜酸的生成。目前，我國(guó)谷氨酸發(fā)酵行業(yè)主要采用分批發(fā)酵模式。在這種生產(chǎn)模式中， 維持一定的底物(如葡萄糖)濃度對(duì)于谷氨酸的發(fā)酵非常重要。為達(dá)到經(jīng)濟(jì) 技術(shù)的要求，要提高單批次發(fā)酵過(guò)程中的谷氨酸產(chǎn)量就要提高初始培養(yǎng)基中 的底物(如葡萄糖)濃度，但底物(如葡萄糖)濃度過(guò)高引起滲透壓過(guò)大， 影響菌體的正常代謝及谷氨酸的產(chǎn)量。反之，初始葡萄糖濃度較低有利于菌 體的生長(zhǎng)，但后期發(fā)酵液中的殘?zhí)茄杆俸谋M，其生產(chǎn)能力不能得到最大限度 的發(fā)揮。與此同時(shí)，在目前的生產(chǎn)模式中，溶氧濃度往往不能得到很好的控 制，不是供氧不足就是供氧過(guò)量，而且溶氧水平浮動(dòng)很大，不能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定 的維持在一個(gè)恰當(dāng)?shù)乃缴?。在溶氧過(guò)低的條件下，TCA循環(huán)代謝流量減小， 不足以平衡葡萄糖酵解速率，從而刺激了乳酸脫氫酶的酶活，使代謝流轉(zhuǎn)向 乳酸生成，造成乳酸積累；而溶氧過(guò)高時(shí)，谷氨酸脫氫酶酶活明顯降低，且 TCA循環(huán)流量加大，生成大量C02，造成碳源損失，兩種情況均不利于谷氨酸 生成。此外，現(xiàn)有的很多L-谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基配方都不能很好的最大限度去 滿足其相應(yīng)生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酸要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的谷氨酸生產(chǎn)方法發(fā)酵產(chǎn)酸量較 低、糖酸轉(zhuǎn)化率低等缺陷，提供一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。在不增 加額外設(shè)備和人力投入的情況下，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)發(fā)酵周期的縮短和L-谷氨酸產(chǎn) 量和轉(zhuǎn)化率的大幅提高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。 本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供的一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括種子培養(yǎng)和進(jìn)行 好養(yǎng)發(fā)酵，其特征是發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧控制在適當(dāng)?shù)乃缴?，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程既不產(chǎn)生較多乳酸，也不導(dǎo)致由于TCA 循環(huán)流量加大生成大量C02而造成碳源大量流失，通過(guò)流加氨水控制pH, 通過(guò)流加適量泡敵消泡，并通過(guò)流加一定濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃谝?定水平，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中既不產(chǎn)生葡萄糖抑制，也不構(gòu)成底物限制，發(fā)酵 至32h停止。該方法的具體步驟如下(1) 培養(yǎng)種子配制種子培養(yǎng)基[葡萄糖2.5%、玉米槳3%、豆?jié)?%、 K2HP04'3H20 0.2%、 MgSO4'7H2O0.10/0、尿素0.025%]， 115。C滅菌15min;將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量一般為5%;在適宜的溫度、pH和溶氧條件下于5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。(2) 好氧發(fā)酵將步驟(1)制得的種液以10%~20%接種量接種發(fā)酵， 控制發(fā)酵液溫度采用順序提溫模式:0 5h為34t:， 5-10h為35。C， 10~18h為 36°C， 18 26h為37。C， 26 32h為38。C;通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速， 采用分階段供氧模式控制溶氧0 10h為20。/。， 10 32h為5。/。；通過(guò)自動(dòng)流 加氨水控制pH在7.0~7.2;通過(guò)流加適量泡敵消泡；.并通過(guò)流加濃度為 500~800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?.5~2.0%，發(fā)酵至32h停止。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果與現(xiàn)有工藝相比，本發(fā)明的方法具有以下特點(diǎn) 1、本發(fā)明通過(guò)適當(dāng)流加較高濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)菨舛瓤刂圃谇?當(dāng)水平，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中既不因葡萄糖濃度過(guò)高而引起滲透壓過(guò)大且 產(chǎn)生"葡萄糖效應(yīng)"阻遏分解代謝物，也不因葡萄糖濃度過(guò)低而構(gòu)成底 物限制，使發(fā)酵液中的殘?zhí)茄杆俸谋M，導(dǎo)致菌種生產(chǎn)能力不能得到最大 限度的發(fā)揮；2、 本發(fā)明通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧濃度控制在恰 當(dāng)?shù)乃缴?