專利名稱：：能夠生產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的乳酸菌，它們即使在培養(yǎng)開始時培養(yǎng)基中存在乳酸的情況下也能夠生產(chǎn)Y-氨基丁酸(在后文稱為"GABA")，并還涉及了使用它們生產(chǎn)含有Y-氨基丁酸的培養(yǎng)混合物的方法。
背景技術(shù)：
：GABA是一種目前受到關(guān)注的氨基酸，因為它具有生理學(xué)效應(yīng)例如降血壓效應(yīng)、利尿效應(yīng)和鎮(zhèn)定效應(yīng)。由于含有GABA的食物僅限于一些蔬菜、茶、稻米等，并且其含量也低，因此提出了一些使用GABA發(fā)酵乳酸菌生產(chǎn)GABA的方法(例如參見專利參考文獻1到3)。作為這樣產(chǎn)生GABA的乳酸菌來說，已知的有希氏乳酸桿菌(Lactobacillushilgardii)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcuslactissubspeciescremoris)、乳酸孚L球菌乳酸亞禾中(Lactococcuslactissubspecieslactis)、鉛黃腸球菌(Enterococcuscasseliflavus)、短孚L酸桿菌(Lactobacillusbrevis)、植物乳酸桿菌(Lactobacillusplantamm)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)等，它們具有從L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽通過脫羧反應(yīng)生產(chǎn)GABA的能力。但是，因為這些乳酸菌在培養(yǎng)基中需要昂貴的成分例如乳清粉、脫脂奶、酪蛋白和蛋白胨，因此從成本的角度來說生產(chǎn)力不好(例如參見專利參考文獻1或4)。此外，當(dāng)用酸降解或用酶或酒曲降解廉價的原料醬油曲或麥麩、并用谷氨酰胺酶將洗脫的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為用作培養(yǎng)基的谷氨酸時，通過中和產(chǎn)生的食鹽或在酶法降解時作為抗污染對策加入的食鹽抑制了乳酸菌生產(chǎn)GABA。盡管已經(jīng)報道了幾種生產(chǎn)GABA的耐鹽乳酸菌，但GABA發(fā)酵的最適食鹽濃度非常高，從12.5%到18%的鹽度(例如參見專利參考文獻5)。當(dāng)考慮到提倡有意低氯飲食的飲食生活以避免與生活方式有關(guān)的疾病時，食鹽含量高的食品和調(diào)味劑是不合乎需要的。此外，由于GABA有預(yù)期降血壓的活性方面，將它與高的食鹽濃度相組合就失去了原本的意義。根據(jù)上面的描述，對于使用乳酸菌生產(chǎn)GABA來說，盡管使用廉價的原料例如酒曲和麥麩、通過在低食鹽濃度下將其降解是理想的，但低食鹽濃度引起了由野生菌株造成污染的問題。污染發(fā)生在培養(yǎng)的早期階段，并且當(dāng)由此引起了乙醇的產(chǎn)生或pH的降低時，生產(chǎn)GABA的乳酸菌的生長受到了抑制。從而不能獲得足夠量的目的GABA。作為在低食鹽濃度下防止被這些野生菌株污染的手段，使用一般經(jīng)常用作食品防腐劑的乙醇、乙酸和乳酸是一種方法。但是，盡管乙醇和乙酸抑制了污染物，但它們也抑制了生產(chǎn)GABA的乳酸菌。另一方面，因為乳酸菌自身產(chǎn)生乳酸，它們比其它細菌對乳酸具有更高的抗性。因此，盡管本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)考慮到了使用乳酸作為防腐劑，但又出現(xiàn)了新的問題，即當(dāng)乳酸在存在食鹽的情況下在培養(yǎng)開始時加入的話，生產(chǎn)GABA的乳酸菌不能夠生長，或是能夠生長但不產(chǎn)生GABA。專利參考文獻1專利參考文獻2專利參考文獻3專利參考文獻4專利參考文獻5JP-A-2000-210075JP-A-2004-215529JP-A-2005-102559曰本專利No.3426157日本專利No.2704493發(fā)明公開內(nèi)容本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的問題是提供能夠在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在乳酸和食鹽的條件下生產(chǎn)GABA的乳酸菌，以及提供生產(chǎn)含有GABA的培養(yǎng)混合物的方法。解決問題的手段為了解決上面提出的問題，本發(fā)明的發(fā)明人進行了廣泛的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以通過從未精制的醬油中分離乳酸菌來解決問題，該乳酸菌即使是在培養(yǎng)開始時共同存在乳酸和食鹽的條件下也能夠產(chǎn)生GABA，并使用它實現(xiàn)了本發(fā)明。