專利名稱：用于鑒定新的味覺細(xì)胞基因和咸味受體靶標(biāo)的原理、方法和測定以及使用這些鑒定基因 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在其寬的實(shí)施方案中鑒定一組新的基因，其在化學(xué)感覺或 更多特異的味覺細(xì)胞，例如小鼠輪廓(circumvallate)味覺細(xì)胞，以 及可能來源于其它哺乳動(dòng)物如人類和非人類靈長類動(dòng)物的味覺(例如 輪廓的)細(xì)胞中特異表達(dá)。因?yàn)檫@些基因在味覺細(xì)胞中的特異表達(dá)， 所以它們在此相當(dāng)于"味道-特異的"基因。然而，這些味道-特異基 因包括直接或間接地涉及味道檢測和調(diào)節(jié)如有咸味、鮮味、甜味、酸 味、油脂味、金屬味或苦味傳感的基因以及包括涉及生物學(xué)功能而不 直接與味道檢測如消化的調(diào)節(jié)、味覺細(xì)胞更新、免疫系統(tǒng)特別是口腔 調(diào)節(jié)、以及如碳水化合物代謝、糖尿病、肥胖病、惡病質(zhì)、消化期間 食物檢測等的新陳代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。
與上述相關(guān)的本發(fā)明提供了一組新的基因，其在小鼠化學(xué)感覺(例 如小鼠輪廓味覺細(xì)胞)中特異表達(dá)，在舌細(xì)胞中不表達(dá)或顯著地低表 達(dá)，所述基因用于篩選檢測法，優(yōu)選高流通量篩選檢測法以鑒定直接 或間接調(diào)節(jié)不同味道形式如咸味、鮮味、甜味、酸味、油脂味或金屬 味的化合物。
進(jìn)一步地，與上述相關(guān)的本發(fā)明提供了一組新的基因和相應(yīng)基因 產(chǎn)物或表達(dá)改基因的細(xì)胞，其用于篩選檢測法，優(yōu)選高流通量篩選檢測法以鑒定化合物，所述化合物例如用作消化系統(tǒng)病癥如癌癥和自身 免疫病癥的治療中的治療劑，用于調(diào)節(jié)味覺細(xì)胞凋亡或味覺細(xì)胞更新， 用于誘導(dǎo)味覺細(xì)胞再生，用于影響口腔中免疫的調(diào)節(jié)和例如治療糖尿 病、肥胖病、進(jìn)食障礙和其它代謝失調(diào)中的新陳代謝調(diào)節(jié)。 此外，與上述相關(guān)的本發(fā)明提供了一組新的基因，其用 于鑒定和/或分離和/或富集味覺或化學(xué)感覺細(xì)胞的特異類型或譜系， 例如涉及特異味覺形態(tài)、口腔中免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、味覺細(xì)胞凋亡或味覺 細(xì)胞更新、味覺細(xì)胞再生、消化系統(tǒng)調(diào)節(jié)和新陳代謝調(diào)節(jié)的味覺或化 學(xué)感覺細(xì)胞，這些細(xì)胞有助于食物檢測、涉及饑餓感和消化的激素或 酶的分泌等。 進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及這些分離的化學(xué)感覺或味覺細(xì)胞 在篩選檢測法中用于鑒定調(diào)節(jié)味覺的化合物以及在鑒定調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng) 的治療劑中的用途，特別是口腔免疫內(nèi)環(huán)境平衡的調(diào)節(jié)、味覺細(xì)胞凋 亡的調(diào)節(jié)、更新或味覺細(xì)胞再生和增殖、涉及消化的激素或酶及其它 味覺細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)、消化系統(tǒng)病癥如口腔或消化系統(tǒng)癌癥、自身免 疫或炎性消化障礙的治療、糖尿病、肥胖病、進(jìn)食障礙或其它代謝失 調(diào)等的治療。 更具體地說，本發(fā)明提供了分離、純化和標(biāo)記想得到的 味覺細(xì)胞類型和味覺包括如鮮味、甜味、咸味、苦味、油脂味、酸味、 金屬味的細(xì)胞鐠系以及包括分化成味蕾細(xì)胞、味覺細(xì)胞神經(jīng)元、味覺
免疫細(xì)胞等細(xì)胞的味覺干細(xì)胞和其它味覺細(xì)胞譜系的方法，這些細(xì)胞 基于一種或多種在此提供的味覺特異基因的表達(dá)。這些分離和提純法 包括陽性和陰性細(xì)胞分離法。例如通過陽性細(xì)胞選擇方法分離，如通 過使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，磁珠細(xì)胞選擇如通過目視鑒定想 得到的細(xì)胞如通過使用電生理學(xué)抗體包被小球的個(gè)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞來分離 想得到的細(xì)胞i普系活類型。另外地，通過陰性細(xì)胞純化和隔離法可以 回收或純化想得到的味覺細(xì)胞謙系或類型，其中通過除去一個(gè)或多個(gè) 不想要的細(xì)胞鐠系，從混合細(xì)胞群體中富集或純化想得到的細(xì)胞類型， 例如通過接觸包含想得到的味覺細(xì)胞和不想要的味覺細(xì)胞的混合細(xì)胞群體于對(duì)靼基因特異的細(xì)胞毒素的抗體接觸，所述靶基因在將被除去 的不想要的味覺細(xì)胞類型上表達(dá)。
本發(fā)明還涉及標(biāo)記物的用途，例如對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)味
覺特異基因在舌和口腔映射區(qū)域特異性的抗體或低聚核苷酸，其涉及 特異性味覺和非特異性功能，胃腸道和表達(dá)特異性味覺特異基因的相 關(guān)器官特異性區(qū)域的映射，因此其涉及一個(gè)或多個(gè)在此公開的味覺細(xì)
胞特異性功能，和/或在味覺細(xì)胞分化研究中目標(biāo)基因的用途，例如用 于鑒定誘導(dǎo)味覺干細(xì)胞和其它多能性或未成熟細(xì)胞類型分化為想得到 的味覺細(xì)胞語系和味覺細(xì)胞類型的化合物。 更具體地說，本發(fā)明涉及鑒定和表征新的味覺特異基因 (包括起咸味受體靶標(biāo)作用的那些基因)的新的原理、方法和測定(包 括電生理學(xué)的測定)。本發(fā)明還涉及鑒定如咸味增強(qiáng)劑的調(diào)節(jié)劑和調(diào) 節(jié)人類咸味感覺的用途，以及用于治療或預(yù)防與鈉轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收如高血 壓、低血壓、體液滯留、心臟病和中風(fēng)有關(guān)的病癥。
背景技術(shù)：
上皮鈉通道(ENaC)是離子通道ENaC/退化蛋白家族的 成員，其包括哺乳動(dòng)物中酸敏感離子通道(ASIC)、蝸桿中機(jī)械敏感 性退化蛋白通道和軟體動(dòng)物中FMRF-肽酰胺門控通道(Kellenger， S. and Schild， L. ( 2002 ) Physiol. Rev. 82: 735-767 ) 。 ENaC介導(dǎo) 氨氯吡嗪脒敏感性頂膜Na+通過許多組織包括腎、結(jié)腸和肺的高阻力上 皮轉(zhuǎn)運(yùn)。 已知ENaC是異源三聚體通道，其由oc 、 P和y亞基或△、 13和Y亞基組成。該異源三聚體通道已推定涉及人類咸味感知。通過 現(xiàn)在的受讓人使用ENaC序列發(fā)展先前的測定法鑒定化合物，如果這些 化合物潛在地調(diào)節(jié)人類咸味感知，那么調(diào)節(jié)A P Y和oc p y人類 ENaC以檢驗(yàn)。同時(shí)，這些化合物潛在地可能用來治療包含異常ENaC 功能的人類病變。 不同于其它哺乳動(dòng)物，已經(jīng)報(bào)道氨氯吡溱脒僅僅輕微地 降低氯化鈉味覺的強(qiáng)度，即當(dāng)使用在濃度為約15-20%氯化鈉特異性調(diào)
20節(jié)ENaC功負(fù)巨(Halpern， B. P. ( 1998 ) Neuroscience and Behavioral Reviews. 23: 5-47 )。通過發(fā)明人實(shí)施試驗(yàn)已顯示了當(dāng)高于cc P y ENaC水平300倍(對(duì)于氨氯吡溱脒)和3000倍(對(duì)于benzami 1 ) IC5Q 值時(shí)(相當(dāng)于高于A P Y ENaC ICs。值10倍(對(duì)于氨氯吡溱脒)和 100倍(對(duì)于benzamil))，氨氯吡溱脒或更有效的氨氯吡溱脒衍生 物phenamil不會(huì)引起人類咸度察覺顯著的影響。因此，其它非ENaC 基因可能涉及人類咸味。 此外，最近已有報(bào)道說味覺受體可以在非口腔組織如在 消化系統(tǒng)和潛在其它的器官如腎中表達(dá)。特別是巳有報(bào)道說甜味、苦 味和鮮味味覺受體在除了 口腔如胃腸細(xì)胞的細(xì)胞中表達(dá)(參見如 Sternini 等人，Amer J Physiol. Gastrointestinal and Liver Physiology, 292: G457-G461, 2007; Mace， 0. J. et al， J. Physiology. 10:1113〃. Physiol. 2007.130906. Publ ished onl ine May 10， 2007 )。此外，很可能咸味受體在泌尿道中表達(dá)?；谏鲜?， 味覺受體推定涉及不直接與品嘗功能如消化功能如口腔或消化道的胃 動(dòng)力、吸收、食物檢測、代謝功能和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的功能，并且同時(shí) 可能影響與鈉吸收、排泄和轉(zhuǎn)運(yùn)如血壓和體液滯留相關(guān)的功能。因此，
助于更好理解這些味覺受體的其它非味覺功能，以及也有利于這些基 因、基因產(chǎn)物和表達(dá)該基因的細(xì)胞在用于鑒定新的治療劑如為了治療 消化性疾病如自身免疫、炎癥和癌癥、代謝作用、糖尿病、進(jìn)食障礙、 肥胖病、味覺細(xì)胞更新、高血壓、體液滯留和消化系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)測 定中的用途。 發(fā)明簡述和目標(biāo) 在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明涉及在化學(xué)感覺或味覺細(xì)胞特 別是小鼠輪廓細(xì)胞和可能在其它的哺乳動(dòng)物如人類和非人類靈長類動(dòng) 物味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的一組新基因的鑒定。這些基因包括直接或 間接地涉及特異性味覺范疇如咸味、甜味、苦味、鮮味、酸味、油脂
21味和金屬味和/或在調(diào)節(jié)味覺強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間中的檢測。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一組新的基因，其在 化學(xué)感覺或味覺細(xì)胞特別是小鼠輪廓細(xì)胞和可能在其它化學(xué)感覺活味 覺細(xì)胞中和來源于其它的哺乳動(dòng)物如人類和非人類靈長類動(dòng)物類似細(xì) 胞中特異性表達(dá)，其涉及其它的味覺細(xì)胞功能包括舉例來說為味覺細(xì) 胞凋亡或味覺細(xì)胞更新、味覺細(xì)胞再生、消化、口腔中免疫系統(tǒng)的調(diào) 節(jié)、碳水化合物的調(diào)節(jié)或與消化、食物檢測、味覺細(xì)胞運(yùn)輸?shù)扔嘘P(guān)的 其它的代謝功能。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及在小鼠或其它 的哺乳動(dòng)物味覺細(xì)胞特異表達(dá)的特異基因或基因產(chǎn)物的鑒定，其用作 鑒定、分離或富集特異性味覺細(xì)胞亞類或味覺細(xì)胞譜系的標(biāo)記物，舉 例來說包括甜味、鮮味、酸味、苦味、咸味、油脂味和金屬味覺細(xì)胞， 以及用于分離涉及非味覺功能如免疫調(diào)節(jié)的味覺細(xì)胞，例如在口腔中 消化或代謝功能的調(diào)節(jié)、味覺細(xì)胞凋亡、更新或味覺細(xì)胞分化和增殖 的調(diào)節(jié)和鈉排泄、轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收的調(diào)節(jié)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些味覺細(xì)胞 特異基因或基因產(chǎn)物或所述分離或富集的味覺細(xì)胞譜系或味覺細(xì)胞類 型在表達(dá)所述味覺細(xì)胞特異基因的用途，其用于篩選檢測法中例如為 了鑒定引起調(diào)節(jié)甜味、酸味、鮮味、咸味、苦味、油脂味或金屬味的 化合物，以及這些基因、基因產(chǎn)物或分離或富集味覺細(xì)胞的用途，其 用于鑒定如治療不同的消化系統(tǒng)病癥如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、 乳糜瀉、消化不良、消化系統(tǒng)癌癥的潛在治療化合物、用于調(diào)節(jié)^^未覺 細(xì)胞更新或凋亡或?yàn)橛糜谌缭诨加邪┌Y或經(jīng)歷化療或輻射的老年患者 或個(gè)體中調(diào)節(jié)味覺細(xì)胞分化和再生的化合物、用于調(diào)節(jié)或提高口腔免
疫系統(tǒng)化合物、用于消化和代謝功能調(diào)節(jié)的化合物如影響消化液、激 素或酶如唾液、胃和小腸液、GLP-1 (胰高血糖素樣肽1) 、 GIP (葡 萄糖依賴性胰島素釋放多肽)、胰泌素、淀粉酶等產(chǎn)生的化合物、影 響消化動(dòng)力的化合物、用于治療糖尿病的化合物、用于調(diào)節(jié)食物檢測 和用于治療肥胖病或進(jìn)食障礙、惡病質(zhì)等化合物的鑒定。
本發(fā)明進(jìn)一步提供分離、純化和標(biāo)記想得到的味覺細(xì)胞 類型和味覺細(xì)胞鐠系如鮮味、甜味、咸味、苦味、油脂味、酸味、金 屬味以及味覺千細(xì)胞和其它包含分化成味蕾細(xì)胞、味覺細(xì)胞神經(jīng)元、 味覺免疫細(xì)胞等的細(xì)胞的不成熟和成熟的味覺細(xì)胞鐠系，基于在此提 供的一種或多種味覺特異基因表達(dá)或未表達(dá)。這些分離和提純法包括 兩種陽性和陰性細(xì)胞分離方法。例如通過陽性細(xì)胞選擇方法可以分離 想得到的味覺細(xì)胞譜系或類型，如通過利用焚光激活細(xì)胞分選(FACS ), 磁珠細(xì)胞選擇如通過目視鑒定想得到的細(xì)胞如通過使用電生理學(xué)抗體 包被小球的個(gè)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。另外地，通過陰性細(xì)胞純化和隔離法可以 回收或純化想得到的味覺細(xì)胞鐠系或類型，其中通過除去一個(gè)或多個(gè) 不想要的細(xì)胞譜系，從混合細(xì)胞群體中富集或純化想得到的細(xì)胞類型， 例如通過使包含想得到的味覺細(xì)胞和不想要的細(xì)胞的混合細(xì)胞懸浮夜 (例如，來自舌、口腔或腸胃道和相關(guān)器官)與對(duì)靶基因特異的細(xì)胞 毒素抗體接觸，所述靶基因在將被除去的不想要的味覺細(xì)胞類型上表 達(dá)。 本發(fā)明還涉及標(biāo)記物的用途，例如對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)味 覺特異基因在舌和口腔映射區(qū)域特異性的抗體或低聚核苷酸，其涉及 特異性味覺和非特異性功能，胃腸道和表達(dá)特異性味覺特異基因的相 關(guān)器官(例如，腸上表皮細(xì)胞或尿道)特異性區(qū)域的映射，因此其涉 及一個(gè)或多個(gè)在此^S開的味覺細(xì)胞特異性功能，和/或在味覺細(xì)胞分化 研究中目標(biāo)基因和對(duì)該基因特異性的標(biāo)記物的用途，例如用于鑒定誘 導(dǎo)味覺細(xì)胞例如成熟和胚胎千細(xì)胞和其它多能性或未成熟細(xì)胞類型分 化為想得到的味覺細(xì)胞鐠系和味覺細(xì)胞類型的化合物。 本發(fā)明在其更特異性實(shí)施方案中涉及新的原理和方法， 以及迄今為止使用這些原理和方法鑒定和表征基于不同參數(shù)構(gòu)造鹽受 體靶標(biāo)的新味覺特異基因的結(jié)果。使用這些規(guī)程的靶標(biāo)在高通量篩選 工作鑒定人類咸味增強(qiáng)子中是有用的靶標(biāo)。使用兩種不同的技術(shù)、基 因芯片和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)篩選鑒定這些乾標(biāo)，以鑒定新的鹽受 體靶基因。第一，包含大多數(shù)已知的小鼠基因的基因芯片微陣列技術(shù)
23用來測定通過激光捕獲顯微分離技術(shù)分離小鼠舌后和非舌上皮細(xì)胞的
輪廓乳頭味覺細(xì)胞中哪些基因特異性表達(dá)。第二， PCR用來測定從我 們已經(jīng)收錄在人類/小鼠基因組中339通道的哪些離子通道在人類/小 鼠輪廓(CV)乳頭味覺細(xì)胞而不是通過激光捕獲顯微分離技術(shù)分離的 舌上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)。通過任一方法鑒定基因的味覺特異性表達(dá)， 由使用獨(dú)立的組織學(xué)方法如原位雜交或免疫組織化學(xué)確定以測定哪些 基因在味覺細(xì)胞中表達(dá)。使用雙標(biāo)記組織學(xué)方法確定哪些新的味覺特 異基因在表達(dá)味覺特異性離子通道TRPM5的甜味、苦味和鮮味味覺細(xì) 胞、表達(dá)味覺特異性離子通道PKD2L1/PKD1L3的酸味味覺細(xì)胞或不表 達(dá)TRPM5或PKD2L1/PKD1L3的異常細(xì)胞類型中表達(dá)。味覺特異基因， 優(yōu)選離子通道，即通過鈉離子傳導(dǎo)性或激活，并在TRPM5和 PKD2L1/PKD1L3陰性細(xì)胞群體中表達(dá)，為篩選工作以鑒定編碼哺乳動(dòng) 物咸味受體的基因的極有希望的待選物，以及特異性細(xì)胞類型其中這 些咸味受體基因如在口腔和泌尿道中表達(dá)，以及在設(shè)計(jì)為高通量測定 中鑒定人類咸度增強(qiáng)劑的使用。 雖然我們的工作已經(jīng)集中于鑒定可能構(gòu)造鹽受體靶標(biāo)的 新離子通道，我們認(rèn)識(shí)到鹽受體靶標(biāo)可以包括另一個(gè)蛋白類型如轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)或未知跨膜蛋白。因此，我們還包括 在我們分析法中具有超過一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。因?yàn)樘鹞?、苦味?鮮味和酸味受體是具有多重跨膜結(jié)構(gòu)域的所有跨膜蛋白，我們據(jù)理說 明其它的味覺受體包括鹽受體也將是具有多重跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白。 同時(shí)，如上討論推定它在我們研究期間是合理的，雖然 這些試驗(yàn)的焦點(diǎn)是鑒定新的鹽受體靶標(biāo)，但還鑒定了涉及其它味覺范 疇(例如酸味、澀味、質(zhì)感、油脂味、金屬味等)的其它味覺特異基 因。因此，通常在此鑒定的影響鹽感覺的新味覺特異性基因(和可能 由此影響其它生物學(xué)的活性如鈉吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄及其影響如體液滯 留和血壓調(diào)節(jié))可以另外地影響其它的味覺范疇和滋味感覺。另外， 雖然這些試驗(yàn)的焦點(diǎn)在于鑒定新的鹽受體靶標(biāo)，很可能在我們研究期 間但還鑒定了其它^^未覺特異性基因。因此，在此鑒定的新味覺特異性基因能可用作味蕾或味覺受體細(xì)胞類型包括甜味、苦味、鮮味、酸味 以及咸味細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，并且鑒定的味覺特異性基因可以是用 于調(diào)節(jié)甜味、苦味、鮮味、酸味和咸味的乾標(biāo)。另外，當(dāng)設(shè)計(jì)目標(biāo)測定法以鑒定可能的鹽受體靶標(biāo)時(shí)， 更有可能的是這些方法已經(jīng)鑒定涉及上述討論到的非味覺生物學(xué)功能 的味覺特異性基因。因此，這些新的味覺特異性基因和它們的相應(yīng)基 因產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)用于分離新的味覺細(xì)胞亞類或味覺細(xì)胞i瞽系。此外，這些 味覺特異性基因或相應(yīng)基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞(例如表達(dá)這些 味覺細(xì)胞特異性基因的分離或富集的內(nèi)源性味覺或化學(xué)感覺細(xì)胞)， 可用于治療劑篩選檢測法中，如用于鑒定治療消化系統(tǒng)病癥如消化性 癌癥、自身免疫和炎性消化障礙如漬瘍性結(jié)腸炎、消化不良、克羅恩 氏病、乳糜瀉、炎性腸綜合癥、憩室炎等中的治療劑、用于調(diào)節(jié)味覺 細(xì)胞凋亡和味覺細(xì)胞更新、用于誘導(dǎo)味覺細(xì)胞再生如在老年病、遭受 化療或輻射的癌癥病人或個(gè)體、用于調(diào)節(jié)口腔的免疫系統(tǒng)、用于調(diào)節(jié) 消化粘液和流體、酶或激素如GLP-1 (胰高血糖素樣肽1) 、 GIP (葡 萄糖依賴性胰島素釋放多肽)、淀粉酶、唾液、胃酸、小腸液、胃朊 酶、胰泌素等；用于治療糖尿病、進(jìn)食障礙、惡病質(zhì)和其它包括這些 基因和/或分離或富集味覺細(xì)胞的代謝失調(diào)。 更特別地是本發(fā)明涉及味覺特異性基因的發(fā)現(xiàn)，其可能 在味覺細(xì)胞生長和凋亡、味覺細(xì)胞再生、調(diào)節(jié)味覺細(xì)胞受體表達(dá)的轉(zhuǎn) 錄因子的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)往返于頂膜/味孔區(qū)域運(yùn)輸?shù)奈队X受體、調(diào)節(jié)味覺 細(xì)胞作用電位放電頻率/膜電位以控制特異性味覺強(qiáng)度和/或調(diào)節(jié)特異 性味覺、神經(jīng)遞質(zhì)釋放至調(diào)節(jié)味覺強(qiáng)度或特異性味覺的傳入神經(jīng)，以 及傳信號(hào)至神經(jīng)纖維的味覺細(xì)胞等中起作用。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及在味覺細(xì)胞(這些味覺細(xì)胞為如在 消化道和口腔、舌等中)，如胃腸細(xì)胞或口腔細(xì)胞中特異性表達(dá)的味 覺特異性基因的發(fā)現(xiàn)，以及這些基因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞 用于鑒定特異性結(jié)合這些基因或調(diào)節(jié)這些基因活性的化合物的用途， 這些化合物可用來治療或預(yù)防包括消化功能上的病理學(xué)癥狀。舉例來
