專利名稱：玉米鈣調(diào)磷酸酶b類似蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個來源于玉米的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白(calcineurin B-like protein，CBL)及其編碼基因與其在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
土壤鹽漬化是限制作物生長和造成作物減產(chǎn)的主要非生物脅迫之一。全世界約有20％的耕地和50％的灌溉田受到不同程度的鹽害威脅，并有逐年增加的趨勢。我國鹽漬土地面積約為1.4億畝，占耕地總面積的近7％，此外還有鹽漬荒地2億多畝。通過基因工程培育耐鹽作物品種是開發(fā)利用鹽漬地最有效、快捷的途徑之一。但是迄今為止，在已經(jīng)分離和鑒定過的基因中，可供基因工程利用的耐鹽基因很少，而且有些來自細(xì)菌和真菌，其安全性常引起爭議。因此，進(jìn)一步從基因水平研究植物的耐鹽機(jī)理，從植物中分離并發(fā)掘耐鹽基因具有重要意義。
土壤或環(huán)境中因鹽分過多對植物產(chǎn)生的危害又叫鹽脅迫。鹽脅迫對植物的危害主要包括離子毒害、滲透脅迫、營養(yǎng)脅迫和氧脅迫等方面(1)離子毒害目前認(rèn)為鹽土中危害植物生長的主要成分是Na+，Na+大量進(jìn)入細(xì)胞是導(dǎo)致鹽害的主要原因。Na+的毒害是多方面的。首先，Na+與Ca2+的離子半徑非常相近，因此Na+可置換細(xì)胞膜系統(tǒng)上結(jié)合的Ca2+，使膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及完整性受到破壞，膜的通透性增加，膜功能受損。其結(jié)果一方面是可引起細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)(包括K+等)外滲，另一方面是可使液泡膜上的H+質(zhì)子泵活性改變，造成膜兩側(cè)的H+質(zhì)子濃度梯度下降甚至消失，液泡堿化，細(xì)胞微環(huán)境改變。其次，Na+與K+有著相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)與物理特性，細(xì)胞質(zhì)中大量積累的Na+會與K+形成競爭，直接取代酶活性中心的K+或與某些酶的抑制區(qū)結(jié)合，從而導(dǎo)致許多酶活性的喪失。因此，細(xì)胞質(zhì)中Na+/K+比值可能是決定Na+毒性的關(guān)鍵。
(2)滲透脅迫鹽脅迫與滲透脅迫有著不可分割的關(guān)系。過多的鹽分會使土壤水勢降低，造成植物根系吸水困難，甚至體內(nèi)水分外滲，所以滲透脅迫是鹽脅迫導(dǎo)致植物受害的重要原因。
(3)營養(yǎng)脅迫植物在吸收礦質(zhì)元素的過程中，一些化學(xué)結(jié)構(gòu)及物理特性相近的元素之間存在著競爭關(guān)系。許多研究結(jié)果證明，高濃度的Na+可抑制植物對K+和Ca2+等必須元素的吸收和積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)這些元素的缺乏和離子不平衡。K+是植物必需的大量元素，在維持細(xì)胞生長和膨壓、調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動和酶活性等方面均起到重要作用。因此維持細(xì)胞內(nèi)K+、Na+平衡是植物耐鹽的重要機(jī)制。Ca2+不僅是維持植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、酶活性和許多代謝反應(yīng)的必需成分，更重要的是作為第二信使直接介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的多種信號途徑，從而在植物對逆境脅迫和發(fā)育信號的響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。增加外源Ca2+濃度可以減輕鹽脅迫對植物的毒害已經(jīng)被許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。
(4)氧脅迫高鹽還能打破植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的平衡，導(dǎo)致活性氧過度積累。活性氧含量增高能引起膜脂過氧化或膜脂脫脂作用，從而導(dǎo)致膜的完整性受損，此外還會對蛋白質(zhì)和核酸等大分子造成損傷。
植物對鹽脅迫的適應(yīng)能力稱為耐鹽性。研究植物的耐鹽機(jī)理，分離耐鹽基因并通過基因工程培育耐鹽高產(chǎn)新品種是多年來國內(nèi)外學(xué)者的不懈追求。通過對模式植物擬南芥的研究，研究人員已經(jīng)從分子水平上對植物的耐鹽機(jī)理有了一定了解，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出一些耐鹽性明顯提高的株系。但迄今為止，已經(jīng)克隆到的耐鹽基因非常有限，其中通過基因工程手段能夠提高植物耐鹽性、有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的耐鹽基因更是寥寥無幾。以下是目前有關(guān)植物耐鹽機(jī)理的研究結(jié)果離子平衡的維持在高鹽環(huán)境下，維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，尤其是K+、Na+平衡是植物耐鹽的重要機(jī)制?，F(xiàn)有的研究資料表明，植物對離子平衡的維持需要通過幾條途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括限制鹽的吸收、增加鹽的外排和對吸收的鹽分進(jìn)行區(qū)隔化，以及控制鹽分從根系向地上部進(jìn)行長距離運(yùn)輸。
(1)限制Na+內(nèi)流質(zhì)膜對Na+的不通透性是限制Na+擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的天然屏障，但在高鹽環(huán)境下，仍然有大量Na+進(jìn)入細(xì)胞。關(guān)于Na+如何進(jìn)入植物細(xì)胞尚無定論，可能通過下列途徑一是外整流型陽離子通道，高鹽環(huán)境和質(zhì)膜去極化增加了該通道開放的可能性，Na+順巨大的電化學(xué)梯度流入細(xì)胞。因此任何減少該離子通道開放的調(diào)節(jié)都能限制Na+進(jìn)入細(xì)胞而增強(qiáng)耐鹽性。二是對電壓不敏感的一價(jià)陽離子通道(voltage-insensitive monovalent cation channel，VIC)，但其分子基礎(chǔ)仍不明確。三是通過低親K+系統(tǒng)。Na+、K+的跨膜運(yùn)輸相互競爭，表明二者可能有相似的吸收機(jī)理。K+的吸收通過高親K+和低親K+兩種系統(tǒng)進(jìn)行。在低K+(10-30μM)環(huán)境時，通過高親K+系統(tǒng)吸收，并且不受Na+阻礙。這種高親K+系統(tǒng)可能就是由K+/H+共運(yùn)輸體HKTI組成。而在高K+(300μM以上)環(huán)境時，通過低親K+系統(tǒng)吸收，此時表現(xiàn)為低的Na+、K+選擇性，Na+可能通過此途徑進(jìn)入細(xì)胞。因此在鹽脅迫下啟動高親K+系統(tǒng)，從而特異性地吸收K+而阻止Na+內(nèi)流便成為植物耐鹽的重要機(jī)制。
(2)Na+的外排與區(qū)隔化通過質(zhì)膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體將Na+運(yùn)出細(xì)胞可能是高等植物外排Na+的主要機(jī)制。質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體由多基因家族編碼，從擬南芥中分離到的SOS1即屬于該家族成員之一。SOS1基因突變導(dǎo)致擬南芥對氯化鈉和氯化鋰超敏感，SOS1mRNA在根尖表皮細(xì)胞和根、莖、葉質(zhì)外體與共質(zhì)體交界處的軟組織中表達(dá)量非常高，膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明SOS1蛋白具有Na+轉(zhuǎn)運(yùn)活性。這些證據(jù)表明SOS1蛋白在擬南芥細(xì)胞內(nèi)Na+跨膜外排中具有重要功能。將細(xì)胞內(nèi)過多的Na+儲存在液泡中是植物降低Na+毒害的另一重要機(jī)制。這一過程是通過液泡膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體完成的，近年來已經(jīng)從擬南芥等植物中分離到這類蛋白的編碼基因。Na+的液泡內(nèi)倉儲一方面將Na+與細(xì)胞質(zhì)中的酶和質(zhì)膜等敏感成分隔開，同時還可以平衡由高鹽所造成的細(xì)胞外滲透脅迫，使細(xì)胞盡可能多地吸收水分。
(3)Na+在體內(nèi)的運(yùn)輸和分配限制Na+從根部向地上部運(yùn)輸，以及Na+在地上部各器官和組織之間的合理分配是構(gòu)成耐鹽性的又一重要因素?？刂芅a+長距離運(yùn)輸?shù)牟襟E是Na+在根表皮細(xì)胞中的快速裝載和在木質(zhì)部的卸載。擬南芥中控制根部Na+運(yùn)向地上部的一個組分是SAS1，其突變造成地上部中Na+含量增加幾倍而根中Na+含量不變。另一個將Na+在木質(zhì)部卸載的組分是SOS1。sos1突變體在中度鹽濃度下地上部積累的鹽分少于野生型，而在高鹽條件下其地上部比野生型積累較多的鹽分，因此推測在中度鹽濃度下SOS1可能促進(jìn)Na+從木質(zhì)部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，而在高鹽條件下SOS1可能又會限制這種轉(zhuǎn)運(yùn)過程，從而減輕Na+對地上部生長點(diǎn)的危害。
