專利名稱：一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑的篩選方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能減輕甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)抗腫瘤藥耐藥性的藥物及其篩選技術(shù)。

背景技術(shù)：
目前臨床上抗癌藥種類用的最多的是烷化劑和氧化-還原循環(huán)物，這兩類藥物包括環(huán)磷酰胺(CTX)、異環(huán)磷酰胺、美法蘭、瘤可寧、噻替派、馬利蘭、亞硝脲類藥物、順鉑等十多種抗癌藥。烷化劑類抗腫瘤藥物具有高度的化學(xué)活性、能直接作用于對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有重要意義的蛋白質(zhì)、酶、核酸的關(guān)鍵部分，與這些組織中的氨基、巰基、羧基及磷酸基等起烷化反應(yīng)，使細(xì)胞的蛋白質(zhì)、酶及核酸發(fā)生變性、結(jié)構(gòu)或生理功能發(fā)生變異，從而阻止腫瘤細(xì)胞增殖使其死亡。因本類藥物直接與生物大分子發(fā)生烷化反應(yīng)，故又稱生物烷化劑。烷化劑類抗腫瘤藥物按化學(xué)結(jié)構(gòu)還可分為氮芥類、乙烯亞胺類、磺酸酯類、鹵代多元醇類及亞硝基脲類等。瘤可寧(Chlorambucil)為烷化劑類抗腫瘤藥，是一種氮芥衍生物，對(duì)多種腫瘤有抑制作用。鉑類金屬抗癌藥與烷化劑作用類似，均能與DNA分子內(nèi)鳥(niǎo)嘌呤堿基上N7或鳥(niǎo)嘌呤N3的分子形成交叉聯(lián)節(jié)。這些作用導(dǎo)致細(xì)胞因功能失調(diào)而死亡，其中的順鉑(Cisplatin)屬細(xì)胞周期非特異性藥物，具有細(xì)胞毒性，可抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程，并損傷其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用。
因腫瘤而死亡的患者中90％與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)，特別是多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)，這是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的其他抗腫瘤藥物也都產(chǎn)生交叉耐藥性。導(dǎo)致產(chǎn)生多藥耐藥性的因素中，與細(xì)胞膜有關(guān)的主要因素有P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥性相關(guān)蛋白(MRP)和肺多藥耐藥性相關(guān)蛋白(LRP)等，與細(xì)胞質(zhì)有關(guān)的主要因素有凋亡抑制蛋白(I-APs)、拓?fù)洚悩?gòu)酶II、蛋白激酶C和谷胱苷肽氧化還原系統(tǒng)等。但最重要、最常見(jiàn)的為P-gp，也稱典型MDR，其為一種廣泛存在于多種腫瘤細(xì)胞胞膜上的蛋白，負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，從而引起腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，降低腫瘤化療的療效。另一方面可能是因?yàn)橐恍┠退幍鞍椎谋磉_(dá)增加或活力升高導(dǎo)致細(xì)胞自身的生存能力增強(qiáng)所致，從而腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了耐藥性。理論上，克服多藥耐藥性主要有兩種途徑，一種是開(kāi)發(fā)對(duì)MDR、細(xì)胞不具有耐藥性的新抗癌藥物，另一種途徑是尋找MDR的逆轉(zhuǎn)劑與抗癌藥物合用，恢復(fù)MDR細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性。在腫瘤化療領(lǐng)域中，克服多藥耐藥性的研究一直方興未艾，也是腫瘤化療領(lǐng)域急需解決的難題。
研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/ECH(NF-E2-related factor2或Chicken erythroid-derivedCNC-homology factor)是一種66-kDa蛋白，含有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)，屬于CNC(cap-‘n’-collar)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，最初被Moi等人分離得到。常態(tài)下，胞漿中的Nrf2被胞漿蛋白伴侶分子Keapl(Kelch-like ECH-associated proteinl)的DGR區(qū)結(jié)合從而處于抑制狀態(tài)，Keapl同時(shí)可促進(jìn)Nrf2的泛素蛋白酶體途徑降解過(guò)程。