25200 說這些病癥包括機(jī)能性消化不良(消化不良)和其它消化不良，其可 能或不可能是源于或與潰瘍相關(guān)，可以包括消化道如上腹腔、中腹腔 或下腹腔的不同區(qū)域。 本發(fā)明進(jìn)一步地提供在味覺細(xì)胞如咸味鮮味味覺細(xì)胞中 特異性表達(dá)的基因，這些基因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞(例如 源于胃腸或口腔的味覺細(xì)胞)，可以用于篩選以鑒定可能用來治療或 預(yù)防包括涉及消化或饑餓的胃腸液、粘液、酶或激素如促胃液素、胰 泌素、胃朊酶、縮膽嚢素、胰高血糖素樣肽l (GLP-1)、淀粉酶、腦 腸肽、瘦素等的病理學(xué)癥狀的化合物。同時(shí)這些化合物可以提高唾液 或其它消化粘液分泌和流體的產(chǎn)生。這些化合物潛在地可用來抑制或 誘導(dǎo)饑餓感和/或調(diào)節(jié)所需要患者中的消化。 進(jìn)一步地因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如咸p未、甜味、苦 味、酸味或鮮味味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。本發(fā)明還涉及這些基 因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞(例如但不限于味覺細(xì)胞，如源于 胃腸或口腔的細(xì)胞)，在篩選中鑒定結(jié)合這些基因或基因產(chǎn)物或調(diào)節(jié) 這些基因或基因產(chǎn)物活性或數(shù)量的化合物的用途，這些化合物潛在地 可用來治療或預(yù)防病理性或慢性炎癥或自身免疫胃腸癥狀如克羅恩氏 病、炎性腸綜合癥(IBD)、乳糜瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、憩室炎、胃炎、 反流性食管炎等。這些化合物潛在地可用來治療或預(yù)防影響消化系統(tǒng) 的自身免疫或炎性疾病。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明提供在味覺細(xì)胞如鮮味、甜味、咸味、 苦味或酸味味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些基 因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞(例如味覺細(xì)胞，如源于胃腸或口 腔的味覺細(xì)胞細(xì)胞)，在篩選中鑒定結(jié)合這些基因或基因產(chǎn)物或調(diào)節(jié) 這些基因或基因產(chǎn)物活性或數(shù)量的化合物的用途，這些化合物潛在地 可用來調(diào)節(jié)胃回流和相關(guān)的疾病或癥狀，如胃食管回流疾病、燒心、 Barrett氏食管和食管炎。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如咸味、甜味、苦味、 酸味或鮮味味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些基
26因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞，在篩選中鑒定結(jié)合這些基因或基 因產(chǎn)物或調(diào)節(jié)這些基因或基因產(chǎn)物活性的化合物的用途，因此潛在地 可用來治療或預(yù)防與消化系統(tǒng)相關(guān)的癌癥或惡性胂瘤，舉例來說如舌 癌和口腔癌如味蕾癌和唾液腺癌、胃、食管、小或大腸、肛門或直腸、 胰腺、膽嚢、肝、直腸或結(jié)腸癌。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如咸味、甜味、苦味、 酸味或鮮味味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些基 因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞，在篩選中鑒定結(jié)合這些基因或基 因產(chǎn)物或調(diào)節(jié)這些基因或基因產(chǎn)物活性的化合物的用途，這些化合物 潛在地可用來治療或預(yù)防與食欲功能相關(guān)的障礙和癥狀，如肥胖、食 欲不振、貪食癥和與之相關(guān)的惡病質(zhì)。 同時(shí)，本發(fā)明涉及在此鑒定基因的用途，所述基因在味 覺細(xì)胞中特異性表達(dá)，以分離或富集特異性味覺細(xì)胞鐠系或亞型，特 別是源于如舌、口腔或胃腸系統(tǒng)的味覺細(xì)胞，其表達(dá)這些味覺細(xì)胞特 異性基因的一種或幾種。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞(如鮮味、甜味、酸 味、苦味或其它的味覺細(xì)胞類型)味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，并 且因?yàn)槲队X細(xì)胞在消化道和口腔、舌中，本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些基因、 基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞(例如但不限于味覺細(xì)胞，如胃腸或口 腔的細(xì)胞)，在鑒定結(jié)合這些基因或基因產(chǎn)物或調(diào)節(jié)這些基因或基因 產(chǎn)物活性的化合物的用途，其可用來治療或預(yù)防包括消化功能的病理 學(xué)癥狀。舉例來說這些病癥包括機(jī)能性消化不良(消化不良)和其它 消化不良，其可能或不可能是源于或與潰瘍相關(guān)，可以包括消化道如 上腹腔、中腹腔或下腹腔的不同區(qū)域。 進(jìn)一步因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如鮮味、甜味、酸味、 苦味或其它的味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些 基因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞(例如但不限于如胃腸或口腔的 味覺細(xì)胞)，可以用于篩選以鑒定可能用來治療或預(yù)防包括涉及消化 或饑餓的胃腸液、酶或流體涉及如促胃液素、胰泌素、胃朊酶、縮膽嚢素、葡萄糖依賴性胰島素釋放多肽、胰高血糖素樣肽l (GLP-1)、 淀粉酶、腦腸肽、瘦素(leptin)等的病理學(xué)癥狀的化合物。這些化 合物潛在地可能用來抑制或誘導(dǎo)饑餓感和/或調(diào)節(jié)所需要患者中的消 化。 進(jìn)一步因?yàn)楸景l(fā)明提供在味覺細(xì)胞如鮮味、甜味、酸味、 苦味或其它的味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，本發(fā)明還涉及這些基因、 基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞(例如但不限于如源于胃腸或口腔細(xì)胞 的味覺細(xì)胞)，在篩選中鑒定結(jié)合這些基因或基因產(chǎn)物或調(diào)節(jié)這些基 因或基因產(chǎn)物活性或數(shù)量的化合物的用途，這些化合物潛在地可用來 治療或預(yù)防病理性或慢性炎癥或自身免疫胃腸癥狀如克羅恩氏病、炎 性腸綜合癥(IBD)、乳糜瀉、潰瘍性結(jié)腸炎、憩室炎、胃炎、反流性 食管炎等。這些化合物潛在地可用來治療或預(yù)防影響消化系統(tǒng)的自身 免疫或炎性疾病。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如鮮味、甜味、酸味、 苦味或其它的味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些 基因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞(例如味覺細(xì)胞，如源于胃腸或 口腔的味覺細(xì)胞細(xì)胞)，在篩選中鑒定結(jié)合這些基因或基因產(chǎn)物或調(diào) 節(jié)這些基因或基因產(chǎn)物活性或數(shù)量的化合物的用途，這些化合物潛在 地可用來調(diào)節(jié)胃回流和相關(guān)的疾病或癥狀，如胃食管回流疾病、燒心、 Barrett氏食管和食管炎。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明提供在味覺細(xì)胞如鮮味、甜味、酸味、 苦味或其它的味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些 基因、基因產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞，在篩選中鑒定結(jié)合這些基因或 基因產(chǎn)物或調(diào)節(jié)這些基因或基因產(chǎn)物活性的化合物的用途，因此這些 化合物潛在地可用來治療或預(yù)防與消化系統(tǒng)相關(guān)的癌癥或惡性腫瘤， 舉例來說如唾液腺和味蕾、舌、口腔、胃、食管、小或大腸、肛門、 胰腺、膽嚢、肝、直腸或結(jié)腸癌。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在涉及鈉轉(zhuǎn)運(yùn)的味覺細(xì)胞如甜味、 鮮味、苦味、酸味、咸味或其它的味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，這
28些基因、基因產(chǎn)物和表達(dá)該基因的細(xì)胞在篩選中可用于鑒定調(diào)節(jié)離子 轉(zhuǎn)運(yùn)或離子流動(dòng)，特別是為了鑒定治療化合物的鈉離子的化合物，例 如該治療化合物可以用于調(diào)節(jié)血壓和體液滯留以及涉及異常的鈉吸 收、排泄和轉(zhuǎn)運(yùn)的癥狀和疾病。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如甜味、鮮味、苦味、 酸味、咸味或其它的味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，這些基因、基因 產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞在篩選中可被用于鑒定調(diào)節(jié)味覺細(xì)胞的選擇 性凋亡、調(diào)節(jié)控制味覺受體表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子、味覺細(xì)胞生長的自分泌/ 旁泌性調(diào)節(jié)、味蕾壽命的化合物，篩選使用導(dǎo)致超級(jí)味覺 (supertaster)表型的基因，激活味覺干細(xì)胞的化合物，影響如從頂 膜/味孔區(qū)域運(yùn)輸?shù)奈队X受體的化合物，經(jīng)由電位放電頻率/膜電位調(diào) 節(jié)味覺細(xì)胞作用的控制影響味覺強(qiáng)度的化合物，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放至 傳入神經(jīng)的化合物，所述傳入神經(jīng)控制一般和特異性味覺強(qiáng)度，以及
味覺受體功能的自分泌/旁泌性調(diào)節(jié)。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如甜味、鮮味、苦味、 酸味、咸味或其它的味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，這些基因、基因 產(chǎn)物或表達(dá)該基因的細(xì)胞在篩選中可被用于鑒定影響如在病態(tài)或老年 個(gè)體或損傷或手術(shù)后，患者遭受化療或損傷后味覺細(xì)胞或味蕾的再生 的化合物，用于調(diào)節(jié)藥物誘導(dǎo)的味覺障礙、味覺缺失、味蕾損害、口 干燥或舉例而言在Sjogren氏綜合癥中發(fā)現(xiàn)的口腔干燥的化合物，以 及用于維持口腔衛(wèi)生、治療或預(yù)防口臭、有害口腔微生物如病毒和細(xì) 菌等的化合物。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如鮮味、甜味、苦味、 咸味、酸味、油脂味金屬味等和其它味覺細(xì)胞譜系如干細(xì)胞、味覺細(xì) 胞神經(jīng)元、免疫細(xì)胞等中特異性表達(dá)的基因，本發(fā)明還提供分離、純 化、富集和標(biāo)記想得到的味覺細(xì)胞類型和味覺細(xì)胞譜系的方法，包括 如鮮味、甜味、咸味、苦味、油脂味、酸味、金屬味以及味覺干細(xì)胞 和其它味覺細(xì)胞譜系，包括在基于在此提供的一種或多種味覺特異性 基因的表達(dá)，分化成味蕾細(xì)胞、味覺細(xì)胞神經(jīng)元、味覺免疫細(xì)胞等的
29細(xì)胞。這些分離和提純法包括兩種陽性和陰性細(xì)胞分離方法。例如通 過陽性細(xì)胞選擇方法可以分離想得到的味覺細(xì)胞鐠系活類型，如通過
利用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，磁珠細(xì)胞選擇如通過目視鑒定想得 到的細(xì)胞如通過使用電生理學(xué)抗體包被小球的個(gè)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。另外地， 通過陰性細(xì)胞純化和隔離法可以回收或純化想得到的味覺細(xì)胞i普系或 類型，其中通過除去不想要的細(xì)胞譜系，從混合細(xì)胞群體中富集或純 化想得到的細(xì)胞類型，例如通過使包含想得到的味覺細(xì)胞和不想要的 細(xì)胞的混合細(xì)胞群體與對(duì)靶基因特異的細(xì)胞毒素抗體接觸，所述靶基 因在將被除去的不想要的味覺細(xì)胞類型上表達(dá)。 同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明鑒定在味覺細(xì)胞如鮮味、甜味、苦味、 咸味、酸味、油脂味、金屬味等和其它味覺細(xì)胞譜系或類型如干細(xì)胞、 味覺細(xì)胞神經(jīng)元、免疫細(xì)胞等中特異性表達(dá)的基因，本發(fā)明進(jìn)一步涉 及標(biāo)記物的用途，例如對(duì)一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)味覺特異基因特異性的抗體 或低聚核苷酸，所述基因在涉及特異性味覺和非特異性功能的舌和口 腔映射區(qū)域中，映射胃腸道和表達(dá)特異性味覺特異基因的相關(guān)器官特 異性區(qū)域，因此其涉及一個(gè)或多個(gè)在此^^開的味覺細(xì)胞特異性功能， 和/或在味覺細(xì)胞分化研究中目標(biāo)基因的用途，例如用于鑒定誘導(dǎo)味覺
和味覺細(xì)胞類型的化合物。 更具體地說，如下文詳細(xì)的描述，本發(fā)明提供了用于候 選咸味基因的原理和標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選一種離子通道，其顯示 a)在味覺細(xì)胞和非舌細(xì)胞中特異性表達(dá)，或在味覺細(xì)胞 中比舌細(xì)胞更高水平的表達(dá) b)通過組織學(xué)方法在味覺細(xì)胞中表達(dá)。具體地說，在不 表達(dá)甜味、苦味和鮮味味覺細(xì)胞標(biāo)記物TRPM5或酸味味覺細(xì)胞標(biāo)記物 PKD2L1/PKD1L3的異常味覺細(xì)胞類型中表達(dá)。該異常的細(xì)胞類型可以
是對(duì)咸味有貢獻(xiàn)的敏感細(xì)胞。c)作為具有基本的、結(jié)構(gòu)的功能的鈉通道或鈉激活受體 (即通道群體的一部分是開放的和在休息時(shí)通過鈉離子)在異源的表達(dá)系統(tǒng)(如非洲爪蟾屬卵細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或主要的神經(jīng)元(如 脊神經(jīng)后根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元)中功能性表達(dá)。 達(dá)到這些標(biāo)準(zhǔn)的基因?qū)⒈惶岢鲞M(jìn)入高通量篩選工作以鑒 定增加人鹽感覺的化合物。此外在此(例如，在上表1、 2和3中)報(bào)
道的味覺特異性基因，將在如前述治療篩選中有用。 因此在本專利申請(qǐng)中，通常我們描述篩選檢測法以鑒定 基因，其通常推定涉及咸味感覺以及味覺和其它味覺細(xì)胞介導(dǎo)的活性。 本發(fā)明的一個(gè)具體目標(biāo)是鑒定味覺特異性基因，其編碼 在味覺細(xì)胞和非舌細(xì)胞中特異性表達(dá)，或在味覺細(xì)胞中比舌上皮細(xì)胞 更高水平的表達(dá)的膜蛋白，在測試中使用基因芯片和/或PCR方法以及 使用同樣的作為鹽受體靶標(biāo)來鑒定咸味調(diào)節(jié)劑，以及通常影響其它味 覺范疇和味覺感覺和味覺細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)和細(xì)胞功能和味覺細(xì)胞相關(guān) 表型的化合物。 本發(fā)明的更具體目標(biāo)是測定在味覺細(xì)胞中表達(dá)味覺特異 性基因，特別是甜味、苦味、和/或鮮味味覺細(xì)胞(TRPM5陽性)、酸 味味覺細(xì)胞(PKD2L1/PKD1L3陽性)或異常的細(xì)胞類型(TRPM5陰性) 中表達(dá)。這些異常的細(xì)胞類型可能包括對(duì)咸味感覺有貢獻(xiàn)的細(xì)胞。本發(fā)明的另 一個(gè)目標(biāo)是在特異性測試中使用這些基因鑒