調(diào)滲物質(zhì)和鹽脅迫相關(guān)蛋白的合成鹽脅迫誘導(dǎo)植物體內(nèi)合成的調(diào)滲物質(zhì)分兩類一類是小分子有機(jī)化合物，包括脯氨酸、甜菜堿、甘露醇、海藻糖、山梨醇和多胺等，另一類是蛋白質(zhì)/調(diào)滲蛋白(osmotin)。此外還合成一些解毒酶，如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、可溶性環(huán)氧化物水解酶、超氧化物酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶等，以及許多功能未知的蛋白。這些物質(zhì)的作用主要是調(diào)節(jié)滲透平衡、清除活性氧或阻止其對細(xì)胞結(jié)構(gòu)與大分子的損傷。干旱、高溫和低溫等逆境脅迫也會誘導(dǎo)這些物質(zhì)的合成，這與其作用機(jī)制是相符的，因?yàn)檫@些非生物逆境都可以對植物造成滲透脅迫和活性氧傷害，而這些保護(hù)性物質(zhì)的積累是植物抗逆的重要機(jī)制之一。
擬南芥的鹽脅迫離子平衡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑-SOS途徑植物耐鹽性的產(chǎn)生是由多種信號途徑交叉對話、共同作用的結(jié)果。這些信號途徑涉及離子平衡、滲透調(diào)節(jié)、解毒反應(yīng)和細(xì)胞分裂與生長調(diào)節(jié)等諸多方面。目前在高等植物中除了擬南芥的SOS途徑外，對其它途徑的組成及其信號級聯(lián)反應(yīng)了解不多。
SOS途徑的發(fā)現(xiàn)始于對擬南芥鹽超敏感突變體，即sos(salt overly sensitive)突變體的篩選。從1996年開始，美國亞利桑那大學(xué)Zhu等(Wu，S.J.，Ding，L.，Zhu，J.K.(1996)SOS1，a genetic locus essential for salt tolerance and potassiumacquisitíon.Plant Cell 8617-627；Liu，J.，Ishitani，M.，Halfter，U.，Kim，C.S.，Zhu，J.K.(2000)The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes a proteinkinase that is required for salt tolerance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973730-3734；Liu，J.，Zhu，J.K.(1998)A calcium sensor homolog required forplant salt tolerance.Science 2801943-1945；Shi，H.，Kim，Y.S.，Guo，Y.，Stevenson，B.，Zhu，J.K.(2003)The Arabidopsis SOS5 locus encodes a putativecell surface adhesion protein and is required for normal cell expansion.PlantCell 1519-32).通過對擬南芥sos突變體的研究，率先在高等植物耐鹽性機(jī)理方面取得突破性進(jìn)展。它們共獲得5組非等位基因突變體，命名為sos1-sos5，并通過圖位克隆分離到5個相應(yīng)的耐鹽基因，即SOS1-SOS5。sos突變體均表現(xiàn)出對氯化鈉和氯化鋰脅迫的超敏感性。目前對SOS1、SOS2和SOS3的功能較為清楚，其編碼產(chǎn)物作用于同一條信號途徑。SOS1基因編碼一種質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體，其N端含有12個疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域，C端為較長的親水性尾部，位于細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，可能與感應(yīng)細(xì)胞質(zhì)中的Na+濃度有關(guān)，它是SOS途徑的效應(yīng)分子。SOS1基因的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性至少受SOS2和SOS3的部分調(diào)節(jié)。SOS2又稱為AtCIPK24，編碼一種Ser/Thr蛋白激酶，其N端有一個與酵母SNF1激酶(sucrose-non-fermenting protein kinase)和哺乳動物AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinases)相似的催化結(jié)構(gòu)域，C端為調(diào)節(jié)區(qū)，含有一個高度保守的由21個氨基酸殘基組成的FISL基序。系列缺失分析表明，F(xiàn)ISL基序是介導(dǎo)SOS2與SOS3結(jié)合的必須區(qū)域。SOS3又稱為CBL4，其編碼產(chǎn)物為一種鈣離子結(jié)合蛋白，與酵母和動物鈣調(diào)磷酸酶的B亞基(CNB)以及動物神經(jīng)鈣傳感器(NCS)有較高同源性。推測其氨基酸序列中含有3個與鈣離子結(jié)合有關(guān)的EF手性結(jié)構(gòu)域和一個N端豆蔻?；卣餍蛄?。實(shí)驗(yàn)證明鈣離子結(jié)合以及N端豆蔻?；瘜τ赟OS3在耐鹽性中的功能都是必需的?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，Zhu等(Halfter，U.，Ishitani，M.，Zhu，J.K.(2000)The Arabidopsis SOS2 protein kinasephysically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973735-3740；Qiu，Q.S.，Guo，Y.，Dietrich，M.A.，Schumaker，K.S.，Zhu，J.K.(2002)Regulation of SOS1，a plasma membrane Na+H+exchanger in Arabidopsis thaliana，by SOS2 and SOS3.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 998436-8441；Zhu，J.K.(2002)Salt and drought stress signaltransduction in plants.Annu.Rev.Plant Biol.53，247-273.)提出了擬南芥鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的SOS模型在SOS途徑中，SOS3感受由鹽脅迫所激發(fā)的鈣信號，然后與其靶蛋白SOS2結(jié)合并激活其激酶活性；活化的SOS3-SOS2復(fù)合體進(jìn)一步通過磷酸化作用激活質(zhì)膜上的SOS1，再由SOS1將胞質(zhì)溶膠中過多的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而維持了細(xì)胞內(nèi)的離子平衡。這一模型已通過SOS途徑在酵母中的重建實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步驗(yàn)證。
耐鹽基因分兩類，一類是功能基因，其產(chǎn)物為直接在耐鹽性中起作用的效應(yīng)分子，如編碼各種小分子調(diào)滲物質(zhì)合成酶的基因和解毒酶類的基因，各種膜運(yùn)輸?shù)鞍住⑺ǖ赖鞍缀鸵恍┡c鹽脅迫相關(guān)的代謝酶類的編碼基因也屬于此類。另一類是調(diào)節(jié)基因，其產(chǎn)物在鹽信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中位于效應(yīng)分子的上游，直接或間接地對功能基因的表達(dá)或其產(chǎn)物的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。已鑒定的調(diào)節(jié)蛋白包括鈣離子感應(yīng)蛋白、蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等。近20年來，國內(nèi)外已經(jīng)從各種生物，包括細(xì)菌、酵母、藻類和高等植物中分離到許多耐鹽相關(guān)基因，但經(jīng)功能驗(yàn)證可以提高轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性者僅占其中一少部分，包括編碼調(diào)滲物質(zhì)合成酶、膜運(yùn)輸?shù)鞍缀碗x子泵、抗氧化劑和保護(hù)性酶類的功能基因，以及少數(shù)調(diào)節(jié)基因。盡管文獻(xiàn)報(bào)道這些基因可以提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，但多數(shù)對于耐鹽性的改善程度十分有限，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中尚無實(shí)用價(jià)值。造成這一現(xiàn)狀的原因主要在于植物耐鹽性本身的復(fù)雜性以及所用耐鹽基因的局限性。植物耐鹽性是由多基因控制的數(shù)量性狀，耐鹽性的形成是多個生理過程在器官、組織和細(xì)胞等不同層次上綜合作用的結(jié)果，可能涉及若干信號途徑的綜合調(diào)控。目前，在植物耐鹽基因工程中所用的目的基因大多屬于耐鹽功能基因，轉(zhuǎn)基因在受體細(xì)胞中難免受到相關(guān)調(diào)控途徑的影響而不能正常表達(dá)甚至發(fā)生沉默，再加上多數(shù)是單基因轉(zhuǎn)化，因此，通過這一途徑來改善植物耐鹽性的效果是非常有限的。通過轉(zhuǎn)化耐鹽調(diào)節(jié)基因來調(diào)控受體植物的相關(guān)代謝過程可能是克服這一局限的有效途徑。目前，已經(jīng)分離并通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證可以提高植物耐鹽性的調(diào)節(jié)基因很少，包括幾種轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因(DREB、Alfinl、MsPRP2和Tsi1等)、酵母的CaN(鈣調(diào)磷酸酶)基因和HAL1基因、水稻的OsCDPK7(鈣離子依賴性蛋白激酶)基因、擬南芥的AtGSK1(糖原合成酶激酶)基因和RS(SR-like剪接蛋白)基因等。其中有些基因(如DREB和OsCDPK7等)還可以提高轉(zhuǎn)基因植物對低溫和干旱等逆境脅迫的抗性。
鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)的重要第二信使，在植物細(xì)胞對各種環(huán)境脅迫以及自身發(fā)育信號的傳遞過程中起著關(guān)鍵作用。高鹽、干旱和低溫等逆境脅迫均可以觸發(fā)植物細(xì)胞質(zhì)中的游離鈣離子濃度瞬間升高，從而產(chǎn)生鈣信號。一般認(rèn)為由不同逆境因子所觸發(fā)的鈣信號具有特異性，并被相應(yīng)的鈣離子感應(yīng)蛋白所識別和傳遞，進(jìn)而激活其下游的一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞應(yīng)答。因此，鈣離子感應(yīng)蛋白是各種鈣信號途徑中最上游的成員，對鈣信號的傳遞及其介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)具有非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。至今在高等植物中發(fā)現(xiàn)的鈣離子感應(yīng)蛋白主要有三類，第一類是鈣調(diào)素以及鈣調(diào)素相關(guān)蛋白家族，第二類是鈣離子依賴性蛋白激酶(CDPKs)家族，第三類是新近發(fā)現(xiàn)的與鈣調(diào)磷酸酶B類似的蛋白(calcineurin B-like proteins，CBLs)家族。CBL家族在擬南芥和水稻中各有十個成員，其中擬南芥的AtCBL1、4、9和水稻的OsCBL2已經(jīng)被分離并進(jìn)行了功能鑒定。AtCBL4/SOS3是第一個被分離和鑒定的CBL基因，在擬南芥的鹽脅迫離子平衡信號途徑中具有重要調(diào)節(jié)功能，但至今尚未見到其在轉(zhuǎn)基因植物中可以提高耐鹽性的報(bào)道。AtCBL1參與擬南芥對低溫、干旱和鹽脅迫的響應(yīng)，將其在擬南芥中超表達(dá)可以提高植株的耐鹽性和耐旱性，但轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性卻明顯降低，這在一定程度上影響了該基因在耐鹽基因工程中的應(yīng)用價(jià)值。AtCBL9參與擬南芥對ABA(脫落酸)的響應(yīng)并在ABA合成中起到重要的調(diào)節(jié)作用。OsCBL2參與水稻糊粉細(xì)胞對GA(赤霉素/酸)的應(yīng)答，并且可能在GA信號途徑介導(dǎo)的糊粉細(xì)胞液泡化，即糊粉小泡的形成中行使功能。CBL基因?yàn)楦叩戎参锼赜?，目前尚未見到從其它植物中分離出功能明確的CBL基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白(calcineurin B-Like protein，CBL)。
本發(fā)明所提供的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白，名稱為ZmCBL4，來源于玉米屬玉米(Zeamays L.)，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性功能的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO1由211個氨基酸殘基組成，其中，自氨基端第44-57位、第81-92位、第118-129位和第162-173位氨基酸殘基為與鈣離子結(jié)合相關(guān)的EF手性結(jié)構(gòu)域，自氨基端第1-6位氨基酸殘基為N端豆蔻?；卣骰颉?br> 所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
編碼本發(fā)明鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白的基因(ZmCBL4)，其cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物耐鹽性功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由636個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-633位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
其基因組基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物耐鹽性功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO3由1994個堿基組成，自5′端第1-82位堿基為該基因組基因的第1個外顯子，自5′端第83-199位堿基為該基因組基因的第1個內(nèi)含子，自5′端第200-282位堿基為該基因組基因的第2個外顯子，自5′端第283-392位堿基為該基因組基因的第2個內(nèi)含子，自5′端第393-452位堿基為該基因組基因的第3個外顯子，自5′端第453-527位堿基為該基因組基因的第3個內(nèi)含子，自5′端第528-636位堿基為該基因組基因的第4個外顯子，自5′端第637-833位堿基為該基因組基因的第4個內(nèi)含子，自5′端第834-886位堿基為該基因組基因的第5個外顯子，自5′端第887-1530位堿基為該基因組基因的第5個內(nèi)含子，自5′端第1531-1605位堿基為該基因組基因的第6個外顯子，自5′端第1606-1716位堿基為該基因組基因的第6個內(nèi)含子，自5′端第1717-1829位堿基為該基因組基因的第7個外顯子，自5′端第1830-1939位堿基為該基因組基因的第7個內(nèi)含子，自5′端第1940-1994位堿基為該基因組基因的第8個外顯子。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增ZmCBL4中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高植物耐鹽性的方法。
本發(fā)明所提供的提高植物耐鹽性的方法，是將所述玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4或與ZmCBL4具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物耐鹽性獲得提高。
在上述提高植物耐鹽性的方法中，所述玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4既可為ZmCBL4的cDNA序列，也可為ZmCBL4的基因組基因序列；與ZmCBL4具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列，是將ZmCBL4的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會和全長序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以及測試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
所述玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4或其同源序列可通過含有ZmCBL4或其同源序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA系列載體、PER8、PX6、pBI系列載體、pBin系列載體或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pUC系列載體或pBluescript系列載體等。
使用ZmCBL4或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子；所述組成性表達(dá)啟動子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，玉米Ubiquitin啟動子或水稻actin1啟動子等；所述組織特異性表達(dá)啟動子可為種子特異性表達(dá)啟動子、花特異性表達(dá)啟動子或花粉特異性表達(dá)啟動子，如2S1啟動子(GenBank號NM_118848.2，GI30687489)和NapinA(GenBank號M64633.1，GI349405)啟動子；所述誘導(dǎo)型啟動子可為受ABA、乙烯或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動子；上述啟動子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測手段對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。
其中，以pCAMBIA3301為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有ZmCBL4的植物表達(dá)載體為p3301-ZmCBL4。
攜帶有本發(fā)明玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管、微注射、電激、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。
此外，通過將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4或與ZmCBL4具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因型純合的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的方法對雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官既可來源于擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草等雙子葉植物，也可來源于玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。
