專(zhuān)利名稱(chēng)：利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑，尤其時(shí)利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞 制劑的方法及其用途。
背景技術(shù)：
內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)又稱(chēng)血管母細(xì)胞， 是來(lái)源于骨髓，并能在體內(nèi)循環(huán)、增殖并分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的前體 細(xì)胞。在體內(nèi)EPC可以定居到缺血部位參與新血管的形成。經(jīng)基因修飾后的 EPC還用于抗新生血管治療腫瘤性及炎癥性疾病。用EPC作為種子細(xì)胞可在 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建組織工程血管。將EPC接種到生物可降解支架上，并移植入 犬的下腔靜脈，結(jié)果證實(shí)EPC在犬體內(nèi)分化成內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。目前 從臍血、骨髓、外周血都能分離出EPC，但其來(lái)源較少，細(xì)胞增殖能力有限， 在一些特定的病理?xiàng)l件下，其表型會(huì)發(fā)生改變，生物學(xué)活性下降，使其應(yīng)用 受到限制。
血管組織工程近年來(lái)發(fā)展迅速，但是要臨床應(yīng)用還有不少問(wèn)題有待解 決。例如種子細(xì)胞來(lái)源少、體外構(gòu)建自體血管的時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題，如何在 較短時(shí)間內(nèi)完成干細(xì)胞的分離、純化、倍增，從而達(dá)到臨床應(yīng)用要求的問(wèn)題。
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是近年來(lái)研究的一個(gè) 熱點(diǎn)，間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化能力，體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，抗原性弱，不涉 及倫理道德等問(wèn)題。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓中中胚層來(lái)源的未分化細(xì)胞，具備 分化為成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種組織細(xì)胞及高增殖的潛能。 其有以下優(yōu)勢(shì)①取材方便；②對(duì)供體健康無(wú)害；③體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、不易 丟失細(xì)胞表型；④不存在組織配型的問(wèn)題。但是隨著年齡的增長(zhǎng)，骨髓中 BMSCs的含量會(huì)降低，增加了分離培養(yǎng)的難度，而且得到的細(xì)胞增殖分化的 能力會(huì)降低。 近些年來(lái)，人們從臍帶、胎盤(pán)中也陸續(xù)分離出間充質(zhì)干細(xì)胞。其具有骨 髓基質(zhì)干細(xì)胞相同的特點(diǎn)，細(xì)胞的擴(kuò)增分化能力不受年齡的影響。胎盤(pán)及臍 帶來(lái)源豐富，其間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量很高，因此，可為臨床應(yīng)用，組織工程提供 理想的種子細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮 祖細(xì)胞制劑的方法及其用途，即一種新型來(lái)源的內(nèi)皮袓細(xì)胞制劑的制備方 法，在臍帶胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以很容易
地分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率80%以上，而且轉(zhuǎn)化過(guò)程中及轉(zhuǎn)化后仍具有擴(kuò) 增能力，為解決內(nèi)皮祖細(xì)胞的來(lái)源及增殖能力差的問(wèn)題提供了解決方法。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種利用臍帶或胎 盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的方法，所述內(nèi)皮袓細(xì)胞制劑來(lái)源于從體外的臍 帶或胎盤(pán)中分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，在間充質(zhì)培養(yǎng)基中體外擴(kuò)增后，再加
入含VEGF、 ECGF和肝素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞。 所述的臍帶或胎盤(pán)是人的臍帶或胎盤(pán)。
所述的分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、間充質(zhì)干細(xì) 胞的的體外擴(kuò)增和間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含5-100ng/ml的VEGF， 5-300ug/ml的ECGF和 5-200U/ml的肝素。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的中含10ng/ml的VEGF， 20ug/ml的ECGF和100 U/ml 的肝素。