定味覺特異性離子通道或味覺特異性基因的調(diào)節(jié)劑(增強(qiáng)劑)，因?yàn)?這些化合物可以調(diào)節(jié)人的咸味感覺。 本發(fā)明的特定目標(biāo)是在此存在和沒有推定的增強(qiáng)劑下， 提供測定在此鑒定的推定味覺離子通道的導(dǎo)電性電生理學(xué)測定。 本發(fā)明的另一個(gè)具體目標(biāo)是在卵細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中鑒定患 者推定咸味相關(guān)的離子通道和其它味覺影響基因的增強(qiáng)劑。 本發(fā)明的更具體目標(biāo)是使用卵細(xì)胞提供膜片鉗或二電極 電壓鉗測定，所述卵細(xì)胞表達(dá)了用于鑒定化合物的推定咸味受體離子 通道，所述化合物調(diào)節(jié)該通道的活性并因此調(diào)節(jié)了咸味。如下所述一 個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案符合本發(fā)明的這些目標(biāo)和其它目標(biāo)。
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發(fā)明簡述 發(fā)明在其寬的實(shí)施方案中鑒定一組新的基因，其在化學(xué) 感覺，例如小鼠輪廓味覺細(xì)胞，以及可能來源于其它哺乳動(dòng)物如人類 和非人類靈長類動(dòng)的味覺(例如輪廓的)細(xì)胞中特異表達(dá)。這些基因 包括直接或間接地涉及味道檢測和味道調(diào)節(jié)(如有咸味、鮮味、甜味、 酸味、油脂味、金屬味或苦味傳感)以及不直接與味道檢測和味道調(diào) 節(jié)相關(guān)的功能的基因，如涉及調(diào)節(jié)消化和產(chǎn)生和消化液、粘液、酶和 激素如唾液、胃和小腸液、GLP-1 (胰高血糖素樣肽1) 、 GIP (葡萄 糖依賴性胰島素釋放多肽)、胰泌素、胃朊酶等組分的基因；涉及血 壓和體液滯留控制的基因，涉及味覺受體運(yùn)輸、味覺細(xì)胞更新和味覺 細(xì)胞再生的基因，涉及口腔和胃腸系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)控制的基因，涉及 胃腸相關(guān)疾病如癌癥、影響口腔和消化系統(tǒng)的炎性和自身免疫疾病的 預(yù)防和發(fā)作的基因，涉及調(diào)節(jié)新陳代謝如碳水化合物代謝、肥胖、進(jìn) 食障礙的基因，涉及消化期間檢測食物的基因等。與前述有關(guān)的本發(fā)明提供了一組新的基因，其在化學(xué)感 覺，例如小鼠輪廓味覺細(xì)胞中特異表達(dá)，在舌細(xì)胞中不表達(dá)或顯著低 水平的表達(dá)，其用于篩選檢測法，優(yōu)選高流通量篩選檢測法，用于鑒 定直接或間接地調(diào)節(jié)不同味覺形式如咸味、甜味、鮮味、苦味、酸味、 油脂味或金屬味的化合物。 與前述有關(guān)的本發(fā)明提供了一組新的基因，其用于篩選 檢測法，優(yōu)選高流通量篩選檢測法以鑒定化合物，所述化合物用作在 消化系統(tǒng)病癥治療中的治療劑，用于調(diào)節(jié)味覺細(xì)胞凋亡或味覺細(xì)胞更 新，用于誘導(dǎo)味覺細(xì)胞再生，用于影響口腔或消化系統(tǒng)中免疫的調(diào)節(jié)， 在治療糖尿病、肥胖病、進(jìn)食障礙和其它代謝失調(diào)中的治療劑。與前述有關(guān)的本發(fā)明提供了一組新的基因，其用于鑒定 和/或分離和/或富集味覺或化學(xué)感覺細(xì)胞的特異類型或譜系，例如涉 及特異味覺形態(tài)、口腔中免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、味覺細(xì)胞凋亡或味覺細(xì)胞更 新、味覺細(xì)胞再生、消化系統(tǒng)調(diào)節(jié)和新陳代謝調(diào)節(jié)(例如通過在食物 檢測、涉及饑餓感和消化的激素或酶的分泌等中有幫助)的味覺或化
32學(xué)感覺細(xì)胞。 進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及這些分離的化學(xué)感覺或味覺細(xì)胞 在篩選檢測法中鑒定調(diào)節(jié)味覺的化合物的用途，以及在鑒定治療劑的 用途，所述治療劑用于調(diào)節(jié)口腔免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、味覺細(xì)胞凋亡的更新、 味覺細(xì)胞再生、涉及消化的激素或酶或流體和粘液及其它味覺細(xì)胞功 能的調(diào)節(jié)，用于治療消化系統(tǒng)病癥，用于治療糖尿病、肥胖病、進(jìn)食 障礙或其它代謝失調(diào)等。 進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及分離、純化和標(biāo)記想得到的味覺 細(xì)胞類型和味覺細(xì)胞鐠系的方法，所述味覺細(xì)胞類型和味覺細(xì)胞譜系 包括如鮮味、甜味、咸味、苦味、油脂味、酸味、金屬味以及味覺千 細(xì)胞和其它味覺細(xì)胞譜系，包括分化為味蕾細(xì)胞、味覺細(xì)胞神經(jīng)元、 味覺免疫細(xì)胞等細(xì)胞，基于一種或多種在此提供的味覺特異基因的表 達(dá)。這些分離和提純法包括陽性和陰性細(xì)胞分離法。例如通過陽性細(xì) 胞選擇方法分離想要的味覺細(xì)胞譜系或類型，如通過使用熒光激活細(xì) 胞分選(FACS)，磁珠細(xì)胞選擇如通過目視鑒定想得到的細(xì)胞如通過 使用電生理學(xué)抗體包被小球的個(gè)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。另外地，通過陰性細(xì)胞 純化和分離法可以回收或純化想得到的味覺細(xì)胞譜系或類型，其中通 過除去不想要的細(xì)胞譜系，從混合細(xì)胞群體中富集或純化想得到的細(xì) 胞類型，例如通過使包含想得到的味覺細(xì)胞和不想要的細(xì)胞的混合細(xì) 胞群體與對(duì)耙基因特異的細(xì)胞毒素抗體接觸，所述靶基因在將被除去
的不想要的味覺細(xì)胞類型上表達(dá)。 同時(shí)，本發(fā)明涉及標(biāo)記物或探針如抗體或低聚核苷酸的 用途，其可以用可檢測的標(biāo)記物如放射性核素、熒光團(tuán)、酶等標(biāo)記， 這些標(biāo)記物和探針對(duì)一個(gè)或多個(gè)患者味覺特異性基因是特異性的，如 在舌和口腔映射區(qū)域，包含涉及特異性味覺范疇如鮮味、甜味、苦味、 咸味、酸味、油脂味、金屬味等的細(xì)胞，以及涉及非味覺特異性功能 如在此鑒定的細(xì)胞，胃腸道和包含表達(dá)特異性味覺特異基因的細(xì)胞的 相關(guān)器官的特異性區(qū)域的映射，因此其涉及一個(gè)或多個(gè)在此公開的味 覺細(xì)胞特異性功能，和/或在味覺細(xì)胞分化研究中目標(biāo)基因的用途，例如用于鑒定誘導(dǎo)味覺細(xì)胞(例如成人或胚胎干細(xì)胞)和其它多能性或
物o 更具體地說，本發(fā)明涉及新的原理、方法和測定，其包 括鑒定和表征包括那些起咸味受體作用的新味覺特異性基因的電生理 學(xué)測定。 人們普遍相信，通過鈉或其它的離子通道以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 和GPCR在味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)可以部分地介導(dǎo)人咸味覺。因此，本 發(fā)明提供用于鑒定味覺特異性基因的方法，其包括使用基因芯片和 PCR方法的可調(diào)節(jié)咸味以及其它的味覺范疇和味覺細(xì)胞介導(dǎo)功能和表 型的基因。調(diào)節(jié)這些靶基因的鑒定化合物和它們的衍生物作為人消費(fèi) 的食物、飲料和藥物中人咸味覺的調(diào)節(jié)劑能潛在地被使用。同時(shí)，這 些化合物和它們的衍生物可潛在地用來治療包括異常離子通道功能的 疾病。進(jìn)一步，在此論述使用鑒定的基因和表達(dá)該基因的細(xì)胞鑒定化 合物在治療劑篩選測定中是有用的，用于鑒定調(diào)節(jié)其它的味覺細(xì)胞相 關(guān)功能和顯型的潛在治療劑。 在一個(gè)方式中，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物味覺細(xì)胞中用 于鑒定編碼多肽基因的方法。該方法的一個(gè)實(shí)施方案包含步驟(i )鑒 定一組基因，其包括在味覺細(xì)胞但不在舌細(xì)胞中表達(dá)的基因，和/或在 味覺細(xì)胞中比在舌細(xì)胞中以更高水平表達(dá)的基因；(ii)鑒定在(i) 中鑒定的該組基因內(nèi)的基因亞型，其不在表達(dá)鮮味、甜味或苦味受體 (T1R或T2R )或酸味受體PKD2L1/PKD1L3 )味覺細(xì)胞中表達(dá)；和("i ) 功能性表達(dá)根據(jù)(ii)鑒定亞型中的一個(gè)或多個(gè)基因并測定這些基因 的哪些作為鈉響應(yīng)度離子通道或鈉響應(yīng)度受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，由 此鑒定這個(gè)基因或這些基因作為調(diào)節(jié)咸味的推定基因。 一般地，用于 該方法的味覺組織源于人或鼠類。在該方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 在步驟(iii )功能中基因作為鈉響應(yīng)度離子通道等，優(yōu)選當(dāng)表達(dá)基因 時(shí)，通道群體的一部分在休息時(shí)開放和通過鈉離子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(i)包含激光捕獲顯微
34分離技術(shù)(LCM)從非味覺組織解剖和純化味覺組織的用途。在該實(shí)施 方案的一個(gè)方式中，步驟(i)包含從味覺細(xì)胞和舌細(xì)胞基因的RNA 擴(kuò)增，針對(duì)包含對(duì)從特定哺乳動(dòng)物得到的味覺和舌組織特異性基因樣 品的基因芯片篩選擴(kuò)增的基因，并且優(yōu)選包含有注解的(annotated)
哺乳動(dòng)物基因組的基因芯片。在選擇性的優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟U) 包含在哺乳動(dòng)物基因組中各個(gè)離子通道使用引物的高流通量PCR。 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(ii)通過原位雜交 進(jìn)行，其使用對(duì)在步驟(i)鑒定的基因組(set of gene)特異性的 反義RNA探針，用以測定在味覺對(duì)比舌細(xì)胞中的表達(dá)水平。在一個(gè)可 選的優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(ii )通過免疫化學(xué)檢測應(yīng)用來進(jìn)行，該 檢測使用對(duì)通過步驟(i)中鑒定的基因編碼蛋白特異性標(biāo)記抗體。 在用于鑒定涉及哺乳動(dòng)物中咸味感覺多肽編碼基因的方
法的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包含步驟(i )鑒定包括在味覺
細(xì)胞中表達(dá)基因的基因組，但沒有在舌細(xì)胞和/或基因中表達(dá)，其在味
覺細(xì)胞中比在舌細(xì)胞中具有更高水平；(H)鑒定在(i)基因組鑒定
內(nèi)的基因亞型，其沒有在表達(dá)鮮味、甜味或苦味受體(T1R或T7R)或
酸味受體PKD2L1/PKD1L3)味覺細(xì)胞中表達(dá)；和(iii)根據(jù)(ii)鑒 定亞型中一個(gè)或多個(gè)基因功能性表達(dá)和測定這些基因的哪些作為鈉響
應(yīng)度離子通道或鈉響應(yīng)度受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，由此作為調(diào)節(jié)咸味 的推定基因鑒定這個(gè)基因或這些基因。在該實(shí)施方案的一個(gè)方式中， 步驟(iii )包含接觸具有特異性結(jié)合基因和抑制其功能抗體的神經(jīng)元。 根據(jù)如上所述任何一種方法的鑒定的基因不表達(dá)TRPM5 和PKD2L1/PKD1L3。在另一個(gè)方式中，通過才艮據(jù)上述方法測定一個(gè)細(xì) 胞是否表達(dá)一個(gè)鑒定基因，本發(fā)明提供了在選擇的細(xì)胞中不表達(dá) TRPM5和PKD2L1/PKD1L3的輔助方法。優(yōu)選在該段落方法中使用的基 因是列于表1-3中的基因之一，其列出了在味覺細(xì)胞中味覺特異性基 因編碼跨膜蛋白。因?yàn)樗幸阎奈队X受體基因用于甜味、苦味、鮮 味和酸味編碼跨膜蛋白，所以工作集中于跨膜基因。在另一個(gè)方式中，本發(fā)明提供了用于鑒定具有調(diào)節(jié)人咸味體內(nèi)潛在應(yīng)用的一種測定法。該方法包含步驟(i)接觸表達(dá)基因編 碼離子通道、受體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的細(xì)胞，其被鑒定為根據(jù)上述一種方法 的推定咸味影響基因，或者是編碼具有與由此使用至少一種推定的增 強(qiáng)劑化合物編碼多肽相比至少90%序列同一性的多肽；(ii)在存在 和沒有所述推定的增強(qiáng)劑下測定鈉離子電導(dǎo)率、受體活性或鈉離子轉(zhuǎn) 運(yùn)；和(iii)鑒定作為基于提高鈉離子電導(dǎo)率、所述受體或鈉離子轉(zhuǎn) 運(yùn)活性是否促進(jìn)潛在咸味增強(qiáng)劑的化合物。在不同的實(shí)施方案中，基 因編碼離子通道或基因編碼GPCR。優(yōu)選，該基因是人基因。更優(yōu)選該 方法進(jìn)一步地包括在人味覺試驗(yàn)中檢測化合物或其衍生物的效果。優(yōu) 選選擇的化合物促進(jìn)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)至味蕾細(xì)胞。推定的咸味影響基因可 以在兩棲類卵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選非洲爪蟾屬卵細(xì)胞或選自 ■293、 HEK293T、 Swiss3T3、 CH0、 BHK、 NIH3T3猴子L細(xì)胞、非洲 綠猴子腎細(xì)胞、Ltk-細(xì)胞和COS細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選推定的咸味影響基 因在可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。可以穩(wěn)定或短暫表達(dá)推定的咸味影 響基因。在一個(gè)優(yōu)選的方式中，選自推定咸味影響基因的基因包含于 表1-3和它們的直向同源和變異體。 在一個(gè)優(yōu)選的方式中，步驟(ii)的測定法是一種電生 理學(xué)測定法，其使用鈉離子敏感染料，優(yōu)選的染料包括膜電位染料， 選自分子裝置膜電位試劑盒(Cat#-R8034 ) 、 二-4-ANEPPS (吡啶鹽，4-(2- ( 6- ( 二丁基氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1- ( 3-磺丙基))氫氧 化物、內(nèi)鹽、DiSBACC4 ( 2)(雙-(1， 2-二巴比妥酸)-三乙炔氧烯洛 爾(oxanol ) ) 、 Cc-2-證E (太平洋藍(lán)1， 2-十四酰(dietradeca呵l ) -sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺，三乙基銨鹽)和SBFI-AM ( 1， 3-苯二羧 酸，4， 4-[1， 4/10-三氧雜-7， 13-噢唑十五烷(diazacylopentadecane ) -7， 13-二基雙(5-甲氧基-6， 1，2-苯并呋喃二基)]雙-四{(乙酰氧 基)曱基}酯(分子探針)，更優(yōu)選鈉離子敏感染料是四乙酸綠鈉(分 子探針)或鈉-敏感染料試劑盒(分子裝置)。在另一個(gè)優(yōu)選的方式 中，步驟(ii)的測定是在非洲爪蟾屬卵細(xì)胞中的二電極電壓鉗測定， 或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中膜片鉗測定。優(yōu)選該測定法通過離子流動(dòng)測定法
36測定活性，包括使用原子吸收光譜分析檢測離子流動(dòng)。 另外地，該測定可以使用焚光板閱讀器(FLIPR)或電壓 成像板閱讀器(VIPR),其用于增加離子通道依賴性鈉離子或流體吸 收。在該方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過膜片鉗或二電極電壓鉗在蛙卵 細(xì)胞電生理標(biāo)測測定推定咸味影響基因的活性，優(yōu)選使用熒光板閱讀 器(FLIPR)或電壓成像板閱讀器(VIPR)的自動(dòng)成像儀。 在又一個(gè)方式中，本發(fā)明提供了用于鑒定具有調(diào)節(jié)人甜 味、苦味、鮮味或酸味體內(nèi)潛在應(yīng)用的一種測定法。該方法包含步驟 U)用至少一個(gè)推定增強(qiáng)劑或阻斷劑化合物接觸表l-3中的基因或直
向同源基因或變異體表達(dá)的細(xì)胞；(ii)在存在和沒有所述推定的增 強(qiáng)劑下測定鈉離子電導(dǎo)率、受體活性或味覺基因產(chǎn)物功能；和(Ui) 鑒定作為甜味、苦味或鮮味味覺潛在增強(qiáng)劑或阻斷劑的化合物，其基 于是否調(diào)節(jié)鈉離子電導(dǎo)率、所述受體或味覺基因產(chǎn)物功能。 在又一個(gè)方式中，本發(fā)明提供了用于鑒定具有體內(nèi)潛在 治療應(yīng)用化合物的一種測定法。該方法包含步驟(i)用至少一個(gè)推定 增強(qiáng)劑或阻斷劑化合物接觸表1-3中的基因或直向同源基因或變異體 表達(dá)的細(xì)胞；(U)在存在和沒有所述推定的增強(qiáng)劑下測定鈉離子電 導(dǎo)率、受體活性或味覺基因產(chǎn)物功能；和(iU)鑒定作為可能用來調(diào) 節(jié)味覺細(xì)胞相關(guān)功能或表型(不直接包括味覺)的潛在治療法的化合 物，消化病癥或疾病、味覺細(xì)胞或味蕾更新或再生、口腔或消化系統(tǒng) 的免疫調(diào)節(jié)或代謝紊亂如糖尿病、肥胖、進(jìn)食障礙等的治療基于它是 否調(diào)節(jié)鈉離子電導(dǎo)率、受體活性或味覺基因產(chǎn)物功能。 附圖簡述

圖1包含^f吏用人p木覺組織LCM的一個(gè)實(shí)施例。
圖2包含人味覺和舌細(xì)胞的PCR質(zhì)量控制的一個(gè)實(shí)施例。
圖3包含高通量PCR篩選鑒定新的味覺特異性離子通道 的一個(gè)實(shí)施例。圖4包含原位雜交和免疫化學(xué)組織學(xué)方法觀察已知味覺基因味導(dǎo)素在小鼠或人味覺組織部分表達(dá)的一個(gè)實(shí)施例。 圖5包含原位雜交和免疫化學(xué)組織學(xué)方法觀察在小鼠或 人味覺組織部分TRPM5味覺基因表達(dá)的一個(gè)實(shí)施例。 圖6:免疫組織化學(xué)法觀察在小鼠味覺組織TRPM5味覺 基因表達(dá)的實(shí)施例。 圖7:免疫組織化學(xué)組織學(xué)法觀察在小鼠味覺組織 SCN3A/Nav1. 3鈉通道基因表達(dá)的實(shí)施例。 圖8:雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)法闡明SCN3A和TRPM5在相 同味覺細(xì)胞中共表達(dá)的實(shí)施例。 圖9:免疫組織化學(xué)法觀察在小鼠味覺組織中PKD2L1味 覺基因表達(dá)的實(shí)施例。 圖10:雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)法闡明PKD2L1和TRPM5在 不同味覺細(xì)胞中共表達(dá)的實(shí)施例。圖11包含雙標(biāo)記試驗(yàn)觀察HCN4和TRPM5在分離小鼠CV
細(xì)胞中表達(dá)的實(shí)施例。圖12包含雙標(biāo)記試驗(yàn)觀察HCN4和PKD2L1在分離小鼠