，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中既不因溶氧濃度過(guò)低導(dǎo)致TCA循環(huán)代謝 流量減小，不足以平衡葡萄糖酵解速率，從而刺激了乳酸脫氫酶的酶活， 使代謝流轉(zhuǎn)向乳酸生成，造成乳酸積累，也不因溶氧濃度過(guò)高導(dǎo)致谷氨 酸脫氫酶酶活明顯降低，TCA循環(huán)流量加大生成大量C02而造成碳源的 大量流失；3、 本發(fā)明在與現(xiàn)有生產(chǎn)工藝相比不增加任何額外設(shè)備和人力投入的情況下，縮短了整個(gè)發(fā)酵周期，種子培養(yǎng)縮短至5 6h，并大幅提高了L-谷氨酸的產(chǎn)量(150g/L以上)和轉(zhuǎn)化率(60°/。以上)，整個(gè)工藝過(guò)程操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本較低，經(jīng)濟(jì)效益顯著，十分適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:使用的微生物菌種為現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌。用上述菌株進(jìn)行高效發(fā)酵，所 用培養(yǎng)基有兩種(1) 種子培養(yǎng)基葡萄糖2.5%、玉米漿3%、豆?jié)?%、K2HPO4'3H2O0.2%、 MgSO4'7H2O0.1%、尿素0.025%。用NaOH和鹽酸調(diào)pH至7.0~7.2， 115°C 滅菌15min。(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖8%、甘蔗糖蜜0.1%、玉米漿0.4%、MgSO4.7H2O 0.15%、 Na2HP04'12H20 0.2%、 KC1 0.10/o、 MnS04 0.0001%、 FeS04 0細(xì)1%、 VB1 0.00001%。用NaOH和鹽酸調(diào)pH至7.0-7.2， 115。C滅菌15min。將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為5%;在32"C、 pH為7.0和溶氧為20M 條件下于5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)6h至對(duì)數(shù)期，按10%的接種量接入含有發(fā) 酵培養(yǎng)基的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵液溫度采用順序提溫模式:0~5h為34。C, 5-10h為35。C， 10 18h為36。C， 18 26h為37。C， 26 32h為38。C，逋入適 當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段供氧模式控制溶氧0~1011為20%， 10~3211為5%，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0 7.2，通過(guò)流加適量泡敵消泡， 并通過(guò)流加濃度為500g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?.5n/。，發(fā)酵至32h停止。 L-谷氨酸的產(chǎn)量為150g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為60%。 實(shí)施例2:使用的微生物菌種為現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌。用上述菌株進(jìn)行高效發(fā)酵，所用 培養(yǎng)基有兩種(1) 種子培養(yǎng)基同實(shí)施例l。(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10%、甘蔗糖蜜0.15%、玉米漿0.6%、MgSO4-7H2O0.18%、 Na2HPO4-12H2O0.25%、 KC10.13%、 MnS04 0扁20/0、 FeS04 0.0002%、 VB1 0.00002%。用NaOH和鹽酸調(diào)pH至7.0-7.2， 115。C滅 菌15min。將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為5%;在32。C、 pH為7.0和溶氧為20。/。 條件下于5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)6h至對(duì)數(shù)期，按15%的接種量接入含有發(fā) 酵培養(yǎng)基的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵液溫度采用順序提溫模式:0~5h 為34。C， 5-10h為35。C， 10 18h為36。C， 18 26h為37。C， 26 32h為38。C，通入適當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段供氧模式控制溶氧0 1011為20%，1(K32h為5。/。，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0 7.2，通過(guò)流加適量泡敵消泡， 并通過(guò)流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?.5 2.0。/。，發(fā)酵至32h停 止。L-谷氨酸的產(chǎn)量為151g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為61%。 實(shí)施例3:使用的微生物菌種為現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌。用上述菌株進(jìn)行高效發(fā)酵，所用培養(yǎng)基有兩種-(1) 種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖12%、甘蔗糖蜜0.2%、玉米漿0.8%、 MgS04.7H20 0.2%、 Na2HP04'12H20 0.3%、 KC1 0.15%、 MnS04 0.0003%、 FeS04 0.0003%、 VB1 0.00003%。用NaOH和鹽酸調(diào)pH至7.0 7.2, 115。C滅 菌15min。將菌種接入種子培養(yǎng)基中，接種量為5%;在32"C、 pH為7.0和溶氧為20M 條件下于5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中培養(yǎng)6h至對(duì)數(shù)期，按20%的接種量接入含有發(fā) 酵培養(yǎng)基的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵液溫度采用順序提溫模式:0~5h 為34。C， 5-10h為35。C, 10 18h為36。C， 18 26h為37。C， 26 32h為38。C,通入適 當(dāng)空氣，調(diào)節(jié)適當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速，采用分階段供氧模式控制溶氧0~1011為20%， 10 32h為5。X)，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控帝iJpH在7.0 7.2，通過(guò)流加適量泡敵消泡， 并通過(guò)流加濃度為800^的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?.0%，發(fā)酵至32h停止。 L-谷氨酸的產(chǎn)量為153g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為63%。
權(quán)利要求
1.一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括種子培養(yǎng)和進(jìn)行好養(yǎng)發(fā)酵，其特征是發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧控制在適當(dāng)?shù)乃缴?，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程既不產(chǎn)生較多乳酸，也不導(dǎo)致由于TCA循環(huán)流量加大生成大量CO2而造成碳源大量流失，通過(guò)流加氨水控制pH，通過(guò)流加適量泡敵消泡，并通過(guò)流加一定濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃谳^低水平，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中既不產(chǎn)生葡萄糖抑制，也不構(gòu)成底物限制，發(fā)酵至32h停止。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵液的溫度為順序 控制溫度的方法:0 5h為34。C， 5 10h為35。C， 10 18h為36。C， 18 26h為37 。C， 26 32h為38°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵液的溶氧濃度為 分階段控制0~1011為20%， 10~3211為5%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述發(fā)酵液中各組分占總量 的百分比為接種量10~20%,葡萄糖8~12%,甘蔗糖蜜0.1~0.2%，玉米槳 0.4~0.8% ， MgS04 .7H20 0.15~0.2% ， Na2HP04-12H20 0.2~0.3% ， KC1 0.1~0.15% ， MnS04 0.0001~0.0003% ， FeS04 0.0001~0.0003% ， VB1 00001~0細(xì)03%。
全文摘要
一種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。解決現(xiàn)有生產(chǎn)工藝產(chǎn)酸量較低且糖酸轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題。本發(fā)明包括以生物素缺陷型菌株為生產(chǎn)菌株，以一些營(yíng)養(yǎng)組分按一定比例配制成營(yíng)養(yǎng)豐富且均衡的培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速和風(fēng)量將溶氧控制在適當(dāng)?shù)乃缴?，通過(guò)流加氨水控制pH，并通過(guò)流加一定濃度的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃谳^低水平，發(fā)酵至32h停止。本發(fā)明在不增加任何額外設(shè)備和人力投入的情況下，縮短了整個(gè)發(fā)酵周期，并大幅提高了L-谷氨酸的產(chǎn)量(150g/l以上)和轉(zhuǎn)化率(60％以上)，整個(gè)工藝過(guò)程操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本較低，十分適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P13/14GK101402979SQ20081015288
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日 公開號(hào)200810152883.發(fā)明者劉淑云, 翔 宋, 徐慶陽(yáng), 謝希賢, 寧 陳 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué) 被以下專利引用 (1),