所述的利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮袓細(xì)胞制劑的方法，包括以下步
驟
A、 將體外處理干凈的臍帶或胎盤(pán)經(jīng)過(guò)機(jī)械切碎后，再經(jīng)過(guò)膠原酶消化 為單細(xì)胞懸液，洗滌去除膠原酶殘留，之后接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿或培養(yǎng)袋 內(nèi)；
B、 在含10-20%胎牛血清、10ng/ml bFGF 、 20ng/ml EGF的間充質(zhì)培養(yǎng)
基中培養(yǎng)，經(jīng)多次換液、傳代后得到較純的間充質(zhì)干細(xì)胞；
C、 將獲得的間充質(zhì)細(xì)胞改用含有5-100ng/ml VEGF、 5-300ug/ml ECGF 和5-200U/ml肝素的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)7-21天，獲得含有內(nèi)皮袓細(xì)胞的制 劑。
所述的步驟B中的傳代為三代以上。
上述方法制備的內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑可直接或經(jīng)基因修飾后用于治療腦血 管、心血管、外周血管閉塞性疾病或其他存在供血障礙的疾病，還可用于腫 瘤性及炎癥性疾病抑制血管新生。還可用于組織工程中作為種子細(xì)胞，構(gòu)建 組織工程血管。
本發(fā)明的有益效果使用本方法制備的內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑含有大量具有良 好增殖潛力的內(nèi)皮祖細(xì)胞，而且來(lái)源豐富，供者無(wú)痛苦，為解決內(nèi)皮祖細(xì)胞 的來(lái)源及增殖能力差的問(wèn)題提供了解決方法，為組織工程提供良好的種子細(xì) 胞來(lái)源，可建成細(xì)胞庫(kù)，快速、反復(fù)、大量提供細(xì)胞來(lái)源。


圖1未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定 圖2已誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮袓細(xì)胞的細(xì)胞Di1-ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光
染色鑒定
具體實(shí)施例方式
下面，結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不受限于下述實(shí) 施例。
一種利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的方法，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞 制劑來(lái)源于從體外的臍帶或胎盤(pán)中分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，在間充質(zhì)培養(yǎng) 基中體外擴(kuò)增后，再加入含VEGF、 ECGF和肝素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)間充質(zhì)干 細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
所述的臍帶或胎盤(pán)是人的臍帶或胎盤(pán)。
所述的分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、間充質(zhì)干細(xì) 胞的的體外擴(kuò)增和間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含5-100ng/ml的VEGF， 5-300ug/ml的ECGF和 5-200U/ml的肝素。
所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的中含10ng/ml的VEGF， 20ug/ml的ECGF和100 U/ml 的肝素。 所述的利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮袓細(xì)胞制劑的方法，包括以下步
驟
A、 將體外處理干凈的臍帶或胎盤(pán)經(jīng)過(guò)機(jī)械切碎后，再經(jīng)過(guò)膠原酶消化 為單細(xì)胞懸液，洗滌去除膠原酶殘留，之后接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿或培養(yǎng)袋
內(nèi)；
B、 在含10-20%胎牛血清、10ng/ml bFGF 、 20ng/ml EGF的間充質(zhì)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，經(jīng)多次換液、傳代后得到較純的間充質(zhì)干細(xì)胞；
C、 將獲得的間充質(zhì)細(xì)胞改用含有5-100ng/ml VEGF、 5-300ug/ml ECGF 和5-200U/ml肝素的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)7-21天，獲得含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的制 劑。