CV ^^未覺細(xì)胞中表達(dá)的實(shí)施例。 圖13包含雙標(biāo)記試驗(yàn)表明從小鼠CV味覺細(xì)胞味孔中排 除HCN4的實(shí)施例。 發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在味覺組織中特異性表達(dá)基因的鑒定，其通 常涉及推定為的涉及咸味或其它味覺范疇；或涉及味覺細(xì)胞相關(guān)功能 和表型，其不直接包括味覺如味覺細(xì)胞或味蕾再生和更新、口腔或消 化系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)、消化或代謝功能的調(diào)節(jié)、消化系統(tǒng)病癥如癌癥、 自身免疫疾病和炎性癥狀如IBD、潰瘍性結(jié)腸炎、Sjogren's綜合癥、
乳糜瀉克羅恩氏病等的發(fā)病或防止和其通常在篩選鑒定調(diào)節(jié)咸味感覺 其它味覺范疇或味覺的用途，或用于鑒定在人類使用的潛在療法。特 別地，本發(fā)明包括使用以下方法鑒定新的味覺特異性基因
381) 激光捕獲顯微分離(LCM)和RNA擴(kuò)增法。在激光捕獲顯微分 離法中，使用精密的激光束從組織部分切開和純化味覺細(xì)胞。該方法 分離味覺細(xì)胞，缺少轉(zhuǎn)染舌上皮細(xì)胞和結(jié)締組織，并允許在高濃縮味 覺細(xì)胞群體上進(jìn)行分子生物學(xué)試驗(yàn)。通過LCM分離相平行的舌上皮細(xì) 胞，并用作缺少味覺細(xì)胞的陰性對(duì)照。因?yàn)檫@些原始的技術(shù)產(chǎn)生味覺 和舌細(xì)胞非均勻混合物，其中味覺細(xì)胞包括1-20%收集的原料，所以 LCM便于手工操作或味覺乳頭的酶切開。在非偏離模式中，RNA擴(kuò)增法 通過LCM將分離的味覺細(xì)胞和舌細(xì)胞的總RNA擴(kuò)增至1百萬倍，以產(chǎn) 生足夠的遺傳物質(zhì)進(jìn)行分子生物學(xué)研究(基因芯片或PCR)。我們已 發(fā)現(xiàn)1300-2000個(gè)味覺細(xì)胞足以滿足小鼠味覺組織的基因芯片試驗(yàn)， 5， 000個(gè)味覺細(xì)胞足以滿足人味覺組織的PCR試驗(yàn)。
2) 基因芯片-基因芯片在微小的芯片上包含幾乎所有標(biāo)記的基 因。從味覺和舌細(xì)胞分離和擴(kuò)增雜交的RNA至基因芯片上，可用于測
與舌細(xì)胞相比的味覺細(xì)胞中表達(dá)水平更高。
3 ) PCR-通過LCM從人/小鼠味覺和舌細(xì)胞分離的人/小鼠基因組 和擴(kuò)增RNA，使用對(duì)各自離子通道有特異性的引物在96孔板中進(jìn)行高 通量PCR。檢測味覺細(xì)胞而不是舌細(xì)胞合適大小的產(chǎn)物，對(duì)該產(chǎn)物進(jìn) 行DNA測序確定基因同一性以表明所關(guān)心的離子通道是味覺特異性 基因。
4 )原位雜交-對(duì)于個(gè)體基因(基因芯片或PCR鑒定)特異性的反 義RNA探針雜交至包含味覺細(xì)胞的組織切片上，以測定所關(guān)心基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄物是否在味覺細(xì)胞、酸味、甜味、苦味和/或鮮味味覺細(xì)胞 或包含在咸味檢測中異常細(xì)胞類型中表達(dá)。
5 )免疫組織化學(xué)-對(duì)于個(gè)體蛋白(通過基因芯片或PCR鑒定其基 因)特異性的抗體被用于包舍味覺細(xì)胞的組織切片上，以測定所關(guān)心
蛋白是否在味覺細(xì)胞、酸味、甜味、苦味和/或鮮味味覺細(xì)胞或包含在 咸味檢測中異常細(xì)胞類型中表達(dá)。
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RNA質(zhì)量控制 使用兩種方法測量RNA完整性。使用載有Series II RNA 6000 Pico Assay ( Cat#_5067-1514 )的Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies )確定RNA質(zhì)量。在充足的28S核糖體RNA (rRNA)和18S rRNA鐠帶之間的比值合格。比值為2表明是高質(zhì)量 RNA且沒有降解。比值為-l表明部分RNA降解。當(dāng)在室溫下樣品染色 和進(jìn)行LCM，由于出現(xiàn)部分RNA降解，所以對(duì)于LCM樣品比值在0. 5-1. 0 之間是普通的。此外確定RNA的完整數(shù)(RIN) 。 RIN值為IO表明是 高質(zhì)量RNA且沒有降解，RIN值為5表明部分RNA降解和RIN值為1 表明大量的RNA降解。RIN值〉5適用于基因芯片分析，對(duì)于LCM樣品 是普通的。一般地，對(duì)于小鼠味覺組織樣品來說28S/18S rRNA比值為~ l.O和RIN值為7-8，但對(duì)于人味覺組織樣品來說28S/18S rRNA比值 為0. 5-1. 0和RIN值為5-6。 第二，用Quant-iT RiboGreen RNA測定試劑盒(分子 探針，CatLR11490 )確定RNA數(shù)量。與染料結(jié)合的熒光RNA具有下至 lpg/ul的敏感度，用于測定在味覺和舌細(xì)胞樣品中RNA的總數(shù)。對(duì)于 將味覺和舌RNA等量加入基因芯片和PCR試驗(yàn)來說RNA的精確定量是
重要的。2)基因芯片: 在5對(duì)小鼠CV味覺和舌樣品使用Affymetrix 4302. 0 陣列實(shí)施基因芯片試驗(yàn)，并用GeneSpring GX v7. 3軟件(Agilent Technologies)分析。通過LCM和各自樣品純化的總RNA單獨(dú)分離在 1300-2000之間CV味覺和舌細(xì)胞。然后擴(kuò)增和雜交RNA至基因芯片。 使用兩種分離算法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析Affymetrix Microarray Suite 5 (MAS5)，其考慮了在基因芯片上理想的匹配和不匹配探針，和robust multi-chip algorithm ( RMA )，其僅僅考慮了在基因芯片上理想的 匹配和不匹配探針。在該分析中鑒定了味覺特異性基因編碼跨膜蛋白。 3)^:在使用針對(duì)在人/小鼠基因組鑒定的所有3" 離子通道的引物進(jìn)行高通量PCR之前，首先在多至4種已知的味覺特異性基因和2種看家基因上進(jìn)行質(zhì)量控制PCR反應(yīng)以保證味覺和舌 RNA具有高質(zhì)量。檢驗(yàn)的4種已知的味覺特異性基因是G a蛋白味導(dǎo) 素、甜味受體組分T1R2、離子通道TRPM5和酶磷脂酶C同工型P 2; 檢驗(yàn)的2種看家基因是P肌動(dòng)蛋白和GAPDH。通過味覺細(xì)胞而不是舌 細(xì)胞的味覺基因特異性表達(dá)加上通過味覺和舌細(xì)胞普遍存在的看家基 因的表達(dá)表示為高質(zhì)量的RNA原料。 如果合適大小的鐠帶出現(xiàn)于味覺細(xì)胞而不是舌細(xì)胞，那 么在瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。具有這種表達(dá)圖案的基因推定為味
覺特異性基因?？寺『蜏y序所有的味覺特異性基因以確定基因同一性。
4)原位雜交 在雙標(biāo)記原位雜交中，產(chǎn)生的兩種不同的RNA探針標(biāo)記 兩種不同的基因，具體地通過基因芯片和/或PCR法鑒定兩種不同味覺 特異性基因。另外地，如果基因在味覺細(xì)胞中表達(dá)，可以產(chǎn)生一個(gè)探 針來標(biāo)記單個(gè)基因用于測定。對(duì)于雙標(biāo)記研究，用FITC探針標(biāo)記的第 一基因在熒光顯微鏡中產(chǎn)生單色，然而用地高辛(DIG)探針第二基因 在熒光顯微鏡中產(chǎn)生不同的顏色。如果基因在相同或不同的細(xì)胞類型 中表達(dá)，那么探針1和探針2顯示為疊加。例如，如果通過基因芯片 或PCR法共定位至細(xì)胞表達(dá)TRPM5來鑒定異常的離子通道，那么異常 的離子通道在負(fù)責(zé)甜味、苦味、和/或鮮味味覺的細(xì)胞中表達(dá)。相反， 如果通過基因芯片或PCR法不共定位至細(xì)胞表達(dá)TRPM5來鑒定異常的 離子通道，那么異常的離子通道在負(fù)責(zé)咸味味覺(或另 一種味覺范疇) 的不同細(xì)胞類型中表達(dá)，并且異常的離子通道可以直接包含在鈉離子 檢測中。5)免疫組織化學(xué) 在雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)中，兩種不同的抗體探針用來標(biāo) 記兩種不同的蛋白，具體地通過基因芯片或PCR法鑒定兩種不同味覺 特異性蛋白的基因。另外地，如果在味覺細(xì)胞中表達(dá)該蛋白，那么一 個(gè)抗體探針可用于標(biāo)記用于測定的單個(gè)蛋白。對(duì)于雙標(biāo)記研究，在僅 僅能夠使用根據(jù)酪胺酰胺信號(hào)放大(TSA)d敏感性檢測方法檢測d非常稀釋的濃度下標(biāo)記第 一蛋白。然后使用另 一種抗體標(biāo)記第二蛋白并
使用非TSA法檢測。通過標(biāo)準(zhǔn)的非TSA法不能檢測第一抗體；因此， 從相同種類(例如家兔多克隆的抗體)得到的兩種不同的抗體不會(huì)交 叉作用，并且因此可4皮用于雙標(biāo)記試驗(yàn)。如果蛋白在相同或不同的細(xì) 胞類型中表達(dá)，蛋白標(biāo)記1和蛋白標(biāo)記2的顯示為疊加。例如，如果 如果通過基因芯片或PCR法共定位至細(xì)胞表達(dá)TRPM5來鑒定異常的離 子通道，那么異常的離子通道在負(fù)責(zé)甜味、苦味、和/或鮮味味覺的細(xì) 胞中表達(dá)。相反，如果通過基因芯片或PCR法不共定位至細(xì)胞表達(dá) TRPM5來鑒定異常的離子通道，那么異常的離子通道在負(fù)責(zé)咸味味覺 (或另一種味覺范疇)的不同細(xì)胞類型中表達(dá)，并且異常的離子通道 可以直接包含在鈉離子檢測中。 使用以下鑒定的基因的這些原理、方法和規(guī)程包含在本 文的表中。這些表在下面作簡單的描述。
il:小鼠味覺特異性基因編碼從Affymetrix 4302. 0
微列陣/基因芯片得到的跨膜蛋白的總表。 從PCR篩選得到的人和小鼠味覺特異性離子通道
的總表。 ii:在TRPM5(甜味、苦味、鮮味)和PKD2L1/PKD1L3 (酸味)細(xì)胞中味覺特異性基因共定位的總表。 因此基于上述，本發(fā)明通常涉及用于鑒定包括涉及咸味 感覺的基因味覺基因的方法，以及在用于鑒定人咸味增強(qiáng)劑和其它味 覺調(diào)節(jié)化合物，用于鑒定調(diào)節(jié)其它的味覺細(xì)胞包括不直接與味覺傳導(dǎo) 相關(guān)的疾病和癥狀相關(guān)功能和表型潛在療法中篩選測定的用途。 本發(fā)明特別包括基于細(xì)胞測定用于鑒定咸味調(diào)節(jié)劑(增 強(qiáng)劑)的用途。這些化合物在調(diào)節(jié)人咸味感覺中具有應(yīng)用前景。例如 在電生理學(xué)測定中鑒定的化合物和它們生物學(xué)上可接受的衍生物將在 使用志愿者進(jìn)行人味覺試驗(yàn)檢測中確定它們在人咸味感覺上的影響。 此外，鑒定作為潛在療法的化合物將在取決于想要應(yīng)用性質(zhì)合適的體 外和體內(nèi)模型中評(píng)估。例如，用于糖尿病潛在療法的化合物可以在公
42知的糖尿病動(dòng)物模型如NOD小鼠模型或BB大鼠模型中評(píng)估。類似地， 用于IBD或克羅恩氏病潛在療法的化合物可以在IBD或克羅恩氏病鼠 類動(dòng)物模型中評(píng)估。 如以下進(jìn)一步地論述，用于鑒定味覺如咸味調(diào)節(jié)或治療 化合物基于細(xì)胞的測定將優(yōu)選包括高流通量篩選平臺(tái)，使用表達(dá)本文 公開的基因或其組合的細(xì)胞來鑒定調(diào)節(jié)(增加)涉及咸味感覺基因的 活性。另外，可以引入具有官能影響如影響離子(鈉)流入的限定突 變的同義突變或突變以修飾這些序列。如上所述，這些測定將優(yōu)選包
根據(jù)本發(fā)明使用熒光離子敏感染料或膜電^染料如鈉敏感^料表達(dá)離 子通道。優(yōu)選，通過使用含在卵細(xì)胞中作用的電生理學(xué)測定表達(dá)在此 鑒定(例如膜片鉗或二電極電壓鉗)的離子通道來篩選鑒定調(diào)節(jié)這些 離子通道的化合物。 仍有另外地，通過離子流動(dòng)測定如放射性標(biāo)記離子流動(dòng) 測定或原子吸收光鐠偶合離子流動(dòng)測定可以檢測調(diào)節(jié)推定包含咸味的 目標(biāo)離子通道的化合物。如上面所公開，這些化合物在調(diào)節(jié)人咸味感 覺或用于調(diào)節(jié)包括異?；驑?biāo)準(zhǔn)離子通道功能的其它生物進(jìn)程中具有應(yīng) 用前景。 基于目標(biāo)細(xì)胞的測定使用在想得到細(xì)胞表達(dá)的突變體 核酸序列，優(yōu)選卵細(xì)胞或人細(xì)胞如HEK-293細(xì)胞，或通常用于篩選鑒 定離子通道或GPCR調(diào)節(jié)化合物的其它人或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些細(xì)胞可 以進(jìn)一步設(shè)計(jì)表達(dá)其它序列如其它味覺GPCR,即通過在本發(fā)明受讓人 Senomyx其它專利申請(qǐng)中描述的T1R或T2R以及合適的G蛋白。卵細(xì) 胞系統(tǒng)是有利的，這是由于卵細(xì)胞系統(tǒng)允許直接注入多重mRNA種類用 于高蛋白表達(dá)和可以接受離子通道超量表達(dá)固有的有害作用。然而使 用兩棲類卵母細(xì)胞進(jìn)行電生理學(xué)篩選的缺點(diǎn)是不能接受大量化合物的 高流通量篩選和不是一種哺乳動(dòng)物系統(tǒng)。作為注意的是，本發(fā)明包含 使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的測定，優(yōu)選高流通量測定。已知推定包含在咸味(ENaC )蛋白的一些離子通道是形成由三個(gè)亞基ct P和Y或A亞基組成的異側(cè)通道。這些各自ENaC亞基 的序列在本發(fā)明受讓人在美國系列號(hào)10/133, 573的較早專利申請(qǐng)中 公開，其全文在此引用作為參考。在合適的細(xì)胞中共表達(dá)產(chǎn)生具有陽 離子通道活性的異源三聚體；特別是它響應(yīng)鈉離子并將同樣響應(yīng)基于 細(xì)胞測定中的鋰離子，如本文和在上述參考的Senomyx在先申請(qǐng)公開 的那些離子。 通過參考文獻(xiàn)并入的Senomyx申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂貌溉閯?dòng) 物細(xì)胞轉(zhuǎn)染或種入孔或培養(yǎng)平板中的高流通量篩選測定，其中在測試 化合物存在下允許進(jìn)行官能表達(dá)和使用膜潛在熒光或離子(鈉)熒光 染料檢測活性。 如以上所討論，本發(fā)明特別地提供篩選人咸味或其它味 覺范疇以及使用本文提供核酸和蛋白、序列靶向其它味覺細(xì)胞功能或 表型的調(diào)節(jié)劑如活化劑、抑制劑、激活劑、增強(qiáng)劑等的方法。這些調(diào) 節(jié)劑可以影響咸味或其它味覺范疇或味覺細(xì)胞相關(guān)功能和表型，如通 過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、mRNA或蛋白穩(wěn)定性、通過改變具有胞膜或其它分 子的離子通道的相互作用；或通過影響離子通道蛋白活性。例如使用 高流通量篩選(HTS)篩選化合物以鑒定可以結(jié)合和/或調(diào)節(jié)味覺受體
或味覺離子通道多肽或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其片段的那些化合物。在本發(fā)明中， 在細(xì)胞如人細(xì)胞或蛙卵細(xì)胞中重組表達(dá)蛋白，通過使用離子通道、受 體或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的任意測定，如膜電位的測定或胞內(nèi)鈉離子或鋰離 子水平改變的測定。測定離子如陽離子、通道功能的方法，包括例如 膜片鉗技術(shù)、二電極電壓鉗、全部細(xì)胞電流的測定和熒光圖象技術(shù)， 其使用離子敏感熒光染料和離子流動(dòng)測定，如放射性標(biāo)記離子流動(dòng)測 定或離子流動(dòng)測定。 進(jìn)一步地，如前面提及，本發(fā)明進(jìn)一步提供了分離、純 化和標(biāo)記想得到的味覺細(xì)胞類型和味覺包括如鮮味、甜味、咸味、苦 味、油脂味、酸味、金屬味以及味覺干細(xì)胞和其它味覺細(xì)胞譜系，包 括辨別進(jìn)入味蕾細(xì)胞、味覺細(xì)胞神經(jīng)元、味覺免疫細(xì)胞等細(xì)胞的方法， 這些細(xì)胞基于一種或多種在此提供的味覺特異基因。這些分離和提純
44法包括陽性和陰性細(xì)胞分離法。例如通過陽性細(xì)胞選擇方法分離，如
通過使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)，磁珠細(xì)胞選擇如通過目視鑒定 想得到的細(xì)胞如通過使用電生理學(xué)抗體包被小球的個(gè)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。另 外地，通過陰離子細(xì)胞純化和隔離法可以回收或純化想得到的味覺細(xì) 胞譜系或類型，其中通過除去一個(gè)或多個(gè)不想要的細(xì)胞譜系，從混合 細(xì)胞群體中富集或純化想得到的細(xì)胞類型，例如通過使包含想得到的 味覺細(xì)胞和不想要的細(xì)胞的混合細(xì)胞群體與對(duì)靶基因特異的細(xì)胞毒素 抗體接觸，所述靶基因在將被除去的不想要的味覺細(xì)胞類型上表達(dá)。 本文鑒定的味覺特異性基因報(bào)道在表l、 2和3中，其 可作為鑒定和/或純化包括如甜味、鮮味、酸味、苦味、咸味、油脂味 和其它味覺細(xì)胞包括干細(xì)胞的特異性味覺細(xì)胞的標(biāo)記物使用。在一個(gè) 實(shí)施方案中，針對(duì)至少一種由包含于表l、 2或3的基因或直向同源或 其變異體編碼蛋白抗體，可用于標(biāo)記包含于味覺細(xì)胞如味蕾細(xì)胞的混 懸液或源于胃腸道細(xì)胞包括味覺細(xì)胞如通過酶消化和組織解聚作用產(chǎn) 生的混懸液的細(xì)胞(參見如Herness M. A. ， Neuroscience Letters 106:60-64 ( 1989 )等，其教導(dǎo)用于分離哺乳動(dòng)物味蕾的解離方法)。 同時(shí)，通過利用熒光細(xì)胞激活分離器(FACS)可實(shí)現(xiàn)想得到味覺細(xì)胞 譜系或亞型的分離(參見如 Beavis， AJ and Pennline KJ Biotechniques 21: 498-503 ( 1996 ))，或通過使用》茲珠細(xì)胞分離 技術(shù)(參見如Jurman等人，Biotechniques 17:887-881 ( 1994 )， 其參考文獻(xiàn)報(bào)道了使用抗體包被小球轉(zhuǎn)染細(xì)胞的目視鑒定)或通過使 用通常本領(lǐng)域已知的其它方法，用于分離、純化、標(biāo)記和/或富集包含
于基于一種或幾種標(biāo)記基因表達(dá)的混合細(xì)胞群體所想得到的細(xì)胞。同 時(shí)，屬于大肺泡上皮細(xì)胞亞類的細(xì)胞可以通過陰性細(xì)胞選擇法純化或 富集，其消除了如表示非靶標(biāo)味覺細(xì)胞亞類的非靶標(biāo)細(xì)胞，通過使用 方法消除非靶標(biāo)細(xì)胞，如通過對(duì)一種或幾種非靶標(biāo)味覺細(xì)胞亞類特異 性細(xì)胞毒素抗體與混合細(xì)胞群體接觸。 同時(shí)，本發(fā)明提供了使用包含于表l、 2或3的目標(biāo)味 覺特異性基因或直向同源或其變異體的方法和針對(duì)它們的特異性標(biāo)記
45物或探針如抗體或低聚核苷酸的用途，其可以用可檢測的標(biāo)記如放射 性核素、熒光團(tuán)、酶等標(biāo)記，這些標(biāo)記物和探針對(duì)一個(gè)或多個(gè)患者味 覺特異性基因是特異性的，如在包含細(xì)胞的舌和口腔映射區(qū)域，其涉 及特異性味覺范疇如鮮味、甜味、苦味、咸味、酸味、油脂味、金屬