活性氧及親核劑等氧化應(yīng)激源作用下，Nrf2脫離Keapl，轉(zhuǎn)移入核，通過(guò)bZIP與小分子Maf蛋白異二聚化之后二聚體與抗氧化元件ARE上GCTGAGTCA位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)受ARE調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。基因分析顯示，ARE是一個(gè)特異的DNA-啟動(dòng)子結(jié)合部位，位于谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、NAD(P)H醌氧化還原酶1(NQO1)、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)、微粒體環(huán)氧化物水解酶、谷氨酰半胱氨酸連接酶GCL(含GCLC和GSLM兩個(gè)亞基)、谷胱甘肽合成酶、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物岐化酶(SOD)、血紅素氧化酶(HO-1)、醛脫氫酶、醛酮還原酶、AKR1C1(醇醛酮還原酶家族1，成員C1)等II相解毒酶和抗氧化酶基因的5’側(cè)翼區(qū)域，其能被多種抗氧化性和(或)親電性物質(zhì)激活，從而激活I(lǐng)I相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)，進(jìn)而增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性。Nrf2的激活受多個(gè)水平的調(diào)控，主要涉及Nrf2與Keapl的相互作用。Nrf2從Keapl解離是Nrf2激活的重要環(huán)節(jié)，主要通過(guò)兩種途徑，其一是親核物質(zhì)或活性氧(reactive oxygen species，ROS)直接攻擊作用；其二是磷酸化的間接作用。目前認(rèn)為促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、蛋白激酶C(PKC)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等幾條蛋白激酶途徑參與了Nrf2-ARE通路激活和其依賴基因表達(dá)的調(diào)控。Nrf2、Keapl和ARE是Nrf2-ARE信號(hào)系統(tǒng)的軸心元件。激活Nrf2-ARE信號(hào)通路能上調(diào)很多II相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而表達(dá)一些抗致癌物、氧化劑和其他有毒化學(xué)物質(zhì)的基因產(chǎn)物，起細(xì)胞保護(hù)作用。Nrf2是調(diào)控細(xì)胞對(duì)抗有害環(huán)境因素的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2缺失或激活障礙，會(huì)引起細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源的敏感性增高，可加重氧化應(yīng)激源的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡，其與化學(xué)促癌的發(fā)生、炎癥修復(fù)進(jìn)程延長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡等病變密切相關(guān)。
近幾年來(lái)，對(duì)一些抗癌藥的耐藥性研究表明Nrf2調(diào)控的一系列基因與多藥耐藥性的典型蛋白MDR有很大的關(guān)系，這是腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥產(chǎn)生耐藥性的一條重要途徑。某些抗腫瘤藥能在腫瘤細(xì)胞中激活Nrf2轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致第II相解毒酶和抗氧化酶基因表達(dá)量的增加，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥的抗性，引起很多種腫瘤對(duì)這些抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性。從而，以Nrf2為研究腫瘤耐藥性的分子靶標(biāo)，篩選Nrf2的拮抗劑，可能起到致敏腫瘤細(xì)胞的作用，降低腫瘤耐藥性。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要解決腫瘤化療領(lǐng)域急需解決的難題，提供一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑的方法，獲取與抗癌藥物合用的能有效克服多藥耐藥性的藥劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明在Nrf2與腫瘤耐藥性關(guān)系的基礎(chǔ)上，建立了靈敏、穩(wěn)定、以Nrf2為分子靶標(biāo)的細(xì)胞篩藥平臺(tái)。