就是說，本發(fā)明涉及下列(l)到(4):(1)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的乳酸菌，其能夠在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在乳酸和食鹽的條件下產(chǎn)生，氨基丁酸；(2)屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的乳酸菌，其能夠在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在1%到4%乳酸和8%到12%食鹽的條件下產(chǎn)生Y-氨基丁酸；(3)上面(1)或(2)中的乳酸菌，其中所述乳酸細菌是凝乳酶乳酸桿菌(Lactobacillusrennini);以及(4)含有"氨基丁酸的培養(yǎng)混合物的生產(chǎn)方法，其中在上面的(l)到(3)任何一個中描述的乳酸菌在接種到含有L-谷氨酸和/或其鹽的培養(yǎng)基中之后進行培養(yǎng)。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供使用廉價原料、在發(fā)酵不會被野生菌株引起抑制的情況下穩(wěn)定地生產(chǎn)GABA的方法。附圖簡述圖1顯示了凝乳酶乳酸桿菌菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1的分子系譜樹。本發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明中涉及的乳酸菌是屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的菌株，例如可以使用從未精制的醬油中分離的乳酸菌。本發(fā)明的乳酸菌具有在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在乳酸和食鹽的條件下產(chǎn)生GABA的能力，并可以在共同存在1%到4%乳酸和8%到12%食鹽的條件下生產(chǎn)GABA。優(yōu)選乳酸菌是凝乳酶乳酸桿菌，乳酸菌的例子包括凝乳酶乳酸桿菌菌株KG34、凝乳酶乳酸桿菌菌株KG43等。凝乳酶乳酸桿菌菌株KG34于2006年2月7日保藏于國家技術(shù)與評估石開究所(NITE)(NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)的NITE專利微生物保藏部(NPMD)(NITEPatentMicroorganismsDepositary)(郵政編碼292-0818;2-5-8，KazusaKamatari,Kisarazu，Chiba,Japan))(保藏號NITEP-177)，并且已經(jīng)根據(jù)布達佩斯公約于2006年9月1日轉(zhuǎn)移到國際保藏單位(InternationalDepositaryAuthority)(保藏號NITEBP-177)。同樣，凝乳酶乳酸桿菌菌株KG43也已經(jīng)根據(jù)布達佩斯公約于2007年1月31日國際保藏于國家技術(shù)與評估研究所(NITE)(NationalInstituteofTechnologyandEvaluation)的NITE專利微生物保藏部(NPMD)(NITEPatentMicroorganismsDepositary)(郵政編碼292-0818;2-5-8,KazusaKamatari,Kisarazu,Chiba，Japan))(接受號NITEABP-309)。從未精制的醬油中分離乳酸菌按照下面的方法進行。即對25克未精制的醬油進行消化處理，取適量這樣獲得的液體加入到裝在德漢(Durham)試管中的MRS-SOYTONE培養(yǎng)基中(5.5%MRS肉湯，0,5%細菌大豆蛋白胨，0.5%谷氨酸鈉，8%食鹽，5%食品添加劑乳酸，pH5.1)，在30。C進行靜置培養(yǎng)。將證實了在德漢試管中產(chǎn)生了氣體的培養(yǎng)基用MRS-SOYTONE培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，鋪展在MRS-SOYTONE瓊月旨培養(yǎng)基上，然后在AnaeroPackKenki(MitsubishiGasChemicalCo.，Inc)中于30°C培養(yǎng)7天。將這樣獲得的單個菌落再次接種到裝在德漢試管中的MRS-SOYTONE培養(yǎng)基中，并選擇被證實產(chǎn)生了氣體的菌株。通過上述方法分離到了7株菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1。