味等，以及涉及非味覺特異性功能如在此鑒定的細(xì)胞，胃腸道和表達(dá) 特異性味覺特異基因的相關(guān)器官特異性區(qū)域的映射，因此其涉及一個(gè) 或多個(gè)在此公開的味覺細(xì)胞特異性功能，和/或在味覺細(xì)胞分化研究中 目標(biāo)基因的用途，例如用于鑒定誘導(dǎo)味覺干細(xì)胞和其它多能性或未成 更具體地說，本發(fā)明涉及新的原理、方法和測定，其包 括鑒定和說明包括那些起咸味受體作用的新味覺特異性基因的電生理 學(xué)測定。 人們普遍相信，通過鈉或其它的離子通道以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 和GPCR在味覺細(xì)胞中特異性表達(dá)可以部分地介導(dǎo)人咸味覺。因此，本 發(fā)明提供用于鑒定味覺特異性基因的方法，其包括使用基因芯片和 PCR方法的可調(diào)節(jié)咸味的基因以及其它的味覺范疇和味覺細(xì)胞介導(dǎo)功 能和表型。本文鑒定的化合物和它們的衍生物結(jié)合和/或調(diào)節(jié)味覺特異 性基因，在此所提供的功能在作為味覺調(diào)節(jié)劑以及作為療法如用于治 療胃腸和代謝失調(diào)如糖尿病、肥胖、惡病質(zhì)等上是有用的。
定義"推定的咸味受體或離子通道基因"指的是在味覺細(xì)胞
中特異性表達(dá)的基因，其在舌細(xì)胞中不表達(dá)或在舌細(xì)胞中基本上很少 表達(dá)，此外，優(yōu)選在表達(dá)T1R、 T2R、 TRPM5或PKD2L1/PKD1L3基因的
味覺細(xì)胞中不表達(dá)。"味覺細(xì)胞"指的是一種細(xì)胞，當(dāng)成熟表達(dá)至少一個(gè)受 體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或離子通道時(shí)，其直接或間接地控制或調(diào)節(jié)特異性味覺 范疇如甜味、酸味、鮮味、咸味、苦味、油脂味、金屬味或其它味覺 感覺或整體味感感覺如味覺強(qiáng)度或味覺響應(yīng)的持續(xù)時(shí)間。味覺細(xì)胞表達(dá)mRNA和/或基因C6orfl5 (染色體閱讀框15)的蛋白-亦稱為STG。 該基因已被(M. Neira等人，通過激光捕獲顯微分離發(fā)現(xiàn)對(duì)味蕾特異 性的新的基因(mSTG) Mammalian Genome 12: 60-66 ( 2001 ))描 述為味覺特異性基因，并且是本文報(bào)道小鼠味覺特異性基因之一。此 外，成熟的味覺受體細(xì)胞一般將表達(dá)cx ENaC的mRNA和/或蛋白。我 們有數(shù)據(jù)(沒有在本文中顯示)顯示oc ENaC在至少甜味、苦味、鮮 味、酸味和最可能是咸味的味覺細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步地，成熟的味覺 受體細(xì)胞一般將在細(xì)胞角蛋白19的mRNA和/或蛋白中表達(dá)。該蛋白 僅僅在成熟的味覺細(xì)胞而在基細(xì)胞或干細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)。(L. Wong 等人， "Keratin-like immunoreactivity in receptor cells of 謹(jǐn)malian taste buds". Chemical Senses 19( 3 ): 251-264 ( 1994 ))。 此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于它們的特有的形態(tài)可以鑒定味覺細(xì)胞。特 別地，成熟的味覺受體味覺細(xì)胞是長形和梭形的。同時(shí)，成熟的味覺 受體細(xì)胞的細(xì)胞(頂膜)的頂點(diǎn)深入味孔中，因此能夠進(jìn)入或暴露于 唾液。相反，不成熟的味覺細(xì)胞如基細(xì)胞或干細(xì)胞散落各處并且不能 進(jìn)入或暴露于唾液。同時(shí)，不同于成熟的味覺細(xì)胞，基細(xì)胞或干細(xì)胞 傾向于定位在味蕾的底部。"化學(xué)感覺細(xì)胞"是涉及感受化學(xué)興奮劑如味覺剌激物 和其它化學(xué)感覺刺激物如添味劑的細(xì)胞。當(dāng)成熟表達(dá)一個(gè)或多個(gè)味覺 受體時(shí)，本文的化學(xué)感覺細(xì)胞特別包括特定味覺受體細(xì)胞和包含在消 化或泌尿道或其它器官的細(xì)胞。例如，已知胃腸化學(xué)感覺細(xì)胞表達(dá)TIR 或T2R，這些細(xì)胞可能涉及食物感受、代謝功能、消化、糖尿病、食 物吸收、胃動(dòng)力等。此外，在泌尿道發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞可能表達(dá)咸味受體， 并涉及鈉轉(zhuǎn)運(yùn)、與排泄和功能相關(guān)的如血壓和體液滯留。進(jìn)一步地， 在消化系統(tǒng)表達(dá)味覺受體的化學(xué)感覺細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)泌顆粒標(biāo)記物 的嗜鉻粒蛋白 A。 ( C. Sternini， "Taste Receptors in the Gastrointestinal Tract. IV. Functional Implications of Bitter Taste Receptors in Gastrointestinal Chemosensing". American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 11
47292:G457-G461， 2007 )。 本文的"味覺細(xì)胞特異性基因"指的是通過味覺細(xì)胞如 輪廓味覺細(xì)胞特異性表達(dá)的基因，其不能通過涉及味覺或非味覺相關(guān) 味覺細(xì)胞功能或表型的舌細(xì)胞來特異性表達(dá)。味覺細(xì)胞包括在口腔中 表達(dá)如舌和味覺細(xì)胞的味覺受體、在身體的其它區(qū)域如消化系統(tǒng)和泌 尿道表達(dá)味覺受體。這些基因包括列于表l、 2和3中登錄號(hào)的那些基 因以及其直向同源、等位變異體、嵌合體、在嚴(yán)格雜交條件下雜交的 基因和/或編碼具有至少80%、更優(yōu)選至少90%并且甚至更優(yōu)選至少95% 任意上述物質(zhì)的蛋白的基因。 這些味覺細(xì)胞特異性基因包括涉及味覺和非味覺相關(guān) 功能如味覺細(xì)胞更新、影響消化系統(tǒng)或口腔的疾病、口腔和/或消化系 統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)、包括味覺細(xì)胞的消化和代謝功能如糖尿病、肥胖、血 壓、體液滯留等。在此作為注意的這些基因，關(guān)于特定味覺鑒定的特 異性基因包括列于表l、 2和3中登錄號(hào)的核酸序列以及其直向同源、 嵌合體和包括其等位變異的變異體。特別地，這些變異體包括編碼多 肽序列為至少80%、更優(yōu)選至少90%或95%相同于通過相當(dāng)于敘述的登 錄號(hào)基因編碼的多肽，或相當(dāng)于其直向同源特別是人和非人靈長類動(dòng) 物直向同源的基因編碼多肽。此外，該基因包括在嚴(yán)格雜交條件下與 相當(dāng)于基因序列之一(相當(dāng)于本文表中敘述的基因登錄號(hào))雜交的核 酸序列。"陽離子通道，，是控制陽離子通過細(xì)胞膜流動(dòng)的不同蛋 白組。 一般地，特異陽離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)特定陽離子的能力隨陽離子的原 子價(jià)以及特定陽離子給定通道特異性而變化。 "同數(shù)通道(homomeric channel)"指的是由相同a 亞基組成的陽離子通道，然而"異數(shù)通道"指的是由兩種或更多不同類 型a亞基組成的陽離子通道。同數(shù)和異數(shù)通道都可以包括輔助的P亞 基。 " P亞基"是由cx亞基組成陽離子通道的輔助亞基的多 肽單體；然而P亞基不能單獨(dú)形成通道(例如參見美國專利號(hào)5, 776, 734 )。例如，已知P亞基通過幫助a亞基到達(dá)細(xì)胞表面而增加
通道數(shù)目并改變天然配體結(jié)合通道的敏感度。P亞基可以在小孔區(qū)域 的外部并與包含小孔區(qū)域的oc亞基相聯(lián)系。它們還可以促進(jìn)小孔區(qū)域
外部成口 。 術(shù)語"可信的"或"野生型"或"天然的"核酸序列是指列 于本文表中野生型核酸序列以及拼接變異體和其它本領(lǐng)域通常所知道 的核酸序列。 術(shù)語"可信的"或"野生型"或"天然的"核酸序列是指通 過列于本文表基因和核酸序列編碼的多肽。 術(shù)語"修飾增加受體核酸序列"或"最優(yōu)化核酸序列"指 的是包含一個(gè)或突變的核酸序列，特別是在重組宿主細(xì)胞和最特別是 卵細(xì)胞或人細(xì)胞如HEK-293細(xì)胞中影響(抑制或增加)基因活性的那 些核酸序列。特別地，這些突變包括含有突變亞基序列合成的離子通 道影響開啟的那些突變。在構(gòu)成特定離子通道三個(gè)亞基的一個(gè)或幾個(gè) 突變中，離子通道可包含該突變。例如，在影響(損害)開啟功能或 缺乏外層表達(dá)的一個(gè)亞基中，修飾的核酸序列可包含取代突變。本發(fā) 明包含其它突變基因序列的用途，即拼接變異體、包含缺失或增加的 那些變異體和目標(biāo)序列的嵌合體等。進(jìn)一步地，本發(fā)明能使用可修飾 引入宿主細(xì)胞優(yōu)選密碼子、特別是兩棲動(dòng)物或人宿主細(xì)胞優(yōu)選密碼子 的序列。 術(shù)語受體或離子通道蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其片段，或根據(jù) 本發(fā)明編碼特定味覺受體或離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其片段的核酸指的 是核酸和多肽多形變異體、等位基因、突變體和種間同源物(l)氨 基酸序列，其與味覺蛋白的野生型核酸或氨基酸序列編碼，如由本文 列于表中基因核酸序列以及其片段編碼的蛋白的氨基酸序列相比，具 有大于約60%氨基酸序列同一性、65%、 70%、 75°/。、 80%、 85%、 90%， 優(yōu)選91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96°/。、 97%、 98%或99°/。或更大的氨基 酸序列同一性，優(yōu)選大于至少約25、 50、 100、 200、 500、 IOOO或更 多氨基酸的區(qū)域，及其保守修飾的變異體；(3)由核酸序列編碼的多
49肽，其在嚴(yán)格雜交條件下與相當(dāng)于核酸序列編碼通過所述基因之一的
編碼基因特異性雜交，及其保守修飾的變異體；(4)核酸序列，其與
如本文公開的核酸具有大于約60%序列同一性、65%、 70%、 75%、 80%、85%、 90%，優(yōu)選91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%或更大的氨基酸序列同一性，優(yōu)選大于至少約25、 50、 100、 200、 500、1000或更多核苷酸的區(qū)域。 —般地，從哺乳動(dòng)物包括但不限于靈長類動(dòng)物，如人；鼠類，如大鼠、小鼠、倉鼠；奶牛、豬、馬、綿羊或任何哺乳動(dòng)物中得到推定咸味或其它味覺特異性基因或多核苷酸或多肽序列。本發(fā)明的核酸和蛋白包括天然存在或重組分子。 一般地，這些基因?qū)⒕幋a具有離子通道即它們能滲透鈉或鋰離子的蛋白。 通過"測定功能影響"或"測定在細(xì)胞上的影響"意指測定化合物在味覺基因，優(yōu)選在此鑒定的咸味基因影響下間接或直接增加或減少參數(shù)的影響，如功能、物理、表型和化學(xué)的影響。這些功能影響包括但不局限于離子流動(dòng)、膜電位、電流振幅、和電壓門控中的改變，以及其它的生物效應(yīng)如任意標(biāo)記基因等的基因表達(dá)中的改變。離子流動(dòng)可以包括通過通道如鈉或鋰離子通道和其類似物如放射性同位元素的任意離子。這些功能影響可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意方法如膜片鉗、使用壓敏染料或通過測定參數(shù)如光譜特性(例如熒光、吸光度、折射指數(shù))、水力的(例如成型)、色譜或溶解度性能來測定。 多核苷酸和多肽序列表達(dá)目標(biāo)味覺細(xì)胞的"抑制劑，，、"活化劑，，和"調(diào)節(jié)劑，，用來指使用這些多核苷酸和多肽序列的體外和體內(nèi)測定激活、抑制或調(diào)節(jié)鑒定的分子。抑制劑是化合物，如這些味覺特異性蛋白的結(jié)合、部分或完全阻斷活性、降低、防止、延遲活化、滅活、脫敏或下調(diào)活性或表達(dá)，例如是拮抗劑。"活化劑"是增加、開啟、激活、促進(jìn)、增加活化、敏化、折磨或下調(diào)蛋白活性的化合物。抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑還包括目標(biāo)味覺細(xì)胞特異性蛋白的遺傳改良形式，例如改變活性的形式以及天然地存在和合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、肽、環(huán)肽、核酸、抗體、反義分子、siRNA、核糖酶、小的有機(jī)分子等。用于抑制劑和活化劑的這些測定包括如體外、細(xì)胞、細(xì)胞提取物或細(xì)胞膜中表達(dá)目標(biāo)味覺細(xì)胞特異蛋白、應(yīng)用推定調(diào)節(jié)劑化合物，然后測定在如上所述活性上功能影響。 包含通過本文鑒定基因編碼蛋白的樣品或測定，即用潛在的活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑與之比較沒有抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品處理，檢驗(yàn)活化或色移調(diào)控的程度。對(duì)照樣品(未經(jīng)處理，具有抑制劑)被指定為相對(duì)蛋白活性值為100%。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì)照物為約80%，優(yōu)選50%，更優(yōu)選25-0%時(shí)，達(dá)到離子通道的抑制。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì)照物(未經(jīng)處理，具有活化劑)為110%，更優(yōu)選150%，更優(yōu)選200-500% (即相對(duì)于對(duì)照物高2-5倍)、更優(yōu)選1000-3000%或更高時(shí)，達(dá)到離子通道的活化。 本文使用的術(shù)語"檢測化合物"或"藥物候選物"或"調(diào)節(jié)劑，，或語法上的等同物描述了任意分子，或者天然存在或合成的化合物，優(yōu)選小分子或蛋白、寡肽(例如，從約5至約25個(gè)氨基酸長度，優(yōu)選從約10 20或12至18個(gè)氨基酸長度，優(yōu)選12、 15或18個(gè)氨基酸長度)、小的有機(jī)分子、多醣、脂類、油脂酸、多核苷酸、siRNA、低聚核苷酸、核酶等，用于檢測調(diào)節(jié)冷覺的能力。檢測化合物可形成檢測化合物庫，如提供多樣性足夠范圍的組合或隨機(jī)庫。檢測化合物任選與融合伴侶相關(guān)，如靶向化合物、援救化合物、二聚化合物、穩(wěn)定化合物、可尋址化合物和其它功能部分。通常，通過鑒定檢測化合物(稱為"先導(dǎo)化合物")產(chǎn)生具有有用性能的新化學(xué)實(shí)體，其具有某些合乎要求的性質(zhì)或活性如抑制活性，創(chuàng)造先導(dǎo)化合物的變異體和評(píng)估那些變異化合物的性能和活性。進(jìn)行這樣的分析常常使用高流通量篩選(HTS)法。"小的有機(jī)分子"指的是一種天然地存在或合成的有機(jī)分子，其具有分子量超過約50道爾頓和小于約2500道爾頓，優(yōu)選小于約2000道爾頓，優(yōu)選在約100至約1000道爾頓之間，更優(yōu)選在約200至約500道爾頓之間。
51
"生物樣品"包括組織部分如活體解剖和尸體解剖樣品，以及用作組織學(xué)目的的冷凍部分。這些樣品包括血液、唾液、組織、培養(yǎng)細(xì)胞，例如原始培養(yǎng)、外植體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞、糞便、尿等。 一般地從真核生物體中獲得生物樣品，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物如靈長類動(dòng)物，例如黑猩猩或人；奶牛；狗；貓；鼠類如豚鼠、大鼠、小鼠；家兔；或鳥類；爬蟲；或魚類。 在兩個(gè)或更多核酸或多肽序列的范圍內(nèi)，術(shù)語"相同的"或百分比"相同"指的是使用具有如下所述缺省參數(shù)的BLAST或BLAST2. 0序列比較算法測定兩個(gè)或更多序列或子序列相同或氨基酸殘基或核苷酸的規(guī)定百分比相同(即當(dāng)在一個(gè)比較窗或指定區(qū)域上比較和調(diào)整最大一致性時(shí)，在規(guī)定區(qū)域內(nèi)(例如列于本文表內(nèi)的基因或序列)約60。/。相同，優(yōu)選65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、94%、 95°/。、 96%、 97%、 98%、 99°/。、或更高相同)，或者通過手工定位和目測(參見，如NCBI網(wǎng)址等)。然后這些序列稱為"基本相同，，。該定義還引用或可以應(yīng)用于檢測序列的問候。該定義同時(shí)包括具有缺失和/或增加的序列，以及被置換的那些序列。如如下所述，優(yōu)選的算法可以解釋缺口染色體等。優(yōu)選同一性存在于至少約25個(gè)氨基酸或核
苷酸長度的區(qū)域，或更優(yōu)選50-100個(gè)氨基酸或核苷酸長度的區(qū)域。為了序列對(duì)比，通常將一個(gè)序列作為參照序列，將實(shí)驗(yàn)序列與其對(duì)比。當(dāng)使用序列對(duì)比算法時(shí)，將實(shí)驗(yàn)和參照序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)，在必要時(shí)，指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地，可以使用缺省程序參數(shù)，或者可以指定備選參數(shù)。序列對(duì)比算法然后基于程序參數(shù)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)序列相對(duì)于參照序列的序列同一性百分比。
〖00144]本文使用的"對(duì)比窗"包括選自20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150個(gè)鄰近位置數(shù)目中的任一個(gè)區(qū)段，其中在最佳地比對(duì)2個(gè)序列后，可以將序列與相同數(shù)目的鄰近位置的參照序列相對(duì)比。用于對(duì)比的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域眾所周知的?？梢赃M(jìn)行用于對(duì)比的最佳序列比對(duì)，例如，通過31^讓& Waterman, Adv.Appl. Math. 2482 ( 1981 )的局部同源性算法，通過Needleman &200780021087.9