本發(fā)明提供了一個來源于玉米的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白ZmCBL4及其編碼基因。本發(fā)明提供的玉米耐鹽調(diào)節(jié)基因ZmCBL4屬于高等植物CBL基因家族成員，其編碼蛋白在植物對鹽脅迫響應(yīng)的鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要調(diào)節(jié)功能，最終使植物的耐鹽性增強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，將其在擬南芥sos3突變體中超表達(dá)可以完全恢復(fù)突變體的耐鹽表型，而在野生型中超表達(dá)可以明顯提高轉(zhuǎn)基因株系在種子萌發(fā)期和幼苗生長期的耐鹽性。推斷ZmCBL4轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽機(jī)理為該基因可以感受由鹽脅迫觸發(fā)的鈣信號，并啟動植物的離子平衡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即SOS途徑，從而使細(xì)胞能夠在高鹽環(huán)境下維持離子平衡，植物耐鹽性得到增強(qiáng)。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬望}機(jī)制的研究，以及提高植物的耐鹽性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物的耐鹽基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1A為ZmCBL4基因全長cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖1B為ZmCBL4基因基因組DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖2為ZmCBL4在玉米基因組中拷貝數(shù)的Southern blot分析圖譜圖3A為ZmCBL4基因在不同脅迫條件下在玉米幼苗葉片中的表達(dá)動態(tài)分析結(jié)果圖3B為ZmCBL4基因在不同脅迫條件下在玉米幼苗根系中的表達(dá)動態(tài)分析結(jié)果圖4為ZmCBL4在玉米不同組織中的特異性表達(dá)水平圖5為構(gòu)建的植物表達(dá)載體p3301-ZmCBL4的酶切鑒定電泳圖譜圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代陽性植株中目的基因ZmCBL4的PCR鑒定電泳圖譜圖7A為ZmCBL4在ZmCBL4轉(zhuǎn)基因擬南芥sos3突變體T3代純合株系中的Northernblot分析圖譜圖7B為ZmCBL4在ZmCBL4轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥T3代純合株系中的Northern blot分析圖譜圖8A為幼苗彎根試驗(yàn)檢測的ZmCBL4轉(zhuǎn)基因擬南芥sos3突變體T3代純合株系在MS附加不同濃度氯化鈉或氯化鋰培養(yǎng)基上的耐鹽性鑒定結(jié)果圖8B為種子萌發(fā)及幼苗生長試驗(yàn)檢測的ZmCBL4轉(zhuǎn)基因擬南芥sos3突變體T3代純合株系在MS附加不同濃度氯化鈉或氯化鋰培養(yǎng)基上的耐鹽性鑒定結(jié)果圖9為ZmCBL4轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥T3代株系在MS附加一定濃度氯化鈉或氯化鋰培養(yǎng)基上的耐鹽性鑒定結(jié)果圖10A為ZmCBL4轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥T3代株系在附加不同濃度氯化鈉的MS培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖10B為ZmCBL4轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥T3代株系在附加不同濃度氯化鋰的MS培養(yǎng)基上的種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。
實(shí)施例1、玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4的獲得及其基因組織結(jié)構(gòu)和基因組拷貝數(shù)分析一、玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4的全長cDNA序列的獲得與全長cDNA和基因組DNA的擴(kuò)增1、玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4 cDNA序列的獲得用擬南芥的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白(CBL)的氨基酸殘基序列在NCBI、MaizeGDB和TIGR等基因組數(shù)據(jù)庫中對玉米的各種序列進(jìn)行TBLASTN和BLASTP搜索，并將獲得的序列進(jìn)行拼接組裝，結(jié)果共得到9個重疊群，即9個推測的玉米的CBL編碼序列，然后將這9個推測的CBL氨基酸殘基序列與擬南芥中的10個CBL的氨基酸殘基序列進(jìn)行序列比對和聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個與AtSOS3/AtCBL4的編碼序列(GenBank號AF192886)同源性最高的基因序列，該序列具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，由1417bp個堿基組成，其編碼序列具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，由636個堿基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列，序列表中的SEQID NO1由211個氨基酸殘基組成，與AtSOS3/AtCBL4的一致性為57％，相似性為72％，序列分析結(jié)果表明該基因編碼的氨基酸殘基序列中有4個與鈣離子結(jié)合相關(guān)的EF手性結(jié)構(gòu)域(分別為SEQ ID NO1中自氨基端第44-57位、第81-92位、第118-129位和第162-173位氨基酸殘基)和一個N端豆蔻?；卣骰?SEQ ID NO1中自氨基端第1-6位氨基酸殘基)，將該基因命名為ZmCBL4，其編碼蛋白命名為ZmCBL4。
2、玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4 cDNA序列的擴(kuò)增根據(jù)ZmCBL4基因完整編碼框兩端的序列設(shè)計(jì)一對引物(SN1和AB1)，引物序列如下SN1(上游引物)5’-GATCCATGGGCTGCGCGACGTCCAA-3’；AB1(下游引物)5’-GTGGGTCACCATACGCAGATGTACGCAAAC-3’。
用熱酚法提取玉米旱21(由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供)自交系幼苗的總RNA，用Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶并參照說明書反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA并以此為模板，在引物SN1和AB1的引導(dǎo)下，用常規(guī)的PCR法擴(kuò)增ZmCBL4的全長cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.4％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1A所示(泳道M為100bp Marker，泳道1和2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了674bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收并純化該片段，將其連接入載體pGEM-T Easy(Promega公司)中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞(三博公司)，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-ZmCBL4，對其進(jìn)行測序，共對3次獨(dú)立PCR的pGEM-ZmCBL4重組質(zhì)粒進(jìn)行了序列測定，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的ZmCBL4的全長cDNA序列，具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列，由636個堿基組成，編碼序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列，其中，自5’端第132-171位、第243-276位、第354-387位和第486-519位堿基編碼與鈣離子結(jié)合相關(guān)的EF手性結(jié)構(gòu)域，自5’端第1-18位堿基編碼N端豆蔻?；卣骰颉?br> 3、玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因ZmCBL4基因組DNA的擴(kuò)增用CTAB法提取玉米旱21自交系幼苗的基因組DNA，在引物SN1和AB1的引導(dǎo)下，用常規(guī)的PCR法擴(kuò)增ZmCBL4的基因組DNA。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1B所示(泳道M為100bp Marker，泳道1和2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了2032bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收并純化該片段，將其連接入載體pGEM-T Easy中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-ZmCBL4Z，對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的ZmCBL4的基因組DNA，具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，由1994個堿基組成，編碼序列表中SEQ IDNO1的氨基酸殘基序列。