所述的步驟B中的傳代為三代以上。
上述方法制備的內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑可直接或經(jīng)基因修飾后用于治療腦血 管、心血管、外周血管閉塞性疾病或其他存在供血障礙的疾病，還可用于腫 瘤性及炎癥性疾病抑制血管新生。還可用于組織工程中作為種子細(xì)胞，構(gòu)建 組織工程血管。
實(shí)施例1:臍帶來(lái)源間充質(zhì)細(xì)胞分化的內(nèi)皮袓細(xì)胞制劑及其制備方法 A制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞
1、 取健康足月順產(chǎn)嬰兒臍帶，用加入含慶大霉素(濃度2-4萬(wàn)U /L) 肝素(濃度50-200U/ml)的生理鹽水沖洗表面，去除殘留血液及可能的細(xì)菌 污染，至少三次，每次更換容器及器械。
2、 機(jī)械粉碎組織，加入4-5倍體積的膠原酶消化液，37'C，攪拌，2 小時(shí)后收集消化液，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，細(xì)胞懸液加入2倍體積洗滌液(DF12 加5-20%胎牛血清)洗滌兩遍，使用間充質(zhì)培養(yǎng)基(含10-20%胎牛瓶清、 10ng/mlbFGF、 20ng/ml EGF)重懸沉淀后接種于培養(yǎng)瓶中，24-72小時(shí)后全 量換液，每3天半量換液。
3、 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)基，PBS洗 滌細(xì)胞一次，加入1%胰蛋白酶消化5-10分鐘，加入洗滌液終止消化，離心 棄上清，再加入洗滌液洗滌一次。沉淀用適量間充質(zhì)培養(yǎng)基重懸，按l: 2-3 傳代。培養(yǎng)3-4代后取樣鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞，其余細(xì)胞加入凍存液(40y。DF1250%胎牛血清10%DMS0)，細(xì)胞濃度106-107/ml，經(jīng)程控降溫后，置于液氮中 永久保存。
4、間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定。分為免疫表型測(cè)定及分化能力測(cè)定。 4.1、免疫表型檢測(cè)CD14， CD31， CD44, CD45， CD105, CD144, VWF， CD29， CD34, CD73, CD90， CD95， CD106, KDR， HLA-DR。使用1%胰蛋白酶消化體外 擴(kuò)增的第3-4代的間充質(zhì)干細(xì)胞，PBS洗滌2次，分成每管含5X1()5細(xì)胞， 第一管加入同型對(duì)照抗體(Mouse IgGl FITC/ Mouse IgGl PE) 20ul，其 余管中加入其它相應(yīng)抗體20ul (或者按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)定的試劑量加入)，混 勻，室溫避光靜置30分鐘，加入PBS 2ml，混勻，300g離心5分鐘，棄上 清，加入1%多聚甲醛400111，混勻，即可上機(jī)檢測(cè)。 4. 2細(xì)胞的成骨及成脂分化潛能及分化后鑒定
消化體外擴(kuò)增的第3-4代間充質(zhì)干細(xì)胞，以5xlOVcm2的密度接種于預(yù) 先放置無(wú)菌消毒蓋玻片的6孔板中，制備細(xì)胞爬片，每孔加2ml上述分離培 養(yǎng)基。在細(xì)胞達(dá)到60%—700%融合時(shí)，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。 4. 2.1成骨誘導(dǎo)分化
誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有10—7mol/L的地塞米松，lOmmol / L 3 -磷酸甘油， 0. 05mmo1 / L 2-磷酸抗壞血酸和10%FBS的DMEM—LG / F12培養(yǎng)液，每周 換液2次，培養(yǎng)21天。取出玻片，PBS洗滌一次，70%酒精固定10分鐘， 行茜素紅及范可薩染色，顯微鏡下觀(guān)察，照相。 4. 2. 2成脂誘導(dǎo)分化
誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有10—6mol/L的地塞米松，10ug/ml胰島素， 0. 5mmo1 / L異丁基甲基黃嘌吟(IBMX)， 200umo1 / L消炎痛(均為Sigma公 司產(chǎn)品)和10%FBS的DMEM—LG / F12培養(yǎng)液，每周換液2次，培養(yǎng)14 天。取出玻片，PBS洗滌一次，70%酒精固定10分鐘，以油紅O染色，鏡 檢、照相。
B間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑及其鑒定
1、取第3-4代間充質(zhì)干細(xì)胞，在原培養(yǎng)基中加入VEGF10ng/ml ECGF20ug/ml和肝素100 U/ml形成誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基，每3天半量換液。細(xì)胞 生長(zhǎng)至80-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞一次，加入1%胰蛋白酶消化5-10分鐘，加入培養(yǎng)基終止消化，離心棄上清，再加 入培養(yǎng)基洗滌一次。沉淀用適量誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸，按l: 2-3傳代。