Wunsch， J. Mol. Biol. 48443 ( 1970 )的同源性比對(duì)算法，通過Pearson& Lipman， Proc. Nat". Acad. Sci. USA 852444 ( 1988 )的搜索相似性方法，通過計(jì)算機(jī)執(zhí)行的這些算法(G AP， BESTFIT， FASTA，和TFASTA，在Wisconsin Genetics軟件包中，Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr. ， Madison, Wis.)，或通過手工t匕對(duì)和目檢(參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology ( Ausubel等人，編.1995增刊))。適用于測定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是BLAST和BLAST 2. 0算法，它們分別描述在Altschul等人，Nucl. Acids Res. 253389-3402 ( 1977 )和Altschul等人，J.Mol. Biol. 215403-410 ( 1990 )。使用具有本文所述參數(shù)的BLAST和BLAST 2. Q來測定本發(fā)明核酸和蛋白的序列同一性百分比。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可以從國家生物技術(shù)信息中心(National Centerfor Biotechnology Information) 7>開得到。該算法包含，首先通過鑒定查詢序列中長度W的短字，鑒定高計(jì)分序列對(duì)(HSPs)，所述短字在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對(duì)時(shí)，匹配或滿足一些正值閾值計(jì)分T。 T稱作鄰域字計(jì)分閾值(Altschul等人，同上)。這些最初的鄰域字采樣用作開始發(fā)現(xiàn)含有它們的更長HSP的搜索的種子。然后沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向延伸所述字采樣，直到累積的比對(duì)計(jì)分提高。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)M (匹配的殘基對(duì)的獎(jiǎng)勵(lì)分；總是>0)和N (錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)來計(jì)算累積的計(jì)分。對(duì)于氨基酸序列，使用計(jì)分矩陣來計(jì)算累積的分?jǐn)?shù)。在下述情況時(shí)停止在每個(gè)方向上字采樣的延伸累積的比對(duì)分?jǐn)?shù)從其達(dá)到的最大值下降了數(shù)值X;
由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的積累，累積的計(jì)分達(dá)到零或低于零；或到達(dá)任何一個(gè)序列的結(jié)尾。BLAST算法參數(shù)W、 T和X決定了比對(duì)的敏感性和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)默認(rèn)使用的是wordlength (W) 11， expectation (E) 10， M = 5， N - -4，比較兩個(gè)鏈。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)使用的是，wordlength(W)3， expectation (E) 10，和BL0SUM62計(jì)分矩陣(參JS Henikoff &
53Henikoff，尸roc. ScA89:10915 ( 1989 ))比對(duì)
(B) 50， expectation (E) 10， M=5， N=-4，比較兩個(gè)鏈。"核酸"是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其單鏈或 雙鏈形式的聚合物，和其補(bǔ)體。該術(shù)語包括含有已知的核苷酸類似物 或修飾的主鏈殘基或連接的核酸，它們是合成的、天然產(chǎn)生的和非天 然產(chǎn)生的，具有與參照核酸類似的結(jié)合性質(zhì)，且以與參照核苷酸類似 的方式代謝。這樣的類似物的實(shí)例包括、但不限于，硫代磷酸酯，氨 基磷酸酯，甲基磷酸酯，手性-甲基磷酸酯，2-0-曱基核糖核苷酸， 肽-核酸(PNAs)。除非另有說明，特定核酸序也暗含其保守修飾變體(例
如，簡并密碼子置換)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體而言， 簡并密碼子置換可以通過產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)選定的(或全部)密碼
子的第三個(gè)位置被置換為混合堿基和/或脫氧肌苷殘基的序列來實(shí)現(xiàn) (Batzer等人，Nucleic acid Res. 195081 ( 1991 ) ; 0htsuka等 人，J. Biol. Chem. 2602605-2608 ( 1985 ) ; Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 891-98 ( 1994 ))。術(shù)語核酸與基因、cDNA、 mRM、 寡核苷酸和多核苷酸互換地使用。特定核酸序列也暗含"拼接變體"。類似地，由核酸編 碼的特定蛋白暗含由該核酸的拼接變體編碼的任意蛋白。如名稱所指 出的，"拼接變體，，是基因的替換拼接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后，可以拼接最 初的核酸轉(zhuǎn)錄物，使得不同的(替換的)核酸拼接產(chǎn)物編碼不同的多 肽。生成拼接變體的機(jī)理可以變化，但是包括外顯子的替換拼接。該 定義也包括通過通讀轉(zhuǎn)錄從相同核酸衍生的替換多肽。該定義包括拼 接反應(yīng)的任意產(chǎn)物，包括拼接產(chǎn)物的重組形式。在Leicher，等人，J. Biol. Chem. 273 ( 52 ) 35095-35101 ( 1998 )中討論了鉀通道拼接 變體的一個(gè)實(shí)例。術(shù)語"多肽，，、"肽"和"蛋白，，在本文中互換地用于 指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是 對(duì)應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模仿物的氨基酸聚合物、以及天
54然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語"氨基酸，，是指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸，以及 氨基酸類似物和氨基酸模仿物，它們以類似于天然存在的氨基酸的方 式起作用。天然產(chǎn)生的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及以后 修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸，Y -羧基谷氨酸，和0-磷酸絲氨 酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu) 的化合物，即碳結(jié)合氬、羧基、氨基和R基團(tuán)，例如，高絲氨酸，正 亮氨酸，蛋氨酸亞砜，蛋氨酸甲基锍。這樣的類似物具有修飾的R基 團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但是保留與天然存在的氨基 酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模仿物是指具有不同于氨基酸的一般 化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)、但是以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化 合物。氨基酸在本文中可以用IUPAC-IUB生化命名委員會(huì)推薦 的它們的普遍已知的三字母符號(hào)或單字母符號(hào)來表示。同樣地，核苷 酸可以用它們的普遍接受的單字母代碼來表示。"保守修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定 核酸序列，保守修飾變體是指編碼相同的或基本上相同的氨基酸序列 的那些核酸，或其中核酸不編碼氨基酸序列，至基本相同的序列。因 為遺傳密碼的簡并，大量功能上相同的核酸編碼任意給定蛋白。例如， 密碼子GCA， GCC, GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因而，在密碼子 指定為丙氨酸的每個(gè)位置，可以將密碼子改變?yōu)槿我獾膶?duì)應(yīng)的所述密 碼子，而不改變編碼的多肽。這樣的核酸變化是沉默變化，它們是保 守修飾變化的一種類型。本文的編碼多肽的每個(gè)核酸序列也描述了核 酸的每個(gè)可能的沉默變化。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以修飾核酸中的每 個(gè)密碼子(例外是AUG，它通常是蛋氨酸的唯一密碼子，和TGG，它通 常是色氨酸的唯一密碼子)，以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼 多肽的核酸的每個(gè)沉默變化暗含在每個(gè)所述的序列中，這是就表達(dá)產(chǎn) 物而言，而不是就實(shí)際的探針序列而言。關(guān)于氨基酸序列，技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)核酸、肽、多
55肽或蛋白序列的單個(gè)置換、刪除或添加(它會(huì)改變、添加或刪除編碼 的序列中的單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸)是保守修飾變體，其中 改變導(dǎo)致化學(xué)類似的氨基酸對(duì)氨基酸的置換。提供功能上類似的氨基 酸的保守置換表是本領(lǐng)域眾所周知的。這樣的保守修飾變體在本發(fā)明 的多形變體、種間同系物和等位基因之外，且不排除它們。下面的8組各自含有彼此可保守置換的氨基酸1)丙 氨酸(A )，甘氨酸(G ) ; 2 )天冬氨酸(D )，谷氨酸(E ) ; 3 ) 天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)，賴氨酸(K);
5) 異亮氨酸U)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V);
6) 苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W); 7)絲氨酸(S)， 蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(參見，例如， Creighton, Proteins (1984))。大分子結(jié)構(gòu)例如多肽結(jié)構(gòu)可以以不同的組構(gòu)水平來描 述。關(guān)于該組構(gòu)的一般討論，參見，例如，Alberts等人，Molecular Biology of the Cell (第3版，1994 )和Cantor和Schimmel， Biophysical Chemistry Part I : The Conformation of Biological Macromoleculars ( 1980 )。"一級(jí)結(jié)構(gòu)，，是指特定肽的氨基酸序列。 "二級(jí)結(jié)構(gòu)，，是指多肽內(nèi)的局部有序的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常稱作 結(jié)構(gòu)域，例如，跨膜結(jié)構(gòu)域、孔結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域是形 成多肽的緊湊單元的多肽部分，通常是15至350個(gè)氨基酸長。示例性 的結(jié)構(gòu)域包括胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。典型的結(jié)構(gòu)域 由更小的組構(gòu)件組成，例如多個(gè)p-折疊和ot-螺旋。"三級(jí)結(jié)構(gòu)"是 指多肽單體的完整三維結(jié)構(gòu)。"四級(jí)結(jié)構(gòu)，，是指由獨(dú)立的三級(jí)單元的
單價(jià)結(jié)合形成的三維結(jié)構(gòu)。各向異性術(shù)語也稱作能量術(shù)語。"標(biāo)記"或"可檢測部分"是通過分光、光化學(xué)、生化、 免疫化學(xué)、化學(xué)或其它物理方式可檢測出的組分。例如，有用的標(biāo)記 包括"P，熒光染料，電子密度試劑，酶(例如，常用于ELISA)，生 物素，異羥基洋地黃毒戒元，或半抗原和蛋白，它們可以通過例如將放 射性標(biāo)記摻入肽或用于檢測與肽特異性反應(yīng)的抗體來變得可檢測。
當(dāng)提及例如細(xì)胞、或核酸、蛋白或載體時(shí)使用的術(shù)語"重 組"是指，該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已經(jīng)通過引入異源核酸或蛋白 或天然核酸或蛋白的改變來修飾，或該細(xì)胞源自這樣修飾的細(xì)胞。因 而，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然的(非重組的)形式的細(xì)胞中不存在 的基因，或表達(dá)否則異常表達(dá)的、低表達(dá)的或根本不表達(dá)的天然基因。當(dāng)提及核酸的一部分時(shí)使用的術(shù)語"異源"是指，該核 酸包含在自然界中在彼此相同的關(guān)系中不存在的2個(gè)或多個(gè)子序列。 例如，該核酸通常是重組生產(chǎn)的，具有2個(gè)或多個(gè)來自不相關(guān)基因的 序列，它們排列產(chǎn)生一個(gè)新的功能核酸，例如，來自一個(gè)來源的啟動(dòng) 子和來自另一個(gè)來源的編碼區(qū)。類似地，異源蛋白是指，該蛋白包含 在自然界中在彼此相同的關(guān)系中不存在的2個(gè)或多個(gè)子序列(例如， 融合蛋白)。短語"嚴(yán)格雜交條件"是指這樣的條件，在該條件下， 探針會(huì)與它的目標(biāo)子序列雜交，通常在核酸的復(fù)雜混合物中，但是不 與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，且在不同環(huán)境下是不同 的。更長的序列在更高的溫度特異性地雜交。核酸雜交的廣泛指南參 見Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays ( 1993 )。 一般而言，選擇的嚴(yán)格條件比特定序列在確定的離子強(qiáng)度、pH下的熱 解鏈點(diǎn)(Tm)低約5-10t:。 Tm是50n/。的與靶物互補(bǔ)的探針與靶序列雜 交平衡時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)(由于靶序 列過量存在，在Tm， 50。/。的探針被平衡地占據(jù))。嚴(yán)格條件也可以通 過加入去穩(wěn)定劑例如曱酰胺來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性的或特異性的雜交， 陽性信號(hào)至少是背景的2倍，優(yōu)選背景雜交的10倍。示例性的嚴(yán)格雜 交條件可以如下50°/。甲酰胺，5X SSC，和1。/。 SDS，在"1C溫育，或 者，5X SSC， 1% SDS，在65匸溫育，在65T在0. 2X SSC和0. 1% SDS 中洗滌。如果它們編碼的多肽是基本上相同的，在嚴(yán)格條件下彼
57此不雜交的核酸是基本上相同的。這發(fā)生在例如使用遺傳密碼允許的 最大密碼子簡并建立核酸拷貝時(shí)。在這樣的情況下，核酸通常在中等
嚴(yán)格雜交條件下雜交。示例性的中等嚴(yán)格雜交條件包括，在37匸在40% 曱酰胺、1 M NaCl、 1 % SDS的緩沖液中雜交，和在45X:在1 X SSC 中洗滌。陽性雜交至少是背景的2倍。普通技術(shù)人員會(huì)容易地認(rèn)識(shí)到， 可以使用替代雜交和洗滌條件來提供類似嚴(yán)格性的條件。確定雜交參 數(shù)的其它指導(dǎo)提供在許多參考文獻(xiàn)中，例如，Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel， 等人編。對(duì)于PCR,約36。C的溫度對(duì)于低嚴(yán)格性擴(kuò)增是典型的， 盡管退火溫度可以隨引物長度在約32t)至48。C之間變化。對(duì)于高嚴(yán)格 性PCR擴(kuò)增，約62匸的溫度是典型的，盡管高嚴(yán)格性退火溫度可以隨 引物長度和特異性在約50'C至約651c之間變化。高和低嚴(yán)格性擴(kuò)增的 典型循環(huán)條件包括，在90C-95'C的變性階段30秒至2分鐘，退火階 段持續(xù)30秒至2分鐘，在約72C的延伸階段1-2分鐘。低和高嚴(yán)格 性擴(kuò)增反應(yīng)的方法和指南提供在例如，Innis等人 (1990 ) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y.)。"抗體"是指包含來自免疫球蛋白基因的框架區(qū)或其片 段的多肽，它特異性地結(jié)合和鑒定抗原。被鑒定的免疫球蛋白基因包 括k，入，oc， y， 5， s，和p恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋
白可變區(qū)基因。輕鏈被分類成K或入。重鏈被分類成y， p， a, 5， 或s,它們又分別定義了免疫球蛋白類別IgG， IgM， IgA， IgD和IgE。
通常，抗體的抗原結(jié)合區(qū)對(duì)于結(jié)合的特異性和親和力是最關(guān)鍵的。本文使用的術(shù)語抗體也包括，通過修飾完整抗體生成的 抗體片段，或使用重組DNA方法從新合成(例如，單鏈Fv)，嵌合的、 人化的、或使用噬菌體展示文庫鑒定出的那些(參見，例如， McCafferty等人，Nature 348552-554 ( 1990 ))。對(duì)于抗體的制 備，例如，重組的、單克隆的、或多克隆抗體，可以使用本領(lǐng)域已知 的i午多4支術(shù)(參見，例如，Kohler & Milstein， Nature 256: 495-97
58(1975 ) ; Kozbor等人，Immunology Today 4 72 ( 1983 ) ; Cole等 人，pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss， Inc. ( 1985 ); Coligan， Current Protocols in Immunology
(1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual ( 1988 ) 和Harlow & Lane， Using Antibodies， A Laboratory Manual ( 1999 ); 和Goding， Monoclonal Antibodies Principles and Practice (2d ed. 1986 ))。當(dāng)提及蛋白或肽時(shí)，短語"特異性地(或選擇性地)結(jié) 合"抗體或"與......特異性地(或選擇性地)免疫反應(yīng)性的"是指，
指示蛋白的存在的結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)常在蛋白的異質(zhì)群體和其它生物學(xué)中。 因而，在指定的免疫測定條件下，特定的抗體與特定蛋白的結(jié)合是背 景的至少2倍，更通常超過背景的10至100倍。在這樣的條件下與抗 體的特異性結(jié)合需要針對(duì)特定蛋白選擇它的特異性的抗體。例如，可 以選擇針對(duì)蛋白、多形變體、等位基因、定向進(jìn)化同源、和保守^f務(wù)飾 的變體或拼接變體或其一部分產(chǎn)生的多克隆抗體，以便僅得到與編碼 在本申請(qǐng)中鑒定出的蛋白的基因產(chǎn)物特異性地免疫反應(yīng)的、而不與其