二、ZmCBL4基因組織結(jié)構(gòu)與基因組拷貝數(shù)分析1、基因組織結(jié)構(gòu)分析將步驟一經(jīng)測序獲得的ZmCBL4基因的cDNA序列與基因組DNA序列進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果表明該基因的基因組DNA具有7個內(nèi)含子和8個外顯子，其中，自5′端第1-82位堿基為該基因組基因的第1個外顯子，自5′端第83-199位堿基為該基因組基因的第1個內(nèi)含子，自5′端第200-282位堿基為該基因組基因的第2個外顯子，自5′端第283-392位堿基為該基因組基因的第2個內(nèi)含子，自5′端第393-452位堿基為該基因組基因的第3個外顯子，自5′端第453-527位堿基為該基因組基因的第3個內(nèi)含子，自5′端第528-636位堿基為該基因組基因的第4個外顯子，自5′端第637-833位堿基為該基因組基因的第4個內(nèi)含子，自5′端第834-886位堿基為該基因組基因的第5個外顯子，自5′端第887-1530位堿基為該基因組基因的第5個內(nèi)含子，自5′端第1531-1605位堿基為該基因組基因的第6個外顯子，自5′端第1606-1716位堿基為該基因組基因的第6個內(nèi)含子，自5′端第1717-1829位堿基為該基因組基因的第7個外顯子，自5′端第1830-1939位堿基為該基因組基因的第7個內(nèi)含子，自5′端第1940-1994位堿基為該基因組基因的第8個外顯子。
2、用Southern雜交法進(jìn)行基因組拷貝數(shù)分析用Southern雜交法對ZmCBL4基因進(jìn)行拷貝數(shù)分析，方法為取30μg玉米自交系旱21幼苗的基因組DNA，分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI、EcoRV、HindIII、BamHI、Kpn I和Sac I進(jìn)行單酶切消化，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用堿轉(zhuǎn)移液(見Sambrook，et al.，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，3rdedition，2001，NY，Cold Spring Harbor)轉(zhuǎn)移至Southern印跡膜，再以ZmCBL4基因的全長cDNA為探針進(jìn)行雜交(用Promega公司的Prime-a-Gene Labelling System試劑盒并參照試劑盒說明書制備探針)；預(yù)雜交和雜交液為Church緩沖液(見Sambrook，et al.，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)；雜交結(jié)束后，依次用2×SSC+0.5％SDS、1×SSC+0.5％SDS、0.5×SSC+0.5％SDS和0.1×SSC+0.1％SDS洗膜液在65℃下各洗膜一次，每次15min，然后用吸水紙吸掉膜表面的水分，用保鮮膜包好后壓磷板，三天后進(jìn)行圖像掃描，結(jié)果如圖2所示，表明ZmCBL4基因在玉米基因組中只有一個拷貝。
實(shí)施例2、ZmCBL4基因的誘導(dǎo)表達(dá)和組織特異性表達(dá)分析一、ZmCBL4基因在不同脅迫條件下的表達(dá)動態(tài)分析首先用常規(guī)的Northern blot法分析ZmCBL4基因在不同脅迫條件(250mM NaCl、20mM LiCl、100μM ABA、20％PEG溶液)下的表達(dá)情況，結(jié)果均未檢測到雜交信號，表明該基因的表達(dá)豐度很低，因此改用實(shí)時熒光定量PCR(Real-time quantitativePCR，RT-qPCR)技術(shù)對ZmCBL4基因在不同脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，具體方法包括以下步驟1、脅迫處理用沙培法培養(yǎng)玉米旱21自交系幼苗至三葉期，從花盆中小心取出整株幼苗并洗凈根部沙子，用Hogland營養(yǎng)液(配方參見陳建勛，王曉峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第二版)，華南理工大學(xué)出版社，2006年2月)在通氣條件下適應(yīng)培養(yǎng)三天，然后分別換成250mM NaCl、20mM LiCl、100μM ABA和20％PEG溶液(用Hogland營養(yǎng)液配制)進(jìn)行脅迫處理，取經(jīng)脅迫處理0、2、6、12和24小時后的幼苗，將根系和葉片分開并迅速投入液氮，轉(zhuǎn)移至-76℃冰箱中保存。
2、RT-qPCR檢測用熱酚法分別提取步驟1中經(jīng)不同脅迫處理的玉米植株的根系和葉片的總RNA，并用RQI DNase(Promega公司)消化，以去除基因組DNA污染，然后以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成其cDNA，再將合成的cDNA稀釋10倍作為RT-qPCR的模板。然后，以玉米α-微管蛋白(α-tubulin)基因(GenBank號X15704)作為內(nèi)標(biāo)基因，在數(shù)據(jù)分析時對不同樣品RNA/cDNA模板的上樣量進(jìn)行均一化。根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)原則(Applied Biosystems)，用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)目的基因ZmCBL4和內(nèi)標(biāo)基因α-tubulin的特異性引物，為了避免模板cDNA中可能存在的基因組DNA污染對擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生影響，將正義引物與反義引物分別設(shè)在不同外顯子中，引物序列如下檢測目的基因ZmCBL4表達(dá)水平的引物RTS3(上游引物)5’-TCAGTGTGTTCCACCCTAAAGCA-3’RTA3(下游引物)5’-ATCAAGCAGCGCCAAGACCAT-3’，在引物對RTS3&RTA3引導(dǎo)下，以cDNA作為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物長度預(yù)期為128bp，以基因組DNA作為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物長度預(yù)期為963bp。
檢測內(nèi)標(biāo)基因α-tubulin表達(dá)水平的引物
TS6(上游引物)5’-GAGCATGGCATTCAGGCTGACG-3’TA6(下游引物)5’-TCAACAAAAACAGCACGGGGCA-3’，在引物對TS6&TA6引導(dǎo)下，以cDNA作為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物長度預(yù)期為128bp，以基因組DNA作為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物長度預(yù)期為987bp。
以上述經(jīng)10倍稀釋的cDNA作為模板，分別在引物對RTS3&RTA3和TS6&TA6的引導(dǎo)下進(jìn)行RT-qPCR檢測，PCR反應(yīng)體系為2×SYBR Green I PCR Master Mix(ABI公司)12.5μL，RTS3(或TS6)(10μM)0.5μL，RTA3(或TA6)(10μM)0.5μL，cDNA模板(1∶10稀釋)1μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至25μL。PCR反應(yīng)條件為先50℃2min；然后95℃ 10min；再94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 18s，共40個循環(huán)；最后95℃15s，60℃ 15s，95℃ 15s，1個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果對目的基因ZmCBL4和內(nèi)標(biāo)基因α-tubulin的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度均為128bp，與預(yù)期結(jié)果一致，說明沒有基因組DNA污染。以未處理樣品(0h)為參照樣品，按照2-△△Ct公式(Liyak，K.J.，Schmittgen，T.D.(2001)Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod.Methods 25402-408)計(jì)算ZmCBL4在不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)動態(tài)。結(jié)果表明，在250mM NaCl脅迫下，ZmCBL4在葉片中表達(dá)量迅速下調(diào)，而在根系中表達(dá)量緩慢增加；在20mM LiCl脅迫下，根系中ZmCBL4表達(dá)水平的變化動態(tài)與氯化鈉相似，而在葉片中則是先迅速增加，然后又降低到基礎(chǔ)表達(dá)水平；100μM ABA處理可以使ZmCBL4的表達(dá)迅速上調(diào)，尤其是在根系中的上調(diào)幅度更加明顯，此外在整個處理期間根系和葉片中的上調(diào)幅度均表現(xiàn)出波浪式變化；20％PEG脅迫使ZmCBL4的表達(dá)水平明顯下調(diào)，在葉片中變化更為明顯。ZmCBL4具體的表達(dá)動態(tài)及其在不同時間點(diǎn)的相對變化值見圖3A(ZmCBL4在葉片中的表達(dá)動態(tài))和圖3B(ZmCBL4在葉片中的表達(dá)動態(tài))。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，ZmCBL4在玉米幼苗期有一定的基礎(chǔ)表達(dá)，高鹽、高滲或外源ABA處理會使其表達(dá)模式發(fā)生變化，表明該基因參與玉米幼苗對這些逆境脅迫的應(yīng)答，并有可能在不同的鈣信號途徑中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