2、培養(yǎng)7-21天后，取樣鑒定內(nèi)皮袓細(xì)胞，其余細(xì)胞加入凍存液(40% DF12 50。/。胎牛血清10%DMSO)，細(xì)胞濃度106-107/ml，經(jīng)程控降溫后，置 于液氮中永久保存。鑒定內(nèi)皮袓細(xì)胞包括免疫表型，DiI-ac-LDL和 FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定。
2.1、免疫表型檢測(cè)CD14, CD31， CD44， CD45, CD105, CD144, VWF， CD29， CD34, CD73, CD90, CD95， CD106， KDR， HLA-DR。使用1% 胰蛋白酶消化體外擴(kuò)增的內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑，PBS洗滌2次，分成每管含5X105 細(xì)胞，第一管加入同型對(duì)照抗體(Mouse IgGl FITC/MouseIgGl PE)20ul， 其余管中加入其它相應(yīng)抗體20ul (或者按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)定的試劑量加入)， 混勻，室溫避光靜置30分鐘，加入PBS 2ml，混勻，300g離心5分鐘，棄 上清，加入l。/。多聚甲醛400ul，混勻，即可上機(jī)檢測(cè)。(結(jié)果見(jiàn)圖3)
2. 2 Dil-ac-LDL和FITC-UEA-l雙熒光染色鑒定貼壁細(xì)胞60%融合更換 培養(yǎng)基時(shí)加入四甲基吲哚碳花青探針標(biāo)記乙酰化低密度脂蛋白(3， 3， 3，， 3' -tetramethylindocarbocyanine perchlorate labeled acetylated low density lipoprotein, Dil-acLDL; BTI)10ug/ml，置于37。C 、 5%孵育 箱中孵育4 h，爾后用無(wú)熒光的PBS洗滌細(xì)胞3次，再用10g/L多聚甲醛固定 細(xì)胞10min。固定后，用PBS浸洗，將10mg / L的FITC-UEA-l加于上述標(biāo)本中 于37"C下孵育1 h。未經(jīng)誘導(dǎo)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)照。在熒光顯微鏡下 觀(guān)察，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞即為內(nèi)皮袓細(xì)胞。(結(jié)果 見(jiàn)圖l、圖2) ,
實(shí)施例2:胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)細(xì)胞分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑及其制備方法 A制備胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞
1、 取健康足月順產(chǎn)嬰兒胎盤(pán)，用加入含慶大霉素(濃度2-4萬(wàn)U/L)肝 素(50-200U/ml)的生理鹽水沖洗表面，去除殘留血液及可能的細(xì)菌污染， 至少三次，每次更換容器及器械。
2、 機(jī)械粉碎組織，加入4-5倍體積的膠原酶消化液，37°C，攪拌，2小 時(shí)后收集消化液，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，細(xì)胞懸液加入2倍體積洗滌液(DF12加
5-20%胎牛血清)洗滌兩遍，使用間充質(zhì)培養(yǎng)基(含10-20。/。胎牛血清10ng/ml bFGF20ng/mlEGF)重懸沉淀后接種于培養(yǎng)瓶中，24-72小時(shí)后全量換液，每 3天半量換液。
3、 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)基，PBS洗 滌細(xì)胞一次，加入1%胰蛋白酶消化5-10分鐘，加入洗滌液終止消化，離心棄 上清，再加入洗滌液洗滌一次。沉淀用適量間充質(zhì)培養(yǎng)基重懸，按l: 2-3傳 代。培養(yǎng)3-4代后取樣鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞，其余細(xì)胞加入凍存液(40%DF12 50%胎牛血清10%DMSO)，細(xì)胞濃度106-107/1111，-經(jīng)程控降溫后，置于液 氮中永久保存。
4間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定分為免疫表型測(cè)定及分化能力測(cè)定 4.1、免疫表型檢測(cè)CD14， CD31, CD44, CD45， CD105, CD144， VWF， CD29, CD34, CD73， CD90， CD95， CD106， KDR， HLA-DR。使用1%胰 蛋白酶消化體外擴(kuò)增的第3-4代的間充質(zhì)干細(xì)胞，PBS洗滌2次，分成每管含 5X1()5細(xì)胞，第一管加入同型對(duì)照抗體(Mouse IgGl FITC/ Mouse IgGl PE) 20ul，其余管中加入其它相應(yīng)抗體20ul (或者按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)定的試劑量加 入)，混勻，室溫避光靜置30分鐘，加入PBS2ml，混勻，300g離心5分鐘， 棄上清，加入P/。多聚甲酸400ul，混勻，即可上機(jī)檢測(cè)。