它蛋白反應(yīng)的那些多克隆抗體。該選擇可以通過減去與其它分子交叉 反應(yīng)的抗體來實(shí)現(xiàn)。多種免疫測定形式可以用于選擇與特定蛋白特異 性地免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測定常規(guī)地用于選擇與 蛋白特異性地免疫反應(yīng)的抗體(關(guān)于可以用于測定特異性免疫反應(yīng)的 免疫測定形式和條件的描述，參見，例如，Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988))。本文的"治療有效劑量"是指產(chǎn)生施用的預(yù)期效應(yīng)的劑 量。精確劑量依賴于治療目的，由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的技術(shù)來 確定(參見，例如，Lieberman, Pharmaceut ical Dosage Forms (vols. 1-3， 1992 ) ; Lloyd， The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding ( 1999 );和 Pickar， Dosage Calculations ( 1999 ))。本文鑒定出的味覺(咸的)基因的重組表達(dá)
為了得到克隆的基因的高水平表達(dá)，例如編碼主題基因 的那些cDNA，通常將該基因亞克隆進(jìn)含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄 /翻譯終止子的表達(dá)載體中，對(duì)于編碼蛋白的核酸，該表達(dá)載體還含有 翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。合適的真核和原核啟動(dòng)子是本領(lǐng)域眾所 周知的，且描述在例如，Sambrook等人，和Ausubel等人，同上。例
如，用于表達(dá)味覺特異性的蛋白的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可以在例如大腸桿菌、 芽孢桿菌屬和沙門氏菌中得到(Palva等人，Gene 22229-235 ( 1983 ); Mosbach等人，Nature 302543-545 ( 1983 )。這樣的表達(dá)系統(tǒng)的試 劑盒可商業(yè)獲得。哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)是 本領(lǐng)域眾所周知的，且也可商業(yè)獲得。例如，在本發(fā)明中可以使用反 轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)。如下文所述，主題推定的咸味影響基因優(yōu)選在人細(xì)胞 例如在高通量篩選中廣泛使用的HEK-293細(xì)胞中表達(dá)。用于指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的啟動(dòng)子的選擇依賴于特定用 途。啟動(dòng)子的位置離異源轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離優(yōu)選地與在它的天然環(huán)
境中離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離大致相同。但是，如本領(lǐng)域已知的，可以 調(diào)節(jié)該距離的一些變化，而不喪失啟動(dòng)子功能。除了啟動(dòng)子以外，表達(dá)載體通常含有轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒， 它含有核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的所有額外元件。典型的表達(dá)盒因 而含有可操作地連接至編碼鑒定出的基因的核酸序列的啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn) 錄的有效多腺苷酸化所需的信號(hào)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，和翻譯終止。所 述盒的額外元件可以包括增強(qiáng)子，和，如果使用基因組DNA作為結(jié)構(gòu) 基因，具有功能性拼接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子。除了啟動(dòng)子序列外，表達(dá)框也應(yīng)該含有機(jī)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄 終止區(qū)下游區(qū)以提供有效終止。所述終止區(qū)可以從作為啟動(dòng)子的相同
的基因獲得或從不同的基因獲得。用來將遺傳信息轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的特殊的表達(dá)載體不是特別 重要。可以使用任何用于真核或原核細(xì)胞的表達(dá)的調(diào)控載體。標(biāo)準(zhǔn)細(xì) 菌表達(dá)載體包括質(zhì)粒，例如基于質(zhì)粒的pRB322、 pSKF、 pET23D和融合 表達(dá)系統(tǒng)例如MBP、 GST和LacZ。能夠?qū)⒏郊颖砦患尤胫亟M蛋白質(zhì)以提供分離的便捷的方法，例如c-myc。為核酸交叉再活化(rescue) 序列標(biāo)記可以包括在表達(dá)框中。標(biāo)記物例如熒光蛋白、綠或紅熒光蛋 白、p-gal、 CAT等等能夠包括在載體中作為載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的標(biāo)記物。包含來自真核病毒的調(diào)控元件典型地用于真核表達(dá)載體 中，例如SV40載體、乳頭瘤病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和源自EB病 毒(Epstein-Barr virus)的載體。其它示例真核載體包括pMSG、 pAV009/A+、 pMT010/A+、 pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE和其它允許在 CMV啟動(dòng)子的指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)的表達(dá)的載體、SV40早期啟動(dòng)子、SV40 后期啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子、勞斯肉瘤 病毒啟動(dòng)子、多角體蛋白啟動(dòng)子或其它對(duì)核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有效的其它啟 動(dòng)子。本發(fā)明中使用的載體可以包括調(diào)控載體，例如tet-調(diào)控 系統(tǒng)和RU-486系統(tǒng)(見，例如，Gossen & Bujard， Pro" Nat'1 Acad. Sci USA 89:5547 (1992); Oligino et al.， Gene Ther. 5:491-496 (1998); Wang et al. ， Gene Ther. 4: 432-441 (1997); Neering et al.， Blood 88:1147-1155 (1996); and Rendahl et al.， Nat, Biotechnol. 16: 757-761 (1998))。這些將小分子控制傳遞至候選 靶向核酸的表達(dá)。該有益的特征能夠用于確定所需的表型通過轉(zhuǎn)染的 cDNA而非體細(xì)胞突變引起。在表達(dá)載體被引入該細(xì)胞中后，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在有利的基 因表達(dá)條件下培養(yǎng)。在一些情況下，這種多肽可以使用下文所確定的 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)恢復(fù)。針對(duì)本文所鑒定假定的味覺細(xì)胞特異性基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié) 劑的檢測使用多種檢測能夠特別地檢測離子通道蛋白的通道活性 來測量離子流的變化，包括膜片鉗技術(shù)、整個(gè)細(xì)胞電流的測定、放射 標(biāo)記的離子流檢測或與原子吸收光傳聯(lián)用的流檢測和熒光檢測(使用 電壓敏感染料或鋰或鈉敏感的染料)(見，例如Vestergarrd-Bogind et al.， J. Membrane Biol. 88: 67-75 (1988); Daniel et al.， J. Pharmacol. Meth. 25:185- 193 (1991); Hoevinsky et al. ， J. Membrane Biol. 137:59-70 (1994))。例如能夠?qū)⒕幋a離子通道蛋
白或其同系物的氨基酸注射入爪蟾卵或轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選地 人類細(xì)胞例如HEK-293細(xì)胞。隨后通過測定膜極化(即膜電位的變化) 的變化來評(píng)估通道活性。獲得電生理測量的優(yōu)選的方法是通過使用膜片鉗技術(shù)測 定電流，例如，"細(xì)胞粘附"模式、"翻轉(zhuǎn)"模式、和"全細(xì)胞"模 式(見，例如Ackermanet al. ， New Engl. J. Med. 336:1575-1595， 1997 )。能夠使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如在Hamil et al. ， Pflugers. Archiv. 391:185 (1981)中所述的)全細(xì)胞電流確定全細(xì)胞電流。通道活性也通過測定細(xì)胞內(nèi)離子水平(即鈉或鋰離子)來 評(píng)估。本文實(shí)施這類方法。例如，通過使用適合的熒光染料評(píng)估放標(biāo) 記的吸收來測量鈉流。在典型的顯微熒光測定檢測中，經(jīng)歷結(jié)合單鈉 離子熒光變化的染料被載入味覺細(xì)胞特異性離子通道表達(dá)細(xì)胞的胞質(zhì) 溶膠。對(duì)于激動(dòng)劑的暴露，通過當(dāng)鈉被結(jié)合時(shí)發(fā)生的熒光的變化來反 映細(xì)胞溶質(zhì)的鈉的增加。在另一個(gè)實(shí)施方式中，能夠通過蛋白質(zhì)或oiRNA的水平測 量來確定特異性靶向味覺多肽的細(xì)胞多肽水平。使用免疫測定法(諸 如西式印跡法、ELISA等等)、使用選擇性與多肽或其片段結(jié)合的抗 體來測量蛋白質(zhì)或與離子通道活性相關(guān)的蛋白質(zhì)的水平。優(yōu)選mRNA、 擴(kuò)增(例如使用PCR、 LCR)或雜交檢測(例如RNA印跡雜交、RNA酶 保護(hù)術(shù)、點(diǎn)漬法)的測量。使用直接或間接標(biāo)記檢測劑來檢測蛋白或 mRNA的水平，例如本文所述的熒光性或放射性標(biāo)記核酸、放射性或酶 標(biāo)記抗體等等。另外，能夠使用報(bào)道基因系統(tǒng)測量蛋白質(zhì)表達(dá)。能夠使用 與可操作性地結(jié)合的報(bào)道基因(例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、熒火蟲熒光 素酶、細(xì)菌熒光素酶、p-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶)的啟動(dòng)子來設(shè)計(jì) 這種系統(tǒng)。另外，通過與第二指示器諸如紅或綠熒光蛋白(見，例如 Mistili & Spector， Nature Biotechnology 15:961-964 (1997)) 相關(guān)蛋白質(zhì)能夠用作間接指示器。將所述指示器構(gòu)造典型地轉(zhuǎn)染至細(xì) 胞。在用潛在的調(diào)節(jié)劑處理后，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 測量指示器基因轉(zhuǎn)錄、翻譯或活性的量。動(dòng)物模型也用于針對(duì)基因活性的調(diào)節(jié)劑篩選。相似地，包 括siRNA和基因剔除技術(shù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)(例如因?yàn)榕c適當(dāng)?shù)幕?靶向載體、或基因過表達(dá)同源重組)，將導(dǎo)致所述靶向基因的缺失或 增強(qiáng)的表達(dá)。也能夠應(yīng)用相同的技術(shù)來制備基因的細(xì)胞。當(dāng)需要時(shí)， 組織特異性的表達(dá)或靶向基因剔除可以是必須的。通過這種方法產(chǎn)生 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為與基因靶向相關(guān)應(yīng)答的動(dòng)物模型。例如這種表達(dá)基 因或本發(fā)明的基因的動(dòng)物可以用于獲得品味超人(supertaster )表型 例如在化學(xué)和生物毒素、腐敗的/損壞的/污染的食物、和飲料的篩選 中使用，或者針對(duì)調(diào)節(jié)味覺干細(xì)胞分化的治療化合物的篩選。能夠通過在小鼠基因組中使用基因重組將標(biāo)記基因或其 它異源基因插入內(nèi)原基因位點(diǎn)來制備基因剔除細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠。也 能夠制備這種小鼠，其是通過用靶向基因的突變型置換內(nèi)原基因，或 通過使內(nèi)原基因突變(例如暴露于已知誘變劑)。將DNA構(gòu)造引入胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核。包含新設(shè)計(jì)的基因 損傷的細(xì)胞被注入宿主小鼠胚胎中，其被再植入雌性接受體。這些胚 胎中的一些發(fā)育成嵌合子小鼠，其具有從突變細(xì)胞林部分衍生的生殖 細(xì)胞。因此，通過培育嵌合子小鼠，可能獲得包含引種的基因損傷的 小鼠的新型祙(見，例如Capecchi et al.， Science 244: 1288 (1989)). Chimeric targeted mice can be derived according to Hogan et al.， Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (1988) andTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (Robertson, ed. ， 1987 )。
進(jìn)一步地，對(duì)于文中指明的味覺細(xì)胞具有特異性的基因和 基因制品能夠用于鑒定在以下方面有作用的化合物調(diào)節(jié)味覺細(xì)胞的 調(diào)亡、調(diào)節(jié)對(duì)味覺受體表達(dá)進(jìn)行控制的轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)苦味受體表達(dá) (例如為了減輕某些蔬菜、藥物、咖啡等中的不良味道)、調(diào)節(jié)味覺 細(xì)胞發(fā)展的自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)、延長味蕾壽命、產(chǎn)生超級(jí)味覺動(dòng)物顯 型用于篩選諸如生物恐怖物品(bioterrorism)或產(chǎn)生動(dòng)物用于篩選 將干細(xì)胞的活化和差異化引導(dǎo)至活體中的味覺細(xì)胞的化合物。進(jìn)一步地，本發(fā)明的基因和基因制品以及表達(dá)的細(xì)胞能夠 用于鑒定下述化合物其再生味覺細(xì)胞-例如在老年人或患有癌癥、 化療輻射、影響味覺的傷害或外科手術(shù)、藥物導(dǎo)致的味覺障礙、味覺 缺失的患者中，從而用于減輕味蕾損失。再進(jìn)一步地，本發(fā)明的基因和基因制品以及表達(dá)的細(xì)胞能 夠用于篩選下述化合物其影響口腔衛(wèi)生、口臭、口腔中有害物質(zhì)的 消毒，以及細(xì)菌、病毒和唾液/嘴或消化道中的其它免疫原的中和/消 除。實(shí)施例8: SCN3A在對(duì)甜味、苦味和鮮味感覺起作用的TRPM5細(xì)胞中 被表達(dá)。因此，調(diào)節(jié)SCN3A功能的化合物可用來增強(qiáng)或阻斷甜味、苦 味和/或鮮味。實(shí)施例9:實(shí)施例10:本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果包含在圖10中，該實(shí)驗(yàn)是說明不同味覺細(xì) 胞中PKD2L1和TRPM5表達(dá)的雙標(biāo)記免疫組織化學(xué)的實(shí)施例。左側(cè)圖像 出示以對(duì)抗PKD2L1 (綠色)的商業(yè)抗體標(biāo)記的小鼠CV ^^木蕾；中間圖 像出示使用Senomyx (紅色)開發(fā)的抗體以TRPM5標(biāo)記；右側(cè)圖像出 示PKD2L1和TRPM5標(biāo)記物的融合。底部4個(gè)圖像出示高放大倍率下單 個(gè)味蕾-注意PKD2L1與TRPM5 (標(biāo)記物在分別的細(xì)胞種類中表達(dá))不 共位，其表明PKD2L1在甜味、苦味和/或鮮味味覺細(xì)胞(以TRPM5標(biāo) 記)中不表達(dá)。。相同的數(shù)字也出示PKD2L1延伸到味覺受體細(xì)胞(圖像的 上部)的尖端，而HCN4不在所述味孔區(qū)域。PKD2L1和HCN4在細(xì)胞體 中共位，但是只有PKD2L1在所述頂端膜中表達(dá)。底部圖像出示所述融 合的圖像中虛線框畫出的區(qū)域的放大圖。
雙-四{(乙酰氧基)甲基}酯(分子探針公司)。
29. 權(quán)利要求22的方法，其中所述鈉離子敏感染料是四乙酸綠鈉(分子探針公司)或鈉-敏感染料試劑盒(分子裝置公司)。
30. 權(quán)利要求15的方法，其中該測定通過離子流測定來測量活性。
31. 權(quán)利要求30的方法，其使用原子吸收光語測定離子流。
32. 權(quán)利要求15的方法，其中推定的咸味影響基因在可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
33. 權(quán)利要求15的方法，其使用熒光板閱讀器(FLIPR)。
34. 權(quán)利要求15的方法，其使用電位成像板(VIPR)閱讀器用來增加鈉離子或液體吸收。
35. 權(quán)利要求15的方法，其中選擇的化合物促進(jìn)鈉離子運(yùn)輸?shù)轿?br> 36. 權(quán)利要求15的方法，其使用膜電位染料，所述膜電位染料選自分子裝置膜電位試劑盒(Cat#R8034 ) 、 二-4-ANEPPS (吡啶鹽，4-(2- ( 6- ( 二丁基氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1「 ( 3-磺丙基))氫氧化物、內(nèi)鹽、DiSBACC4 (2)(雙-(1， 2-二巴比妥酸)-三乙炔氧洛希爾)、DiSBACC4 (3)(雙-(1， 3-二巴比妥酸)-三乙炔氧洛希爾)、Cc-2-DMPE(太平洋藍(lán)1， 2-雙十四酰-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺，三乙基銨鹽)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4-[1，4， lO-三氧雜-7， 13- 二氮雜環(huán)十五烷-7， 13-二基雙(5-甲氧基-6，1，2-苯并呋喃二基)]雙-四[(乙酰氧基)甲基]酉旨(分子探針公司)。
37. 權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)所述推定咸味影響基因。
38. 權(quán)利要求15的方法，其中所述細(xì)胞短暫表達(dá)所述推定咸味影響基因。
39. 權(quán)利要求15的方法，其中使用鈉離子敏感性染料監(jiān)控活性。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述染料是四乙酸綠鈉(分子探針公司)或鈉-敏感染料試劑盒(分子裝置公司)。
41. 權(quán)利要求15的方法，其中通過膜片鉗或雙電極電壓鉗在蛙卵母細(xì)胞中在電生理學(xué)上測定活性。
42. 權(quán)利要求41的方法，其使用自動(dòng)成像儀。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述儀器是熒光板閱讀器(FLIPR)。
44. 權(quán)利要求42的方法，其中所述儀器是電壓成像板閱讀器(VIPR)。