二、檢測ZmCBL4基因的組織特異性表達(dá)情況用與步驟一中相同的RT-qPCR法檢測ZmCBL4基因在不同組織和器官中的特異性表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示(1為三葉期的幼根；2為三葉期的幼葉；3為抽雄期的成熟根；4為抽雄期的成熟莖；5為抽雄期的成熟葉；6為抽雄期的雌穗；7為抽雄期的雄穗；8為剛吐出的花絲)，表明ZmCBL4基因在不同組織或器官中的表達(dá)豐度存在明顯差別，其中以抽雄期的成熟葉、莖和雄穗中表達(dá)豐度最低，而在雌穗中最高。如果以抽雄期的成熟葉作為參照樣品，在其它組織或器官中的相對表達(dá)倍數(shù)變動在1.05-10.98之間。此外，ZmCBL4基因的表達(dá)豐度在三葉期的幼根中低于幼葉，而在抽雄期的成熟根中卻是成熟葉中的近3倍，這種組織特異性表達(dá)模式暗示ZmCBL4基因可能在玉米的正常發(fā)育過程中參與對某些信號途徑的調(diào)節(jié)。
實(shí)施例3、ZmCBL4轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及其耐鹽性鑒定一、ZmCBL4轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1、ZmCBL4植物表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)引物SN1和AB1兩端設(shè)計(jì)的NcoI和BstEII酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶NcoI和BstEII對含有ZmCBL4全長cDNA片段載體pGEM-ZmCBL4進(jìn)行雙酶切，回收并純化660bp的ZmCBL4 cDNA片段，將其與經(jīng)同樣酶雙酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301(p3301，澳大利亞CAMBIA公司)載體進(jìn)行連接，使ZmCBL4在CaMV35S啟動子的驅(qū)動之下，然后再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，依次用BamH I進(jìn)行單酶切及Nco I & BstE II雙酶切鑒定，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖5所示(泳道1為BamH I單酶切產(chǎn)物，泳道2為Nco I & BstE II雙酶切產(chǎn)物，泳道M為1kb Marker)，經(jīng)BamH I單酶切可獲得9073bp和844bp的DNA片段，經(jīng)Nco I & BstE II雙酶切可獲得約9257bp和660bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明獲得了插入序列及位置正確的ZmCBL4的植物表達(dá)載體，命名為p3301-ZmCBL4。
2、轉(zhuǎn)化擬南芥取步驟1獲得的質(zhì)粒p3301-ZmCBL4約1μg，將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞(三博公司)，在28℃、YEB固體培養(yǎng)基(含卡那霉素Kan 100μg/mL，利福平Rif 125μg/mL)上培養(yǎng)兩天，然后挑選三個單克隆在引物對SNI&ABI的引導(dǎo)下做菌液PCR鑒定，結(jié)果均擴(kuò)增出674bp的目標(biāo)條帶，表明目的基因ZmCBL4已轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌GV3101中。再將鑒定好的菌液接種于加有卡那霉素Kan 100μg/mL和利福平Rif 125μg/mL抗生素的液體YEB培養(yǎng)基中，在28℃下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8，在4℃、5000rpm離心15min集菌。將菌體沉淀用1×MS大量元素(Murashige and Skoog，1962)加5％蔗糖的滲入緩沖液懸浮，隨后用沾花法轉(zhuǎn)化擬南芥sos3突變體植株(Liu andZhu，1998)和野生型植株。轉(zhuǎn)化后代用0.5‰的ppt(除草劑)結(jié)合PCR方法(引物對SNI&ABI)進(jìn)行篩選和鑒定，以未轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，其中，轉(zhuǎn)基因T1代植株的PCR鑒定結(jié)果如圖6所示(泳道M1kb Marker，泳道1-1010株轉(zhuǎn)基因T1代植株，擴(kuò)增出674bp目標(biāo)條帶；泳道11未轉(zhuǎn)基因陰性對照)，表明轉(zhuǎn)基因植株的基因組中均整合有ZmCBL4的cDNA。
3、ZmCBL4轉(zhuǎn)基因擬南芥的Northern blot檢測用Northern blot方法檢測ZmCBL4在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)情況，包括以下步驟1)用熱酚法提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的總RNA；2)制備變性膠稱取0.72g瓊脂糖，加入43.2mL DEPC處理水，微波爐熔化，待冷卻至約60℃，加入10.8mL甲醛和6mL 10×MOPS，再加入少量EB，混勻后倒膠；3)樣品的制備將20μg總RNA用DEPC處理水補(bǔ)至9μl，依次加入10×MOPS 4μl，甲酰胺20μl，甲醛7μl，混勻，65℃水浴10min，冰浴5min，離心，將溶液收集至管底；4)電泳每份樣品加4μl 10×Loading buffer(上樣緩沖液)上樣，以1×MOPS為電泳緩沖液，先以30V電壓電泳，待樣品離開點(diǎn)樣孔后，加大電壓至50V，電泳5-6h；5)轉(zhuǎn)膜電泳完畢后，用DEPC處理水漂洗凝膠3次，每次15min；切去凝膠多余膠邊，并切一小角以表明方向；將一磁盤加入堿轉(zhuǎn)移液，架上一塊玻璃板，上放4層寬于凝膠的吸水紙，兩頭浸于液體中，濾紙間不能有氣泡；將凝膠點(diǎn)樣孔朝下置于濾紙上，排盡其間氣泡，膠塊四周放好隔水條；將一塊長寬均比凝膠大1mm的尼龍膜(已經(jīng)在堿轉(zhuǎn)移液中均勻浸透，Amersham公司)鋪于膠上，再鋪上四張與膜相同大小的濾紙，排盡其間氣泡；加數(shù)層紙巾，其上壓一塊玻璃板及750g重物，吸印5-6h；將膜取下，用鉛筆做標(biāo)記，在2×SSC(0.3M NaCl，0.03M檸檬酸，pH7.0)中漂洗后放至濾紙上，超凈臺吹干；將膜夾于濾紙和兩塊玻璃之間，于80℃烘0.5-1h，用保鮮膜包裹，4℃保存?zhèn)溆茫?)探針的標(biāo)記、雜交及洗膜方法同實(shí)施例1中的Southern吸印雜交。
結(jié)果共得到擬南芥sos3突變體ZmCBL4轉(zhuǎn)基因T3代純合株系30個，野生型ZmCBL4轉(zhuǎn)基因T3代純合株系20個，分別取其中6個擬南芥sos3突變體ZmCBL4轉(zhuǎn)基因T3代純合株系(SS1、SS13、SS23、SS24、SS28、SS29)和6個野生型ZmCBL4轉(zhuǎn)基因T3代純合株系(SW8、SW9、SW16、SW17、SW18、SW19)用上述方法進(jìn)行Northern blot分析，分別以轉(zhuǎn)化p3301空載體的擬南芥sos3突變體(sos3)和野生型擬南芥(WT)為對照，擬南芥sos3突變體ZmCBL4轉(zhuǎn)基因株系的檢測結(jié)果如圖7A所示(sos3sos3突變體對照；SS1-SS296個轉(zhuǎn)基因株系；rRNA為上樣量的量參)，野生型ZmCBL4轉(zhuǎn)基因株系的檢測結(jié)果如圖7B所示(WT野生型對照；SW8-SW196個轉(zhuǎn)基因株系；rRNA為上樣量的量參)，上述轉(zhuǎn)基因株系均能檢測到ZmCBL4的較強(qiáng)表達(dá)，證明獲得了擬南芥sos3突變體ZmCBL4陽性轉(zhuǎn)基因株系及野生型ZmCBL4陽性轉(zhuǎn)基因株系。
二、轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性鑒定
1、ZmCBL4基因在擬南芥sos3突變體中表達(dá)可以完全恢復(fù)其耐鹽性選擇步驟一中經(jīng)Northern blot檢測ZmCBL4表達(dá)較強(qiáng)的3個sos3突變體T3代ZmCBL4轉(zhuǎn)基因純合株系(SS1、SS13和SS23)，分別用幼苗彎根試驗(yàn)和種子萌發(fā)試驗(yàn)對其進(jìn)行耐鹽性鑒定。幼苗彎根試驗(yàn)方法為將在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)5d齡的幼苗轉(zhuǎn)移到MS(MS固體培養(yǎng)基1升MS基本培養(yǎng)基中加20g蔗糖，10g瓊脂，pH 5.7)、MS添加100-175mM(100、125、150或175mM)NaCl和MS添加10-20mM(10、12、15或20mM)LiCl的三種不同的固體培養(yǎng)基上，根尖朝上垂直放置生長，第12d拍照；種子萌發(fā)試驗(yàn)方法為將轉(zhuǎn)基因植株的種子分別點(diǎn)種于MS、MS添加125-175mM(125、150或175mM)NaCl及MS添加12-20mM(12、15、17或20mM)LiCl的三種不同的固體培養(yǎng)基上，在22℃下萌發(fā)8d(MS)，14d(含125-175mM NaCl的MS)和12d(含12-20mMLiCl的MS)后拍照。以轉(zhuǎn)化p3301空載體的擬南芥sos3突變體(sos3)和野生型擬南芥(WT)為對照。
幼苗彎根試驗(yàn)結(jié)果如圖8A所示(以SS1株系為例)，種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果如圖8B所示(以SS1和SS13株系為例)，在100-175mM氯化鈉脅迫下，ZmCBL4轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性均明顯比對照sos3突變體強(qiáng)而與野生型沒有差別；在10-20mM氯化鋰脅迫下，3個轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性不僅明顯比sos3突變體強(qiáng)，而且也明顯超過野生型對照，證明本發(fā)明的ZmCBL4基因可提高植物的耐鹽性。