4. 2細(xì)胞的成骨及成脂分化潛能及分化后鑒定
消化體外擴(kuò)增的第3-4代間充質(zhì)干細(xì)胞，以5xlOVcm2的密度接種于預(yù) 先放置無(wú)菌消毒蓋玻片的6孔板中，制備細(xì)胞爬片，每孔加2ml上述分離培 養(yǎng)基。在細(xì)胞達(dá)到60%—70%融合時(shí)，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。 4. 2. 1成骨誘導(dǎo)分化
誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有10—7mol/L的地塞米松，l(kmol / L 3 -磷酸甘油， 0. 05mmo1 / L 2-磷酸抗壞血酸和10%FBS的DMEM—LG / F12培養(yǎng)液，每周 換液2次，培養(yǎng)21天。取出玻片，PBS洗滌一次，70%酒精固定10分鐘， 行茜素紅及范可薩染色，顯微鏡下觀(guān)察，照相。 4. 2. 2成脂誘導(dǎo)分化
誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為含有10—6mol / L的地塞米松，10ug/ml胰島素，0.5mmo1 / L異丁基甲基黃嘌吟(IBMX) ， 200咖o1 / L消炎痛(均為Sigma公司產(chǎn)品)和 10XFBS的DMEM—LG/F12培養(yǎng)液，每周換液2次，培養(yǎng)14天。取出玻片， PBS洗滌一次，70%酒精固定10分鐘，以油紅O染色，鏡檢、照相。 B間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑及其鑒定
1、 取第3-4代間充質(zhì)干細(xì)胞，在原培養(yǎng)基中加入VEGF10ng/ml ECGF20ug/ml和肝素100U/ml形成誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基，每3天半量換液。細(xì)胞 生長(zhǎng)至80-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞一次，加 入iy。胰翠白酶消化5-IO分鐘，加入培養(yǎng)基終止消化，離心棄上清，再加入 培養(yǎng)基洗滌一次。沉淀用適量誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸，按l: 2-3傳代。
2、 培養(yǎng)7-21天后，取樣鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞，其余細(xì)胞加入凍存液(40% DF12 50%胎牛血清10%DMSO)，細(xì)胞濃度106-107ml，經(jīng)程控降溫后，置于液氮中 永久保存。鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞包括免疫表型，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-l雙熒 光染色鑒定。
2. 1、免疫表型檢測(cè)CD14， CD31, CD44, CD45, CD105， CD144， VWF, CD29， CD34, CD73， CD90， CD95， CD106， KDR， HLA-DR。使用1%胰蛋白酶消化體外 擴(kuò)增的內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑，PBS洗滌2次，分成每管含5X105細(xì)胞，第一管加 入同型對(duì)照抗體(Mouse IgGl FITC/Mouse IgGl PE) 20ul，其余管中加 入其它相應(yīng)抗體20ul (或者按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)定的試劑量加入)，混勻，室溫 避光靜置30分鐘，加入PBS 2ml，混勻，300g離心5分鐘，棄上清，加入 1%多聚甲醛400111，混勻，即可上機(jī)檢測(cè)。
2.2、 DiI-ac-LDL和FITC-UEA-l雙熒光染色鑒定貼壁細(xì)胞60%融合更 換培養(yǎng)基時(shí)加入四甲基吲哚碳花青探針標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍?3， 3， 3，， 3' -tetramethylindocarbocyanine perchlorate labeled acetylated low density lipoprotein, Dil-acLDL; BTI)10ug/ml，置于37。C 、 5%孵育 箱中孵育4 h,爾后用無(wú)熒光的PBS洗滌細(xì)胞3次，再用10g/L多聚甲醛固定 細(xì)胞10min。固定后，用PBS浸洗，將10mg / L的FITC-UEA-1加于上述標(biāo)本中 于37'C下孵育1 h。未經(jīng)誘導(dǎo)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞為對(duì)照。在熒光顯微鏡下 觀(guān)察，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I雙染色陽(yáng)性的細(xì)胞即為內(nèi)皮袓細(xì)胞。
上述方法制備的內(nèi)皮袓細(xì)胞制劑可直接或經(jīng)基因修飾后用于治療腦血 管、心血管、外周血管閉塞性疾病或其他存在供血障礙的疾病，經(jīng)基因修飾