45. 權(quán)利要求15的方法，其中表達(dá)所述基因序列的細(xì)胞，選自HEK-293、 BHK、 CH0、 C0S、猴L(fēng)細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、Ltk-細(xì)胞和卵母細(xì)胞。
46. 權(quán)利要求l-45中任一項(xiàng)的方法，其中篩選的基因包括包含于表l-3中任何一個(gè)的基因。
47. 權(quán)利要求45的方法，其中所述細(xì)胞是HEK-293細(xì)胞。
48. —種用于鑒定具有潛在的調(diào)節(jié)人甜味、苦味或鮮味味覺的體內(nèi)應(yīng)用的化合物的測定，包括以下U)用至少一個(gè)推定的增強(qiáng)劑化合物接觸細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)表1-3中列出的存在于TRPM5 p未覺細(xì)胞中的基因；(U)在存在和不存在所述推定的增強(qiáng)劑的情況下，測定鈉電導(dǎo)、受體活性或鈉轉(zhuǎn)運(yùn)；和(iii)基于其是否提高鈉電導(dǎo)、所述受體的活性或鈉轉(zhuǎn)運(yùn)來鑒定作為甜味、苦味或鮮味味覺的潛在增強(qiáng)劑的化合物。
49. 權(quán)利要求48的測定，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或蛙卵母細(xì)胞。
50. 權(quán)利要求48的測定，其中所迷哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CH0、 Cos、BHK或HEK-293細(xì)胞。
51. 權(quán)利要求50的測定，其中所述細(xì)胞是HEK-293細(xì)胞。
52. 權(quán)利要求48的測定，其中在味覺試驗(yàn)中證實(shí)所述化合物對(duì)甜味味覺的影響。
53. 權(quán)利要求48的測定，其中在味覺試驗(yàn)中證實(shí)所述化合物在鮮味味覺的影響。
54. 權(quán)利要求48的測定，其中在味覺試驗(yàn)中證實(shí)所述化合物在苦味味覺的影響。
55. 權(quán)利要求52-54中任一項(xiàng)的測定，其中用人志愿者實(shí)現(xiàn)味覺試驗(yàn)。
56. —種用于鑒定推定的酸味味覺調(diào)節(jié)劑的測定，包括(i)用化合物接觸細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)表1-3中列出的存在于PKD2L1/PKD1L3味覺細(xì)胞的基因和任選地涉及酸味感覺的另一基因；(U)測定所述化合物對(duì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、離子電導(dǎo)或由所述通道引起的活性的影響；和(iii)如果它對(duì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、離子電導(dǎo)或由所述通道引起的活性是具有影響，則鑒定所述化合物為酸味味覺調(diào)節(jié)劑。
57. 權(quán)利要求56的測定，其中所述離子是鈉離子。
58. 權(quán)利要求56的測定，其中在味覺測試中證實(shí)所述化合物對(duì)酸味味覺的影響。
59. 權(quán)利要求58的測定，其中用人志愿者實(shí)現(xiàn)所述味覺試驗(yàn)。
60. 權(quán)利要求56的測定，其包括加入已知引起酸味的化合物且所述篩選所述化合物對(duì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、離子電導(dǎo)或通過所述通道引起的活性的影響。
61. 權(quán)利要求56的測定，其中所述細(xì)胞也表達(dá)PKD2L1/PKD1L3。
62. —種方法，其在篩選特異性結(jié)合和/或調(diào)節(jié)所述味覺特異性多肽的活性的化合物的結(jié)合或功能性測定方法中，使用由選自表l或表2或表3中敘迷的基因或其直向同源物或與其相比具有至少90%的序列一致的其變異體編碼的味覺特異性多肽，并基于所述篩選測定來鑒定推定地調(diào)節(jié)至少一種味覺細(xì)胞生長、衰老、凋亡或味蕾再生的化合物。
63. 權(quán)利要求62的方法，其中所述篩選測定在表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或在遺傳修飾動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)，所迷遺傳修飾動(dòng)物利用siRNA或基因敲除法展示降低的或消除的所述基因的表達(dá)。
64. —種方法，其在篩選特異性結(jié)合和/或調(diào)節(jié)所述味覺特異性多肽的活性的化合物的結(jié)合或功能性測定方法中，使用由選自表l或表2或表3中敘述的基因或直向同源物或與其相比具有至少90%的序列一致的其變異體編碼的味覺特異性多肽，并基于所述篩選測定來鑒定推定地調(diào)節(jié)胃腸功能的化合物。
65. 權(quán)利要求64的方法，其中所述細(xì)胞是味覺或胃腸細(xì)胞，且所述測定篩選影響胃動(dòng)力、食物辯別力、食物吸收或肽分泌之一的化合物。
66. 權(quán)利要求65的方法，其中篩選的化合物影響淀粉酶、GLP-1(胰高血糖素類肽l)、促胰液素、胃蛋白酶和GIP (葡萄糖依賴性促胰島素多肽)的至少一種的分泌。
67. 權(quán)利要求64的方法，其中體內(nèi)評(píng)估鑒定的化合物對(duì)味覺或胃腸功能的影響。
68. 權(quán)利要求64的方法，其中胃腸功能包括營養(yǎng)吸收、營養(yǎng)辯別、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、肽或激素或酶分泌和/或食欲。
69. —種方法，其在篩選特異性結(jié)合和/或調(diào)節(jié)所述味覺特異性多肽的活性的化合物的結(jié)合或功能性測定方法中，使用由選自表1或表2或表3中敘述的基因或直向同源物或與其相比具有至少90%的序列一致的變異體編碼的味覺特異性多肽，并基于所述篩選測定來鑒定在治 療或預(yù)防涉及消化系統(tǒng)或消化器官的病理學(xué)病況中具有潛在治療效能 的化合物。
70. 權(quán)利要求69的方法，其中所述病況是功能性消化不良或其它 潰瘍或非潰瘍相關(guān)的消化不良。
71. 權(quán)利要求69的方法，其中所述治療性化合物影響與饑餓或消 化力相關(guān)的激素。
72. 權(quán)利要求71的方法，其中所述蛋白選自促胃液素、促胰液素、 淀粉酶、縮膽囊肽、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、胰高血糖素類肽1生 長素或瘦素。
73. 權(quán)利要求69的方法，其中所述治療性化合物用于治療炎性或 自身免疫性胃腸疾病。
74. 權(quán)利要求73的方法，其中所述疾病選自脂瀉病、炎性腸綜合 癥、克羅恩氏病、Sjogren氏綜合癥、胃炎、憩室炎或潰瘍性結(jié)腸炎。
75. 權(quán)利要求69的方法，其中所述治療性化合物用于治療或預(yù)防 消化系統(tǒng)或消化器官相關(guān)的癌癥。
76. 權(quán)利要求75的方法，其中所述癌癥侵襲選自結(jié)腸、小或大腸、 肛門、肝臟、胰腺、膽囊、食道、舌、唾液腺、味蕾或胃癌或癌相伴 惡病質(zhì)的器官.
77. 權(quán)利要求69的方法，其中所述治療性化合物用于治療或預(yù)防 食欲相關(guān)的疾病或功能失調(diào)。
78. 權(quán)利要求77的方法，其中所述食欲相關(guān)的疾病或病況是貪食 癥或厭食或與之相關(guān)的惡病質(zhì)。
79. 權(quán)利要求69的方法，其中所述治療性化合物用于治療或預(yù)防 胃返流相關(guān)的病癥或疾病。
80. 權(quán)利要求79的方法，其中所述病癥或疾病選自胃食道返流 病、食管炎、Barrett氏食管或胃灼熱。
81. —種方法，其在篩選特異性結(jié)合和/或調(diào)節(jié)所述味覺特異性多 肽的活性的化合物的結(jié)合或功能性測定方法中，使用由選自表1或表 2或表3中敘述的基因或直向同源物或與其相比具有至少90%的序列一 致的變異體編碼的味覺特異性多肽，并基于所述篩選測定來鑒定對(duì)調(diào) 節(jié)口腔或胃腸道中的免疫系統(tǒng)有用的化合物。
82. 權(quán)利要求81的方法，其用來篩選用于治療牙齦炎、口臭或中 和或抑制其中有害物質(zhì)或微生物的化合物。
83. —種方法，其在篩選特異性結(jié)合和/或調(diào)節(jié)所述味覺特異性多 肽的活性的化合物的結(jié)合或功能性測定方法中，使用由選自表1或表 2或表3敘述的基因或直向同源物或與其相比具有至少90。/。的序列一致的變異體編碼的味覺特異性多肽，并基于所述篩選測定來鑒定對(duì)治療 口干癥(例如，在干燥綜合癥中)、味覺障礙或味覺缺乏癥之一有用 的化合物。
84. —種方法，其在篩選特異性結(jié)合和/或調(diào)節(jié)所述味覺特異性多肽的活性的化合物的結(jié)合或功能性測定方法中，使用通過選自表1或表2或表3中敘述的基因或直向同源物或與其相比具有至少90%的序 列一致的變異體編碼的味覺特異性多肽，并基于所述篩選測定來鑒定 對(duì)治療涉及味覺或消化細(xì)胞功能的代謝紊亂有用的化合物。
85. 權(quán)利要求84的方法，其中所述代謝紊亂是糖尿病或肥胖。
86. —種方法，其在篩選特異性結(jié)合和/或調(diào)節(jié)所述味覺特異性多 肽的活性的化合物的結(jié)合或功能性測定方法中，使用由選自表l或表 2或表3中敘述的基因或直向同源物或與其相比具有至少90%的序列一 致的其變異體編碼的味覺特異性多肽，并基于所述篩選測定來鑒定化合物所述化合物影響味覺細(xì)胞受體的運(yùn)輸、味覺細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)釋放、 味覺受體功能的自分泌/旁泌性調(diào)節(jié)機(jī)制和味覺細(xì)胞動(dòng)作電位放電頻 率/膜電位中的至少一種。
87. —種方法，其在篩選特異性結(jié)合和/或調(diào)節(jié)所述味覺特異性多 肽的活性的化合物的結(jié)合或功能性測定方法中，使用由選自表1或表 2或表3中敘述的基因或直向同源物或與其相比具有至少90%的序列一致的變異體編碼的味覺特異性多肽，并基于所述篩選測定來鑒定對(duì)治 療創(chuàng)傷、癌癥、化療、輻射、損傷或手術(shù)后的味覺細(xì)胞損失或者老年 相關(guān)味蕾損失的后果潛在有用的化合物。
88. —種分離或純化的味覺或胃腸細(xì)胞，其表達(dá)至少一種表l、 2 或3中敘述的基因。
89. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其進(jìn)一步表達(dá)ot ENaC、細(xì) 胞角蛋白19和/或C6orfl5。
90. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其不表達(dá)T1R。
91. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其不表達(dá)T2R。
92. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其不表達(dá)PKD2L1/PKD1L3 和/或TRPM5。
93. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其是人細(xì)胞。
94. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其不表達(dá)T1R、 T2R或 PKD2L1/PKD1L3。
95. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)的基因。
96. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其表達(dá)選自TNF、 MIF、千 擾素和白細(xì)胞間介素的細(xì)胞因子基因。
97. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其表達(dá)生長因子.
98. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其表達(dá)味導(dǎo)素或轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
99. 權(quán)利要求88的分離的味覺細(xì)胞，其不表達(dá)味導(dǎo)素或轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。
100. —種方法，其在細(xì)胞分離、純化、富集或標(biāo)記技術(shù)中使用 至少一種包含于表1、2或3中的基因或其直向同源物或編碼與其相比 具有至少90%的同一性的蛋白的變異體，所述細(xì)胞分離、純化、富集 或標(biāo)記技術(shù)基于至少一種包含于表1、 2或3的基因或其直向同源物、 或編碼與所迷基因或其直向同源物至少90%同 一性的蛋白的基因的表 達(dá)或不表達(dá)，分離、純化、富集和/或標(biāo)記包含于混合細(xì)胞群體或細(xì)胞懸浮液的至少一種想要的味覺細(xì)胞類型或鐠系，所述混合細(xì)胞群體或 細(xì)胞懸浮液包含想要的味覺細(xì)胞類型或鐠系。
101. 權(quán)利要求100的方法，其中通過包括使用激發(fā)熒光細(xì)胞分離 器(FACS)的方法分離、純化、富集或標(biāo)記想要的味覺細(xì)胞類型或鐠 系。
102. 權(quán)利要求100的方法，其中通過包括使帶用標(biāo)記磁珠的方法 分離、純化、富集或標(biāo)記想要的味覺細(xì)胞類型或譜系。
103. 權(quán)利要求100的方法，其中通過含有p未覺細(xì)胞的組織的酶消 化和/或組織解聚制備混合細(xì)胞群體或細(xì)胞懸浮液。
104. 權(quán)利要求103的方法，其中細(xì)胞源自于至少舌、口腔、胃腸 道或相關(guān)的器官或者泌尿道中的至少一種。
105. 權(quán)利要求100的方法，其中通過包括基于至少一種包含于表 1、 2或3的基因的表達(dá)或不表達(dá)至少一種除去的非靶標(biāo)細(xì)胞亞類或譜 系的陰性細(xì)胞選擇技術(shù)的方法來分離、純化、富集或標(biāo)記想要的味覺 細(xì)胞亞類或i普系。
106. 權(quán)利要求100的方法，其中該方法使用細(xì)胞毒素抗體特異性 殺死至少一種非靶標(biāo)細(xì)胞亞類或譜系。
107. 權(quán)利要求100的方法，其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺 細(xì)胞亞類包括甜味味覺細(xì)胞。
108. 權(quán)利要求100的方法，其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺 細(xì)胞亞類包括鮮味味覺細(xì)胞。
109. 權(quán)利要求100的方法， 細(xì)胞亞類包括苦味味覺細(xì)胞。
110. 權(quán)利要求100的方法， 細(xì)胞亞類包括酸p未p木覺細(xì)胞。
111. 權(quán)利要求100的方法，細(xì)胞亞類包括咸味味覺細(xì)胞。
112. 權(quán)利要求100的方法， 細(xì)胞亞類包括油脂味味覺細(xì)胞。
113. 權(quán)利要求100的方法， 細(xì)胞亞類包括味覺干細(xì)胞。
114. 權(quán)利要求100的方法， 細(xì)胞亞類包括味覺細(xì)胞神經(jīng)原。
115. 權(quán)利要求100的方法, 細(xì)胞亞類包括味覺免疫細(xì)胞。權(quán)利要求書第15/16頁 其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺其中富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺
116. —種在篩選味覺調(diào)節(jié)化合物的方法中使用根據(jù)權(quán)利要求 100-112中任一項(xiàng)的分離、純化、富集或標(biāo)記的細(xì)胞的方法。
117. —種在篩選誘導(dǎo)所述富集、分離、純化或標(biāo)記的味覺干細(xì)胞 分化為一種或多種味覺細(xì)胞譜系或亞型或味蕾的化合物的方法中，使 用根據(jù)權(quán)利要求113制備的分離、富集、純化或標(biāo)記的味覺干細(xì)胞的 方法。
118. 權(quán)利要求117的方法，其中基于至少一種包含于表l、 2或 3的味覺特異性基因的表達(dá)或不表達(dá)來鑒定所述味覺細(xì)胞譜系或亞
119. 根據(jù)權(quán)利要求100-118中任一項(xiàng)制備的分離、純化、富集或 標(biāo)記的味覺細(xì)胞鐠系或亞型。
120. 權(quán)利要求119的分離、純化、富集或標(biāo)記的細(xì)胞譜系或亞型， 其包括甜味、鮮味、苦味、酸味、咸味、油脂味或金屬味覺細(xì)胞或味 覺細(xì)胞神經(jīng)元、免疫或千細(xì)胞。
121. 權(quán)利要求119的分離、純化、富集或標(biāo)記的細(xì)胞譜系或亞型， 其是人的細(xì)胞鐠系或亞型。
122. 權(quán)利要求119的分離、純化、富集或標(biāo)記細(xì)胞譜系或亞型源 自于人的舌、口腔、胃腸道或相關(guān)的器官或者泌尿道或泌尿器官。
123. 根據(jù)權(quán)利要求119的味覺特異性細(xì)胞在篩選調(diào)節(jié)至少一種 甜味、鮮味、苦味、酸味、咸味、油脂味或金屬味覺中至少一種的化 合物的測定中的用途。
124. 根據(jù)權(quán)利要求119的細(xì)胞在篩選調(diào)節(jié)味覺細(xì)胞分化或更新 的化合物的方法中的用途。
125. 根據(jù)權(quán)利要求119的味覺細(xì)胞在篩選調(diào)節(jié)或治療消化功能、 味覺細(xì)胞更新、食物辯別、口腔免疫、食欲、胃腸代謝紊亂、營養(yǎng)吸 收、營養(yǎng)排泄、消化液、肽、酶或激素分泌、味覺受體運(yùn)輸或自身免 疫、腫瘤或炎性胃腸疾病或病癥中至少一種的化合物的測定中的用途。
全文摘要
更具體地說，本發(fā)明涉及鑒定味覺特異基因的新基本原理和方法，所述新的味覺特異基因包括涉及咸味味覺感知的基因、以及涉及其它味覺細(xì)胞或味覺受體相關(guān)活動(dòng)(諸如消化功能和與消化相關(guān)的疾病、味覺細(xì)胞紊亂、口或消化道的免疫調(diào)節(jié)，以及諸如的糖尿病和肥胖的代謝調(diào)節(jié))的基因，使用這些方法所鑒定的基因用于使用這些基因鑒定味覺調(diào)節(jié)子(增強(qiáng)子或阻斷子)以及潛在療法的測定。這些化合物在調(diào)節(jié)(增強(qiáng)或阻斷)味覺感測(特別是咸味味覺感測)以及作為潛在療法方面具有潛在的應(yīng)用。此外，本發(fā)明涉及鑒定味覺特異基因的新方法，其中所述味覺特異基因能夠用作標(biāo)記用于哺乳動(dòng)物中的不同味覺細(xì)胞類型，包括甜味、苦味、鮮味、酸味、咸味和其它味覺細(xì)胞，以及在存在這些基因時(shí)測量甜味、苦味、鮮味或酸味受體的活性以鑒定甜味、苦味、鮮味和酸味的調(diào)節(jié)子以及以便鑒定特別用于治療消化或代謝紊亂、味覺確實(shí)和口腔感染。進(jìn)一步地，本發(fā)明特異方法用于純化、富集、隔離或標(biāo)記所需的味覺細(xì)胞子類型或族——諸如甜味、鮮味、苦味、咸味、酸味、油脂味或干細(xì)胞等，例如通過使用FACS、磁珠或純化、富集、標(biāo)記或消除的其它方法，諸如通過使用表達(dá)或不表達(dá)一種或多種味覺特異基因的標(biāo)記的細(xì)胞毒素、細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101460635SQ200780021087
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者B·莫耶, D·卡拉巴特, F·埃韋里, P·哈韋齊, 娜 高, 敏 魯 申請(qǐng)人:塞諾米克斯公司