2、ZmCBL4基因在擬南芥野生型中表達(dá)可以明顯提高其耐鹽性選擇步驟一中經(jīng)Northern blot檢測ZmCBL4表達(dá)較強(qiáng)的4個擬南芥野生型T3代純合株系(SW16、SW17、SW18及SW19)，對其在種子萌發(fā)和幼苗生長期的耐鹽性進(jìn)行鑒定，以未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥(WT)為對照。鑒定方法為按照常規(guī)方法將種子消毒，分別接種于MS、MS附加125、150或175mM NaCl，以及MS附加12、15、17或20mM LiCl的固體平板培養(yǎng)基上，4℃春化4d，然后移至正常生長條件(22℃，16h光照/d)下培養(yǎng)，水平或垂直放置，觀察記錄種子萌發(fā)和幼苗的生長情況。
其中，在22℃下萌發(fā)10d后在MS附加150mM NaCl，以及MS附加17mM LiCl的固體平板培養(yǎng)基上的SW16、SW17的幼苗生長情況如圖9所示，在普通MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照在種子萌發(fā)和幼苗生長狀況上沒有差別，但在不同濃度氯化鈉或氯化鋰脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)及其幼苗生長狀況均明顯優(yōu)于野生型對照，這種差別在氯化鋰脅迫下尤為突出。以在MS+150mM NaCl培養(yǎng)基上萌發(fā)(以綠子葉展開為標(biāo)準(zhǔn))第5d為例，如圖10A所示，四個轉(zhuǎn)基因株系，即SW16、SW17、SW18及SW19的萌發(fā)率分別為76.10％、76.37％、73.74％和77.42％，而野生型WT為56.76％，相差大約20％；如圖10B所示，在MS+15mM LiCl培養(yǎng)基上萌發(fā)5d后，上述四個轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)率均在70％以上，而野生型WT只有11.24％。在125mM或175mM NaCl，以及12mM或20mM LiCl脅迫下，這種差別依然存在。當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)到150mM時，野生型幼苗生長緩慢，逐漸黃化甚至枯萎，而轉(zhuǎn)基因株系苗色正常，仍能保持較快的生長速度；當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)到175mM時，野生型很難長出真葉并逐漸枯萎，而轉(zhuǎn)基因株系幼苗基本保持綠色，仍能維持一定的生長。在15mM LiCl脅迫下，大部分野生型幼苗逐漸白化死亡，而轉(zhuǎn)基因株系幼苗全部長勢良好；當(dāng)氯化鋰濃度增至17mM時，部分野生型種子雖然能夠萌發(fā)，但絕大部分子葉顏色發(fā)白，不能繼續(xù)生長而枯萎，轉(zhuǎn)基因株系苗色正常，長勢仍然較好；當(dāng)氯化鋰濃度高達(dá)20mM時，野生型的種子幾乎不能萌發(fā)，而轉(zhuǎn)基因株系的種子大部分仍能萌發(fā)，并且至少有30％以上的綠苗。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZmCBL4是AtSOS3/AtCBL4的同源基因，參與植物對鹽脅迫響應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，它不僅是正常野生型植株耐鹽性形成所必需的一個關(guān)鍵基因，而且將其超表達(dá)可以顯著提高種子萌發(fā)期和幼苗生長期的耐鹽性，因此該基因可用于植物耐鹽性的基因工程改良。
序列表<160>4<210>1<211>211<212>PRT<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>1Met Gly Cys Ala Thr Ser Lys Gln Phe Ser Arg Ser Ala Pro Ala His1 5 10 15Ala Asp Pro Ala Val Leu Ala Thr Gln Thr Ser Phe Thr Met Asn Glu20 25 30Val Glu Ala Leu Tyr Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ser Cys Ser Ile Val35 40 45Lys Asp Gly Leu Ile His Lys Glu Glu Phe Gln Leu Ala Leu Phe Arg50 55 60Asn Ser Arg Arg Ala Asn Leu Phe Ala Asp Arg Val Phe Asp Leu Phe65 70 75 80Asp Leu Lys Arg Asn Gly Val Ile Asp Phe Glu Glu Phe Val Arg Ser85 90 95Leu Ser Val Phe His Pro Lys Ala Asp Thr Ser Glu Lys Thr Ala Phe100 105 110Ala Phe Lys Leu Tyr Asp Leu Arg Gly Thr Gly Tyr Ile Glu Lys Glu115 120 125Glu Leu Arg Glu Met Val Leu Ala Leu Leu Asp Glu Ser Asp Leu Cys130 135 140Leu Ser Asp Ser Thr Val Glu Thr Ile Val Asp Asn Thr Phe Ser Gln145 150 155 160Ala Asp Ser Asn Gly Asp Gly Arg Ile Asp Pro Glu Glu Trp Glu Glu165 170 175
Phe Val Lys Arg Asn Pro Ala Thr Leu Arg Asn Met Thr Leu Pro Tyr180 185 190Leu Gln Asp Ile Thr Met Ser Phe Pro Ser Phe Ile Met Arg Ser Glu195 200 205Ala Ser Asp210<210>2<211>636<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>2atgggctgcg cgacgtccaa gcagttcagc aggagcgcgc cggcgcacgc ggatccggcc60gtgctggcga cccagacctc attcacgatg aacgaggtgg aggcgctgta cgagctgtac120aagaagctga gctgctccat cgtcaaagac gggctcatcc acaaggagga gttccagctc180gccttgttca ggaacagcag gagagcgaac ctctttgcag acagggtctt cgatctgttc240gatctcaagc ggaacggagt catcgatttc gaggagttcg tgcggtcgct cagcgtgttc300caccctaaag cagatacgtc ggagaagacg gcgttcgctt tcaagctgta tgatctgagg360gggacaggct acatcgagaa agaagagctg agagagatgg tcttggcgct gcttgatgag420tccgacctct gcctttcaga cagcaccgtc gagacgatcg tcgataacac gttcagccaa480gcggactcga acggagatgg caggatagat cctgaagaat gggaggagtt cgtgaagagg540aacccggcaa cgttaaggaa catgactctc ccctatctgc aggacatcac catgtcattt600ccgagcttca taatgcgttc agaagccagt gactga 636<210>3<211>1994<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>3atgggctgcg cgacgtccaa gcagttcagc aggagcgcgc cggcgcacgc ggatccggcc60
gtgctggcga cccagacctc atgtgagcat ctcacctccc tccctccccc tcacctccgg120caacgacagc gccaattgcg tgacgctgac ccacgtctgc tgcggctgcg gctgttgtgt180tgcttgtgtg gcatggcagt cacgatgaac gaggtggagg cgctgtacga gctgtacaag240aagctgagct gctccatcgt caaagacggg ctcatccaca aggtggggat cgaccgacga300cccatctcgg tacattccct ggtttctgat acttagatcg cgccgctaac gggttggagt360ctgtgctgtg ttggtttggt ctggtcggcc aggaggagtt ccagctcgcc ttgttcagga420acagcaggag agcgaacctc tttgcagaca gggtaagcat ctcgtgctca ttttcgccct480tacaggacac aggaggagga aactcagttc gtgtttcgcc gtcacaggtc ttcgatctgt540tcgatctcaa gcggaacgga gtcatcgatt tcgaggagtt cgtgcggtcg ctcagtgtgt600tccaccctaa agcagatacg tcggagaaga cggcgtgtac gaactgcata cctcaatgtt660cattcatcat cttcttcttc tcgtgcatta ggccatgttt gcaacgaggg attttttctc720tcgctaaaaa tcctgagctt ctcgcgtgaa attcctgtac ggttcggaat ggccacaccg780agaaaggacg gagatgacat gtttgatttg gacttttctc atcctttatg cagtcgcttt840caagctgtat