采用以叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)為Nrf2誘導(dǎo)劑，取Nrf2抑制劑視黃酸Retinoid acid(RA)或X為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)熒光素酶活力檢測(cè)，篩選有效抑制tBHQ和萊菔硫烷Sulforaphane誘導(dǎo)的熒光素酶活力的Nrf2抑制劑，作為降低腫瘤耐藥性的藥劑。據(jù)此試驗(yàn)可知某些生物堿小分子化合物可能使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物-烷化劑和氧化還原循環(huán)物更敏感?？寡趸哉T導(dǎo)劑tBHQ能強(qiáng)誘導(dǎo)II相解毒酶，而不會(huì)誘導(dǎo)其它藥物代謝酶，為單功能誘導(dǎo)劑。
通過(guò)本方法實(shí)驗(yàn)中的熒光素酶活性檢測(cè)技術(shù)，我們篩選得到生物堿類小分子化合物ZDAK02(硫代乙酸酯甲氧檗因coralyne sulfoacetate)可以成為Nrf2抑制劑，能有效抑制瘤瘤可寧Chlorambucil等抗腫瘤藥對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活作用。
硫代乙酸酯甲氧檗因ZDAK02結(jié)構(gòu)式為
本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明所篩選的藥劑ZDAK02(硫代乙酸酯甲氧檗因coralyne sulfoacetate)能增強(qiáng)烷化劑抗癌藥瘤可寧Chlorambucil對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性并能減輕甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)該抗癌藥的耐藥性。以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和人結(jié)腸腺癌Caco2細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，用報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)不同加藥組細(xì)胞中熒光素酶活力，ZDAK02能有效抑制該誘導(dǎo)作用；ZDAK02能使瘤可寧Chlorambucil對(duì)細(xì)胞的毒性增加。實(shí)踐證明本發(fā)明對(duì)抗腫瘤具有顯著效果。



圖1為tBHQ濃度0、1、5、10、20μM所誘導(dǎo)的螢光素酶活性； 圖2為Sul濃度0、1、5、10μM所誘導(dǎo)的螢光素酶活性； 圖3為ZDAK02(硫代乙酸酯甲氧檗因coralyne sulfoacetate)(cs)濃度0、10、20、25、40、50μM對(duì)20μM tBHQ的所誘導(dǎo)的螢光素酶活性的抑制百分比曲線； 圖4為抑制劑50μM CS增加X(jué)W細(xì)胞對(duì)瘤可寧Chlorambucil的敏感性； 圖5為抑制劑50μM CS增加Caco2細(xì)胞對(duì)瘤可寧Chlorambucil的敏感性。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明篩選增敏腫瘤細(xì)胞藥物的方法，其具體實(shí)施過(guò)程如下，參照附圖可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 1、材料 1.1 試劑 DMEM(GIBCO)每包Dulbecco’s Modified Eagle Medium(10.3g)溶于高純水中，再緩慢加3.7g NaHCO3體積調(diào)至1L，過(guò)濾分裝并4℃保存。
MEM(GIBCO)每包Minimum Essential Medium(10.3g)溶于高純水中，再緩慢加2.2gNaHCO3體積調(diào)至1L，過(guò)濾分裝并4℃保存。
胎牛血清(FBS，GIBCO) 抗生素Antibiotic-Antimycotic(GIBCO，100*) G418(GIBCO，100*)稱取G418粉1.6g，溶于20ml1*PBS中，抽濾除菌，分裝后-20℃保存。
胰酶Nacl(百達(dá))8g+Kcl(天龍)0.2g+Na2HPO4(湖試)3.2g+KH2PO4(湖試)0.2g+胰酶(trypgin，生工)2.5g+EDTA(生工)0.2g溶于雙蒸水1000ml中，抽濾除菌，分裝后-20℃保存，注意在加入胰酶粉后不能加熱和劇烈攪拌。
10*磷酸鹽緩沖液(PBS)Nacl(百達(dá))80g+Kcl(天龍)2.0g+Na2HPO4(湖試)14.4g+KH2PO4(湖試)2.4g，加水調(diào)至1L，調(diào)PH值至7.2-7.4。使用時(shí)，要稀釋成1*PBS且經(jīng)過(guò)高溫滅菌。
臺(tái)盼蘭溶液稱臺(tái)盼蘭粉(沃凱)0.2g溶于50ml的生理鹽水中，放入50℃水浴中加熱，經(jīng)過(guò)過(guò)濾后常溫保存。