后還可用于腫瘤性及炎癥性疾病抑制血管新生。由于該內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑具有 良好的增值能力，因此還可用于組織工程中作為種子細(xì)胞，構(gòu)建組織工程血 管。
綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之 士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí) 施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，所述內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑來(lái)源于從體外的臍帶或胎盤(pán)中分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，在間充質(zhì)培養(yǎng)基中體外擴(kuò)增后，再加入含VEGF、ECGF和肝素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的 方法，其特征在于，所述的臍帶或胎盤(pán)是人的臍帶或胎盤(pán)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的 方法，其特征在于，所述的分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞包括間充質(zhì)干細(xì)胞的分 離、間充質(zhì)干細(xì)胞的的體外擴(kuò)增和間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的 方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含5-100ng/ml的VEGF， 5-300ug/ml 的ECGF和5-200U/ml的肝素。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的 方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的中含10ng/ml的VEGF， 20ug/ml 的ECGF和100 U/ml的肝素。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的 方法，包括以下步驟A、 將體外處理干凈的臍帶或胎盤(pán)經(jīng)過(guò)機(jī)械切碎后，再經(jīng)過(guò)膠原酶消化 為單細(xì)胞懸液，洗滌去除膠原酶殘留，之后接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿或培養(yǎng)袋 內(nèi)；B、 在含10-20%胎牛血清、10ng/ml bFGF 、 20ng/ml EGF的間充質(zhì)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，經(jīng)多次換液、傳代后得到較純的間充質(zhì)干細(xì)胞；C、 將獲得的間充質(zhì)細(xì)胞改用含有5-100ng/ml VEGF、 5-300ug/ml ECGF 和5-200U/ml肝素的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)7-21天，獲得含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的制 劑。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮袓細(xì)胞制劑的 方法，其特征在于，所述的步驟B中的傳代為三代以上。
8、 權(quán)利要求l制備的內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑直接或經(jīng)基因修飾后在治療腦血管、心血管、外周血管閉塞性疾病或其他存在供血障礙的疾病，以及用于腫 瘤性及炎癥性疾病抑制血管新生和用于組織工程中作為種子細(xì)胞，構(gòu)建組織 工程血管中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用臍帶或胎盤(pán)制備含有內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的方法及其用途，主要涉及一種內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑的新型來(lái)源及其制備方法。該干細(xì)胞制劑采用胎盤(pán)或臍帶作為細(xì)胞來(lái)源，首先分離、擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，然后再加入VEGF誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞。按照本發(fā)明制備的內(nèi)皮祖細(xì)胞制劑，含有大量有良好增殖能力的內(nèi)皮祖細(xì)胞。該制劑可用于臨床治療、組織工程等應(yīng)用。其原料來(lái)源豐富、分離成功率及產(chǎn)率高，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101199550SQ20071015019
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日
發(fā)明者孟恒星, 燕 徐, 邱錄貴 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所