在這7株菌株中，檢査了KG34和KG43這兩株菌株的細菌學(xué)性質(zhì)，結(jié)果顯示在表1中。作為比較性的對照，作為凝乳酶乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的凝乳酶乳酸桿菌DMSZ20253的數(shù)據(jù)也描述在其中?？梢钥闯觯瑯?biāo)準(zhǔn)菌株凝乳酶乳酸桿菌DMSZ20253不產(chǎn)生GABA，因為它不具有谷氨酸脫羧能力。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*w:弱但是+此外，通過下面的方法測定了本發(fā)明的凝乳酶乳酸桿菌菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1的乳酸菌的16SrDNA(16SrDNA基因)的完整的核苷酸序列。每種乳酸菌凝乳酶乳酸桿菌菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1被接種到MRS-Soytone培養(yǎng)基中(MRS肉湯5.5%,大豆蛋白胨0.5°/。，NaCl8%，谷氨酸鈉0.5%，pH5.1)，在30°C培養(yǎng)4天。使用GenTorukun(用于酵母)(TakaraBio)提取基因組DNA。16SrDNA的完整區(qū)域被分成三個片段，使用所提取的基因組DNA作為模板通過PCR來擴增。通過對相應(yīng)的片段進行測序并將它們連接，獲得了完整區(qū)域的序列。使用Takam熱循環(huán)儀MP作為熱循環(huán)儀，和ABIPrism377DNA測序儀(AppliedBiosystems)被用作DNA測序儀。這樣獲得的相應(yīng)的16SrDNA核苷酸序列被顯示在SEQIDNO:l和2中。從獲得的16SrDNA核苷酸序列對被認為與該細菌近緣的物種進行了同源性檢索。使用16SrDNA核苷酸序列用近緣物種通過鄰近連接方法(neighborhoodconnectingmethod)制備了分子系譜樹。進行了近緣物種和指派分類組的研究。作為通過NCBIBLAST進行檢索的結(jié)果，該細菌與凝乳酶乳酸桿菌的16SrDNA顯示出最高的同源性(大約99.5%)，并在分子系譜樹中形成了同樣的凝乳酶乳酸桿菌簇。根據(jù)結(jié)果判斷該細菌是凝乳酶乳酸桿菌。這樣制備的系譜樹顯示在圖1中。盡管本發(fā)明的乳酸菌具有在不存在食鹽和乳酸的情況下從L-谷氨酸和L-谷氨酸鹽生產(chǎn)GABA的能力，但它即使在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在1%到4%乳酸和8%到12%食鹽的條件下也能夠產(chǎn)生GABA(參見實施例2)。此外，除了在培養(yǎng)開始時之外，它能夠在培養(yǎng)基中共同存在0到4%的乳酸和0到12%食鹽的條件下產(chǎn)生GABA。本發(fā)明的生產(chǎn)含有GABA的培養(yǎng)混合物的方法是通過將具有上面提到的性質(zhì)的乳酸菌接種到含有L-谷氨酸和/或其鹽的培養(yǎng)基中、并對其進行培養(yǎng)以生產(chǎn)含有GABA的培養(yǎng)混合物的方法。當(dāng)乳酸細菌被用于本發(fā)明時，盡管使用了從未精制的醬油中分離、培養(yǎng)和亞培養(yǎng)的物種，但未精制的醬油中包含的該同樣的物種也可以直接或通過重新分離來使用。此外，可以使用冷凍干燥的細胞、低溫保存的菌株和液體培養(yǎng)肉湯中的任何一種。為了產(chǎn)生GABA，在本發(fā)明使用的培養(yǎng)基中必需含有谷氨酸。當(dāng)谷氨酸被包含在培養(yǎng)基中時，盡管L-谷氨酸作為一種氨基酸在化學(xué)上是優(yōu)選的，但是它可以是作為具有調(diào)味劑用途的食品添加劑的谷氨酸或谷氨酸鈉、其它的谷氨酸鹽和通過用酸或酶水解食物蛋白而獲得的谷氨酸的任何一種。此外，含有游離谷氨酸的食品例如調(diào)味品、加工過的海產(chǎn)品和西紅柿也同樣可以使用。就此而言，在獲得含有更大量GABA的培養(yǎng)混合物時，需要使用含有更大量谷氨酸的培養(yǎng)基。另外，除了上面提到的谷氨酸之外，對于乳酸菌的生長來說，在本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基優(yōu)選還含有至少一種糖類例如葡萄糖、果糖和麥芽糖、含有維生素和礦物質(zhì)的食品例如酵母提取物和肉類提取物、或酒曲和酒曲消化物。此外，食品添加劑例如乳化劑、穩(wěn)定劑和pH調(diào)節(jié)劑也可以使用?？梢杂糜谂囵B(yǎng)基的酒曲和酒曲消化物的例子包括，使酒曲真菌或酒曲真菌的酶與一種或兩種或多種選自谷類例如小麥、大麥、黑麥、珍珠麥、壓碎的小麥或大麥、奎藜籽、粟、稗、黍、稻米和玉米以及豆類例如大豆、赤豆、蕓豆、羽扇豆、玻璃豆(glassbean)、扁豆的變性處理過的原料進行反應(yīng)而制備的蛋白水解產(chǎn)物。