1.2 藥品 tBHQ、Sulforaphane ZDAK02(coralyne sulfoacetate)，順鉑Cisplatin(APS)、苯丁酸氮芥Chlorambucil L-Buthionine-[S，R]-sulfox-imine(bso，SIGMA)抑制還原型谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)，使GSH合成減少。使用bso1h后檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的氧活性物質(zhì)(ROS)增多，3h達(dá)高峰，此時(shí)GSH水平降至正常的30％，GSH在24h后完全耗竭，48h后線粒體失去功能。
MTT250mg MTT粉溶于50ml 1*PBS中，抽濾除菌后，分裝后4℃避光保存。
螢光素酶發(fā)光底物試劑盒Luciferase Assay System(Promega) 裂解液Passive lysis(5*Buffer，Promega)、 Dimethyl sulfoxide minimum 99.5％ GC(DMSO，GIBCO) 1.3 實(shí)驗(yàn)器材 96孔板購(gòu)自Greiner Bio-one Millex Syringe Driven Filter Unit 0.22μM(MILLIPORE) Steriltop Vacuum Driven Disposable Filtration System(MILLIPORE) 電子天平FA2004N(上海精密科學(xué)儀器有限公司) 培養(yǎng)箱Thermo Series II Water Jacketed CO2 Incubator 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Thermo MULTISKAN SPECT RUM 熒光化學(xué)發(fā)光儀Thermo FLUOROSKAN ASCENT FL EPPENDORF MIX MATE 1.4 細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)室建立了一非常靈敏、穩(wěn)定、以Nrf2為分子靶標(biāo)的、人類乳腺癌MCF-7螢光素酶報(bào)告蛋白細(xì)胞株ARExw(xw)。這一細(xì)胞株具有一ARE-報(bào)告蛋白基因質(zhì)粒，此報(bào)告蛋白基因定位在8個(gè)連鎖排列的ARE序列下游。將需要篩選的化合物加到細(xì)胞中，就能檢測(cè)所篩選的化合物是否能降低誘導(dǎo)或降低報(bào)告蛋白基因的表達(dá)。這一細(xì)胞篩藥平臺(tái)確保了所獲取的藥物先導(dǎo)物的可溶性及細(xì)胞膜穿透性。
結(jié)腸癌Caco2株來(lái)源于人體結(jié)腸癌細(xì)胞，同源性好，在培養(yǎng)條件下可自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化并可形成緊密連接，其形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的表達(dá)等特征與人類腸道粘膜相似。
上述兩種細(xì)胞株均購(gòu)自上海細(xì)胞所。
2、方法 2.1 細(xì)胞復(fù)蘇 ARExw細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM+10％ FBS+抗生素(1100)+G418(1100)，Caco2細(xì)胞培養(yǎng)基為MEM+10％ FBS+抗生素(1100)，兩種細(xì)胞培養(yǎng)條件為5％CO2，(37±0.5)℃，濕潤(rùn)。
(1)從液氮中取出細(xì)胞株，立刻化凍。
(2)把冰凍管內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入5ml培養(yǎng)基。
(3)以1000轉(zhuǎn)/秒，離心5min后，去掉上清液，再加入5ml的培養(yǎng)基并多次吹打細(xì)胞沉淀，使之完全分散。
(4)取小號(hào)的培養(yǎng)瓶，在其表面注明復(fù)蘇細(xì)胞名稱、培養(yǎng)基類型、代數(shù)、時(shí)間。最后離心管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，把培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋松放入培養(yǎng)箱內(nèi)。
2.2 細(xì)胞擴(kuò)增 (1)在顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞覆蓋率超過(guò)70％，則準(zhǔn)備擴(kuò)增細(xì)胞。
(2)吸去廢液，再用1*PBS(與原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基相同的量)洗一遍，往培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰酶(小號(hào)瓶1-2ml，中號(hào)瓶5ml)，再把培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)加熱3-5min，消化至細(xì)胞從鋪展開(kāi)的多邊形稍縮為圓形。