gatctgaggg ggacaggcta catcgagaaa gaagaggtga tccttcatgc900gttctcttgt atattttcca aagaaaaaaa aacaaccaga gcgcatgcca tttaatgact960ggaaaccata gtgtctgtgt gtttttttag ataatggacc aaaatccggc tttcgcctct1020ttcgaagata aggttaagtt cacacaactt gaaacaaata tccaacagct cacaaaaata1080tgacaaaact gtaagcctaa aagagttaat agcttcccta tttctcaccg actcaaactc1140acttaaaaat taatttatta caacccaatc ctgtttgaaa acctccaacc ctgataatca1200aaaaactgca tgaccaccga ctctagatga cgataagctt ttcttaaaag atctgctctt1260tttcactttt ctgtagttgt gcccgtagtc tgagctaatg agtacctttg actagaacct1320gcaaataagt caacatacgt aatttattaa atattaagtc atttatactt ttccaaaaag1380ctcagcacag tgttgagaca catgtaataa tcagattctt agtatttgga tccatcccgt1440caaccaactc ccaaccataa tgcttgtgta cactgcactt gttcgattct aatataaaac1500agtaactttg ttcttgagaa gcagctgaga gagatggtct tggcgctgct tgatgagtcc1560gacctctgcc tttcagacag caccgtcgag acgatcgtcg ataacgtaac tgatacactg1620ctactctccg ctagtcatca ggtgctagtt tgcaaagatc ccgtctccgt tctaactcgt1680atcatatcgt gctgctctgt tcgcgttgga gtgcagacgt tcagccaagc ggactcgaac1740ggagatggca ggatagatcc tgaagaatgg gaggagttcg tgaagaggaa cccggcaacg1800ttaaggaaca tgactctccc ctatctgcag tgcgtagcat agcgtagcgc atgtcctttt1860ctttcctttc ctttccaaat gatctttcct tcaaaaaaaa aagttctgac tacttttgaa1920attactgttg attgttcagg gacatcacca tgtcatttcc gagcttcata atgcgttcag1980
aagccagtga ctga 1994<210>4<211>1417<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>4gcacgaggga cgtggcgcga gagggagagc ggagaggggg gctcaccaaa ctgcaaagtc60tgtctcctga ctcctcgccg gcgtgccgga tctcctgtct ctctcgcggt cggcggccgc120atagcctcgt tcactcgcac gacacagggc aggggggcga tgggctgcgc gacgtccaag180cagttcagca ggagcgcgcc ggcgcacgcg gatccggccg tgctggcgac ccagacctca240ttcacggtga acgaggtgga ggcgctgtac gagctgtaca agaagctgag ttgctccatc300gtcaaagacg ggctcatcca caaggaggag ttccagctcg ccttgttcag gaacagcagg360agagcgaacc tctttgcaga cagggtcttc gatctgttcg atctcaagcg gaacggagtc420atcgatttcg aggagttcgt gcggtcgctc agtgtgttcc accctaaagc agatacgtcg480gagaagacgg cgttcgcttt caagctgtat gatctgaggg ggacaggcta catcgagaaa540gaagagctga gagagatggt cttggcgctg cttgatgagt ccgacctctg cctttcagac600agcaccgtcg agacgatcgt cgataacacg ttcagccaag cggactcgaa cggagatggc660aggatagatc ctgaagaatg ggaggagttc gtgaagaaga acccggcaac gttaaggaac720atgactctcc cctatctgca ggacatcacc atgtcatttc cgagcttcat aatgcgttca780gaagccagtg actgaaatgt ttgcgtacat ctgcgtataa ggaagcaccg ttccatcagc840tctgctgttt gttggagcct acagcttaat ccatggcacg aggcaccgga gaaagttcag900aatgtagcag caacggccag cagagtgcat gagggttgct gccatagctg caggctgcgg960ccaaacaaga tgatgaccaa agattcatct agatgtcagc ttcagggttc agatggtata1020ccaggcaacg attttctttc tcggcatcta aacgccgtgg atgttgcgtt taaaaaattg1080ttgcagagga tcaacaagtc tgttcatcga agcagtgcct gagtttagaa tcataagcta1140actgtctatt gctgagatgc tttcgtctag atcttgcgtc tagttgtaac tgcaaggaaa1200gaataacttg tggagagttg gatttgttga tgaaccttag tagttcttga cttggttagt1260tgttttcaca tttcttcgca gtgccagtgc gtgcacttgt aacttgcaaa ttcttctcaa1320tccaccccta atcgaagggt ggatccagtt ccgcatgtaa tgaggcaata tcatcaatag1380tttatgcttc gtttatcgca aaaaaaaaaa aaaaaaa 141權(quán)利要求
1.來自玉米的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性功能的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中的SEQ ID NO1所示。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因的cDNA序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物耐鹽性功能的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的cDNA序列如序列表中的SEQ ID NO2所示。
5.編碼權(quán)利要求1或2所述玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因的基因組序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有提高植物耐鹽性功能的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
7.一種提高植物耐鹽性的方法，是將權(quán)利要求3或4或5所述玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因或與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，植物耐鹽性獲得提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述玉米鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列通過含有該基因或與該基因具有90％以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為p3301、PER8、PX6、pBI系列載體、pBin系列載體、pCAMBIA系列載體、pUC系列載體或pBluescript系列載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述植物表達(dá)載體為p3301-ZmCBL4。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個來源于玉米的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。其目的是提供一個來源于玉米的鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白及其編碼基因與其在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用。該蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有提高植物耐鹽性功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬望}機(jī)制的研究，以及提高植物的耐鹽性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物的耐鹽基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/55GK101054411SQ20071006526
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月9日
發(fā)明者王國英, 王茅雁, 付俊杰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所