醬油、未精制的醬油、味噌、豆類等的蛋白水解產(chǎn)物等是優(yōu)選的。使用含有谷氨酸源、食鹽和碳源、起始pH為4.0到7.0的培養(yǎng)基，將上面提到的能夠產(chǎn)生GABA的凝乳酶乳酸桿菌在25到35°C下培養(yǎng)48到96小時，并將獲得的乳酸菌種子培養(yǎng)物以主培養(yǎng)基體積的大約1/1,000到1/10的體積進行接種，由此進行了本發(fā)明的乳酸菌的接種。盡管對于可以用于本發(fā)明培養(yǎng)的裝置的大小和材料的質(zhì)量沒有限制，只要它可以清洗和熱滅菌并能夠用于生產(chǎn)食物就行，但是優(yōu)選它具有衛(wèi)生的結(jié)構(gòu)，使得它難以被各種病菌污染。對于培養(yǎng)條件來說，基于乳酸菌的細菌學(xué)性質(zhì)(參見表l)，培養(yǎng)溫度從20到40。C，優(yōu)選從25到35。C，起始pH優(yōu)選從4.0到7.0。對于培養(yǎng)時間來說，必需進行足夠長的時間，使得谷氨酸源例如L-谷氨酸和/或其鹽可以被轉(zhuǎn)化成所需濃度的GABA。例如從1到4周的時間是優(yōu)選的。通過這種方式，可以獲得含有GABA的培養(yǎng)混合物，它作為被加工的食品等的原材料具有廣泛的應(yīng)用。例如，使用通過本發(fā)明的方法獲得的含有GABA的培養(yǎng)混合物作為GABA強化原料直接添加到各種不同調(diào)味品和食品和飲料中，也是可能的。此外，也可以通過處理步驟例如壓縮、過濾、濃縮和干燥以增加GABA的含量來使用它。對于上面提到的過濾步驟來說，可以使用用于食品加工用途的一般壓濾裝置來進行，所述裝置使用了濾器、濾布等，并可以使用用于食品用的助濾劑例如硅藻土、纖維素和活性炭。對于濃縮步驟來說，可以使用裝置例如真空濃縮器、減壓濃縮器、蒸餾釜和冷凍濃縮器，也可以使用培養(yǎng)混合物中的水分通過簡單加熱而蒸發(fā)的方法。另外，對于干燥步驟來說，優(yōu)選通過有效和衛(wèi)生的方法進行噴霧干燥或冷凍干燥。此外，為了獲得其中GABA含量進一步增加的培養(yǎng)混合物，除了上面提到的步驟之外還可以使用液相層析或方法。通過這樣處理含有GABA的培養(yǎng)混合物，可以獲得含有GABA的液體和粉末食品。通過將它們配制成各種不同的食物中或?qū)λ鼈冞M行二次加工，可以容易地獲得其中強化了GABA的調(diào)味劑或食品和飲料。在二次加工中，可以包含通常用于食品中的成分，例如賦形劑、甜味劑、增稠劑、蛋白、肽、脂類、多糖、糖和鹽。就此而言，在這樣獲得的培養(yǎng)混合物和補充了培養(yǎng)混合物的調(diào)味品和食品和飲料中測定GABA的含量，可以使用用于分析的儀器例如高效液相色譜和氨基酸分析儀、使用酶的分析試劑等來進行。盡管下面將參考實施例對本發(fā)明進行進一步詳細的描述，但本發(fā)明不限于此。實施例實施例1<乳酸菌的獲得>從各種種類的發(fā)酵食品收集適當(dāng)量的待測樣品，并將適量的每種樣品加入到裝在德漢試管中的MRS-SOYTONE培養(yǎng)基中(5.5%MRS肉湯，0.5%細菌大豆蛋白胨，0.5%谷氨酸鈉，8%食鹽，5%食品添加劑乳酸，pH5.1)，在30。C進行靜置培養(yǎng)。將被證實在德漢試管中產(chǎn)生了氣體的培養(yǎng)基用MRS-SOYTONE培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋，鋪展在MRS-SOYTONE瓊脂培養(yǎng)基上，然后在AnaeroPackKenki(MitsubishiGasChemicalCo.，Inc)中于30°C培養(yǎng)7天。將這樣獲得的單個菌落再次接種到裝在德漢試管中的MRS-SOYTONE培養(yǎng)基中，測量被證實產(chǎn)生了氣體的樣品中的GABA。就此而論，從同樣的分離源分離到的菌株進行分別的鑒定，以避免選擇兩個或多個同樣的菌株。GABA通過Hitachi,Ltd.制造的高效氨基酸分析儀L-8800進行測量。結(jié)果表明菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1都產(chǎn)生GABA。就此而論，菌株KG34和菌株KG43的生理學(xué)性質(zhì)被顯示在表1中，菌株KG34和菌株KG43的16SrDNA序列被顯示在SEQIDNO:l和2中。菌株KG34和菌株KG43的16SrDNA序列彼此之間100%—致。實施例2<鹽抗性和乳酸抗性的證實>在裝在德漢試管中的MRS-Soytone培養(yǎng)基(5.5%MRS肉湯，0.5^大豆蛋白胨，0.5n/。