(3)取出培養(yǎng)瓶，往里面加入含10％NCF的培養(yǎng)液停止消化(小號(hào)瓶2-3ml，中號(hào)瓶5ml)，并吹打數(shù)次，再把細(xì)胞懸液體轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
(4)以1000轉(zhuǎn)/秒，離心5min后，去掉上清液，再加入培養(yǎng)基并多次吹打細(xì)胞沉淀，使之完全分散。
(5)按細(xì)胞量取相應(yīng)個(gè)數(shù)的中瓶加入培養(yǎng)基，再加入離心管內(nèi)的細(xì)胞液，中瓶保持總體積為15ml/瓶。
(6)在培養(yǎng)瓶表面注明復(fù)蘇細(xì)胞名稱、培養(yǎng)基類型、代數(shù)、時(shí)間。最后把培養(yǎng)瓶的瓶蓋旋松放入培養(yǎng)箱內(nèi)。
2.3種細(xì)胞 (1)吸去廢液，再用1*PBS洗一遍，往培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入胰酶消化。
(2)加入含10％FBS的培養(yǎng)液停止消化，并吹打數(shù)次，再把細(xì)胞懸液體轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
(3)以1000轉(zhuǎn)/秒，離心5min后，去掉上清液，再加入培養(yǎng)基并多次吹打細(xì)胞沉淀，使之完全分散。
(4)吸50ul的細(xì)胞懸液到0.5ml的小離心管內(nèi)，再加入100ul的1*PBS和50ul的臺(tái)盼藍(lán)，用槍混勻。再吸10ul到數(shù)細(xì)胞的玻片內(nèi)，進(jìn)行數(shù)細(xì)胞。
(5)根據(jù)細(xì)胞數(shù)，算好體積，則即以每孔200ul細(xì)胞懸液種到96孔板中，注意96孔板最外面的一圈孔不加，因此只有60孔。最后把種好的96孔板放入培養(yǎng)箱內(nèi)。
2.4 細(xì)胞加藥 (1)現(xiàn)有藥品的濃度tBHQ 5mM和100mM、Sul(sulforaphan)5mM、ZDAK02(coralynesulfoacetate)5mM、Chlorambucil 50mM和bso 10mM (2)bso預(yù)處理是96孔板每孔200ul中加入1ul的100mM bso，則終濃度為50μM bso，然后放入培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜，不要超過(guò)24h。
(3)設(shè)計(jì)加藥分組，一般以三個(gè)孔為一組，有一個(gè)空白對(duì)照、DMSO1％對(duì)照、加誘導(dǎo)藥組、抑制劑組、誘導(dǎo)藥和抑制劑混合組。
(4)把藥與含抗生素的無(wú)血清的培養(yǎng)液混勻，并取出96孔板去其廢液，用1*PBS洗一遍，進(jìn)行加藥。最后放入培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜。
2.5 螢光素酶測(cè)定 (1)取發(fā)光底物和裂解液化凍。
(2)取加藥24h的96孔板，去掉廢液，用1*PBS洗一遍，然后每孔加入20ul的裂解液，放到MIX MATE上1000rpm，25min。
(3)25min后避光往每孔加100ul的發(fā)光底物，1000rpm，60s。最后去熒光化學(xué)發(fā)光儀讀數(shù)。
2.6 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法) (1)種細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜。
(2)設(shè)計(jì)加藥分組，一般以三個(gè)孔為一組，則96孔板的60個(gè)孔可以分為上下各十組。一般設(shè)計(jì)有一個(gè)空白，一個(gè)DMSO，抑制劑組，上層不同濃度抗癌藥組，對(duì)比下層相應(yīng)不同濃度抗癌藥加抑制劑組。
(3)把藥品與含抗生素的無(wú)血清的培養(yǎng)液混勻，并取出96孔板，去廢液，用1*PBS洗一遍后加藥，放入培養(yǎng)箱內(nèi)24h。
(4)取出加藥24h的96孔板，每孔加入20ul的MTT，再放入培養(yǎng)箱內(nèi)。
(5)4h后取出96孔板，小心去掉廢液，注意不能用力。
(6)避光每孔加入200ulDMSO，放到MIX MATE(混勻器)上1000rpm，15min。最后到全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀以490nm波長(zhǎng)光源讀數(shù)。
2.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)為了提高準(zhǔn)確度，把每加藥組做三個(gè)孔，并重復(fù)三次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組資料之間的比較采用t檢驗(yàn)。采用GraphPad Prism 4統(tǒng)計(jì)軟件分析。以P<0.05或P<0.01為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果 1.tBHQ和Sul(sulforaphane)的濃度曲線 通過(guò)測(cè)量不同濃度tBHQ和Sulforphane所誘導(dǎo)的ARExw細(xì)胞螢光素酶活性，可以得到在一定濃度范圍內(nèi)tBHQ和Sul所誘導(dǎo)的螢光素酶活性呈濃度依賴性增強(qiáng)。其中濃度0表示本底1％DMSO誘導(dǎo)的螢光素酶活性，這是因?yàn)樗幤范际侨苡贒MSO的，DMSO相比空白，也具有誘導(dǎo)作用，且DMSO終濃度超過(guò)1％會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。
表1 為不同濃度tBHQ所誘導(dǎo)的螢光素酶活性(x±s，n＝5) 表1
如圖1所示，XW細(xì)胞以5.0*104個(gè)/ml密度種板過(guò)夜，用不同濃度的tBHQ處理XW細(xì)胞24h后測(cè)量，且每個(gè)濃度重復(fù)5次。(x±s，n＝5) 選擇Sulforphane濃度為0、1、5μM處理ARExw細(xì)胞24h后測(cè)量，但在10μM時(shí)由于大量XW細(xì)胞已經(jīng)被殺死，所以讀數(shù)很小。
表2為不同濃度Sul所誘導(dǎo)的螢光素酶活性(x±s，n＝5) 表2
如圖2所示，XW細(xì)胞以5.0*104個(gè)/ml密度種板過(guò)夜，用不同濃度的Sul處理XW細(xì)胞24h后測(cè)量，且每個(gè)濃度重復(fù)5次。。(x±s，n＝5)。
2.如圖1、圖2所示，本發(fā)明篩選出的藥劑即小分子抑制劑ZDAK02(coralynesulfoacetate)(cs)對(duì)20μM tBHQ和5μM Sul所誘導(dǎo)的螢光素酶活性的抑制百分比曲線 2.1 小分子抑制劑ZDAK02(coralyne sulfoacetate)(cs)只對(duì)20μM tBHQ所誘導(dǎo)的螢光素酶活性有抑制作用，且抑制作用隨終濃度的升高而增強(qiáng)。
表3為不同濃度ZDAK02(coralyne sulfoacetate)(cs)對(duì)20μM tBHQ的所誘導(dǎo)的螢光素酶活性的抑制(％，x±s，n＝2) 表3
如圖3所示XW細(xì)胞以5.0*104個(gè)/ml密度種板過(guò)夜，用不同濃度的cs和20μM tBHQ一起處理ARExw細(xì)胞24h后測(cè)量，且每個(gè)濃度重復(fù)3次。數(shù)據(jù)處理方式為計(jì)算出對(duì)照組1％DMSO讀數(shù)的平均值，其他加藥組的平均值除以1％DMSO的平均值得到倍數(shù)。以公式(20μM tBHQ組倍數(shù)-不同濃度cs和20μM tBHQ混合組倍數(shù))/20μM tBHQ組倍數(shù)*100％可以算出抑制百分比，取3次的百分比求出平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。(％，x±s，n＝3)。
3，細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證Nrf2小分子抑制劑能夠增敏腫瘤細(xì)胞，我們把XW細(xì)胞和Caco2細(xì)胞暴露于不同濃度的Chlorambucil、相應(yīng)濃度Chlorambucil+抑制劑、奧沙利鉑和相應(yīng)濃度奧沙利鉑+抑制劑中24h后測(cè)量細(xì)胞活力。
抑制劑CS能夠增加X(jué)W細(xì)胞對(duì)Chlorambucil和Caco2細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性，如圖4、圖5所示。
如圖4所示，XW細(xì)胞以7.5*104個(gè)/ml密度種板過(guò)夜，50μM CS分別和0、10、25、50、75、100、150、200μM Chlorambucil一起處理XW細(xì)胞24h后測(cè)量，且每個(gè)濃度重復(fù)3次。數(shù)據(jù)處理方式為計(jì)算出對(duì)照組1％DMSO讀數(shù)的平均值作為100％，各濃度Chlorambucil組的平均值/1％DMSO的平均值*100％可以算出活力百分比；計(jì)算出50μM CS組的平均值作為100％，50μM CS+各濃度Chlorambucil組的平均值/50μM CS組的平均值*100％可以算出活力百分比。本圖是3次實(shí)驗(yàn)中有代表性的一組數(shù)據(jù)。
如圖5所示，Caco2細(xì)胞以5.0*104個(gè)/ml密度種板過(guò)夜，50μM CS分別和0、25、50、75、100、1251μM奧沙利鉑一起處理Caco2細(xì)胞24h后測(cè)量，且每個(gè)濃度重復(fù)3次。數(shù)據(jù)處理方式為計(jì)算出對(duì)照組1％DMSO讀數(shù)的平均值作為100％，各濃度奧沙利鉑組的平均值/1％DMSO的平均值*100％可以算出活力百分比；計(jì)算出50μM CS組的平均值作為100％，50μM CS+各濃度奧沙利鉑組的平均值/50μM CS組的平均值*100％可以算出活力百分比。本圖是3次實(shí)驗(yàn)中的一組數(shù)據(jù)。