谷氨酸鈉，pH5.1)的基礎(chǔ)上，使用其中食鹽被改變到8%或12%、食品添加劑乳酸改變到0%、1%或4%的培養(yǎng)基，在食鹽和乳酸在培養(yǎng)開始時存在于培養(yǎng)基中的條件下，證實了菌株KG34、KG43、Sl、KG31、KG64、KG-18-4和KG4-14-1的GABA生產(chǎn)力。此外，在該情況下，進行了與常規(guī)已知的產(chǎn)生GABA的乳酸菌的比較，結(jié)果顯示在表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例3〈含有GABA的培養(yǎng)混合物(調(diào)味品)的生產(chǎn)方法>通過在70克小麥麥麩和IOO克醬油曲中加入160ml溫水，在其中再加入通過對無名假絲酵母(Candidafamata)km-1(FERMP-8897)進行36個小時的通氣攪拌培養(yǎng)(培養(yǎng)基組成葡萄糖6%,酵母提取物1%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.1%，pH5.5，培養(yǎng)溫度30。C)獲得培養(yǎng)液5ml作為谷氨酰胺酶，在50°C下用24小時進行麥麩的降解和將降解形成的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸。在向這樣獲得的降解產(chǎn)物中加入食鹽到終濃度8%并進一步加入食品添加劑乳酸到終濃度1%、接著將溫度降低到30。C之后，以大約1(^個細胞/ml的密度接種凝乳酶乳酸桿菌菌株KG34或菌株KG43,在30°C下輕柔攪拌培養(yǎng)7天。將每個這樣獲得的培養(yǎng)混合物過濾以獲得澄清的液體。接種有菌株KG34的培養(yǎng)液體的GABA含量是13.0mg/ml，在KG43的情況下是19.5mg/ml。作為對照，盡管使用了常規(guī)已知的產(chǎn)生GABA的菌株短乳酸桿菌NBRC3345進行了同樣的試驗，但最終獲得的澄清液體中GABA的濃度是2.0mg/ml。因此，沒有進行充分的GABA生產(chǎn)。盡管已經(jīng)參考具體的實施方案對本發(fā)明進行了詳細的描述，但對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)技術(shù)人員來說，顯然可以對其進行各種不同的改變和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。本申請基于2006年2月21日提交的日本專利申請(日本專利申請No.2006-043836)，其全部內(nèi)容在此引為參考。所有在此引用的參考文獻整體引為參考。工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供使用廉價的原料而沒有野生菌株對發(fā)酵造成抑制的情況下穩(wěn)定地生產(chǎn)GABA的方法。權(quán)利要求1.屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的乳酸菌，其能夠在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在乳酸和食鹽的條件下產(chǎn)生γ-氨基丁酸。2.屬于乳酸桿菌屬的乳酸菌，其能夠在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在1%到4%乳酸和8%到12%食鹽的條件下產(chǎn)生"氨基丁酸。3.權(quán)利要求1或2中的乳酸菌，其中所述乳酸菌是凝乳酶乳酸桿菌(Lactobacillusrennini)。4.生產(chǎn)含有y-氨基丁酸的培養(yǎng)混合物的方法，其中將權(quán)利要求1到3任何一個所描述的乳酸菌在接種到含有L-谷氨酸和/或其鹽的培養(yǎng)基中之后進行培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明提供了即使在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在乳酸和食鹽的條件下仍然能夠生產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)的乳酸菌，以及生產(chǎn)含有GABA的培養(yǎng)混合物的方法。具體來說，可以通過從未精制的醬油中分離即使在培養(yǎng)開始時在培養(yǎng)基中共同存在乳酸和食鹽的條件下仍然能夠生產(chǎn)GABA的乳酸菌凝乳酶乳酸桿菌(Lactobacillusrennini)，并在將乳酸菌接種到含有L-谷氨酸和/或其鹽的培養(yǎng)基中之后對其進行培養(yǎng)，來獲得含有GABA的培養(yǎng)混合物。文檔編號C12P13/00GK101389751SQ20078000622公開日2009年3月18日申請日期2007年2月21日優(yōu)先權(quán)日2006年2月21日發(fā)明者下條亮,佐藤五雄,半谷吉識申請人:龜甲萬株式會社