綜上所述，Chlorambucil是臨床上常用的抗癌藥，對(duì)這類抗癌藥的耐藥性研究表明它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中激活Nrf2轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致II相解毒酶和抗氧化酶基因表達(dá)量的增加，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥的抗性，引起多種腫瘤對(duì)這些抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性。Nrf2現(xiàn)已成為腫瘤化療增敏解毒藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)蛋白，以Nrf2-ARE通路為分子靶點(diǎn)的抑制劑的研發(fā)和使用，一方面將有可能增敏腫瘤細(xì)胞，即減少抗癌藥物的用量從而減輕毒副作用；另一方面也會(huì)逆轉(zhuǎn)耐藥性。因此，以Nrf2-ARE為分子靶點(diǎn)的抑制劑的開(kāi)發(fā)利用將有可能改善化療藥物的治療效果，為癌癥的協(xié)同治療提供一條新途徑。
本實(shí)驗(yàn)室建立了靈敏、穩(wěn)定、以Nrf2為分子靶標(biāo)的熒光素酶報(bào)告蛋白細(xì)胞株ARExw篩藥平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶發(fā)現(xiàn)tBHQ能強(qiáng)有力地誘導(dǎo)Nrf2-ARE信號(hào)通路調(diào)控的某些基因的蛋白表達(dá)水平。因此，選擇tBHQ作為Nrf2誘導(dǎo)劑來(lái)篩選Nrf2抑制劑。以tBHQ為Nrf2誘導(dǎo)劑，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZDAK02(coralyne sulfoacetate)(cs)能有效抑制tBHQ的誘導(dǎo)作用。
ZDAK02(coralyne sulfoacetate)(cs)能增加烷化劑瘤可寧Chlorambucil抗癌藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，聯(lián)合使用ZDAK02(coralyne sulfoacetate)(cs)能改善瘤可寧Chlorambucil抗癌藥的治療效果，ZDAK02(coralyne sulfoacetate)(cs)具有聯(lián)合治療的開(kāi)發(fā)前景。
權(quán)利要求
1、一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑的篩選方法，其特征是利用以Nrf2為分子靶標(biāo)的細(xì)胞篩選平臺(tái)，以叔丁基對(duì)苯二酚tBHQ為Nrf2誘導(dǎo)劑，取Nrf2抑制劑視黃酸Retinoid acid(RA)或X為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)熒光素酶活力檢測(cè)，來(lái)篩選出能有效抑制該誘導(dǎo)作用即抑制Nrf2的抑制劑，該抑制劑即為能增敏腫瘤細(xì)胞的藥劑。
2、由權(quán)利要求1所述增敏腫瘤細(xì)胞藥劑的篩選方法，篩選得到增敏腫瘤細(xì)胞的藥劑為一種小分子化合物硫代乙酸酯甲氧檗因ZDAKO2，其結(jié)構(gòu)式為
3、權(quán)利要求2所述的增敏腫瘤細(xì)胞的藥劑ZDAKO2(硫代乙酸酯甲氧檗因coralynesulfoacetate)的應(yīng)用，將該藥劑與烷化劑抗癌瘤可寧Chlorambucil或與抗癌藥奧沙利鉑聯(lián)合使用，以治療癌癥。
全文摘要
一種增敏腫瘤細(xì)胞藥劑的篩選方法及其應(yīng)用。主要為解決在腫瘤化療過(guò)程中，有效克服多藥耐藥性，以提高抗癌藥的治療效果。本發(fā)明利用以Nrf2為分子靶標(biāo)的細(xì)胞篩藥平臺(tái)，以tBHQ為Nrf2誘導(dǎo)劑，通過(guò)熒光素酶活力檢測(cè)，篩選出能有抑制該誘導(dǎo)作用的抑制劑，這種抑制劑即為增敏腫瘤細(xì)胞的藥劑。經(jīng)過(guò)篩選獲得的該藥劑為一種小分子化合物ZDAK02(coralyne sulfoacetate硫代乙酸酯甲氧檗因)。它與抗癌藥瘤可寧Chlorambucil或抗癌藥奧沙利鉑聯(lián)合使用，即可增強(qiáng)抗癌藥對(duì)癌細(xì)胞的毒性，還可有助減輕甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)抗癌藥的多藥耐藥性。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK101457251SQ20071016452
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日
發(fā)明者唐修文 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)