專利名稱：原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。確切地說它是一種原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系
背景技術(shù)：
隨著二十世紀(jì)70年代大腸桿菌基因表達(dá)分子機(jī)制的深入了解，外源目的基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)成為可能，同時，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)也是最早應(yīng)用于基因工程藥物生產(chǎn)。由于大腸桿菌遺傳背景清楚，繁殖快，成本低，表達(dá)量高，易于操作等諸多優(yōu)勢，目前大多數(shù)外源目的基因以及基因工程藥物生產(chǎn)都是由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)?；诳朔竽c桿菌內(nèi)毒素、缺少翻譯后修飾、高表達(dá)時易折疊錯誤而形成包涵體等不足，人們已開發(fā)出了其它多種基因表達(dá)體系，但目前尚不能完全取代大腸桿菌表達(dá)體系。
在大腸桿菌中，許多外源蛋白的高水平表達(dá)最后都會導(dǎo)致包涵體形成，包涵體是致密的不溶性蛋白和RNA的聚集體，含有大部分的表達(dá)蛋白。關(guān)于包涵體的形成有許多理論，眾說紛紜，但一般認(rèn)為，許多蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，并不是自發(fā)地一步折疊形成的，而是在一些輔助蛋白協(xié)助下，經(jīng)過許多中間態(tài)逐步形成的?，F(xiàn)已知的參與新生肽鏈折疊的輔助蛋白有兩類，一類是指那些催化蛋白質(zhì)特定異構(gòu)反應(yīng)的酶，稱為折疊酶，這些異構(gòu)反應(yīng)是某些蛋白質(zhì)折疊的限速步驟。大腸桿菌中研究最多的折疊酶有催化二硫鍵形成的二硫鍵異構(gòu)酶DsbA、DsbB、PDI等；催化脯氨酸異構(gòu)反應(yīng)的蛋白質(zhì)脯氨酸順反異構(gòu)酶PPI等。最近又發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白還原酶TrxB的缺失突變，能增強(qiáng)胞內(nèi)蛋白二硫鍵形成。另一類輔助蛋白能保持未折疊或部分折疊蛋白的短暫穩(wěn)定性，防止分子內(nèi)或分子間不合適的相互作用，但它并不參與任何共價(jià)反應(yīng)，稱為分子伴侶。大腸桿菌的分子伴侶主要有GroES、GroEL、DnaK、DnaJ等。
按照蛋白質(zhì)折疊的理論，體內(nèi)蛋白聚集以致包涵體的形成，起源于肽鏈折疊過程中，部分折疊的中間態(tài)之間的錯誤聚合，而不是形成于成熟的天然態(tài)或完全解鏈的蛋白。包涵體的形成與那些折疊中間態(tài)的溶解性和穩(wěn)定性有關(guān)。除了分子伴侶和折疊酶等，影響包涵體形成的因素還有蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)，生長條件(宿主、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組成、pH等)。
蛋白質(zhì)沉淀形成包涵體有利的一面是可以利用包涵體的不溶性和致密性，通過超聲波破碎，離心就能相對容易的對其進(jìn)行初級純化。此外，以可溶性蛋白形式表達(dá)往往易被蛋白酶降解，以包涵體形式表達(dá)卻可以很穩(wěn)定。純化時可用鹽酸胍或脲變性溶解包涵體中的蛋白質(zhì)。透析除去變性劑后，蛋白質(zhì)可重新折疊復(fù)性，然而這種方法亦有其弊端，經(jīng)變性/復(fù)性后正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量不穩(wěn)定，有時會很低，尤其是表達(dá)產(chǎn)物富含二硫鍵時更顯突出。
防止包涵體形成，最現(xiàn)實(shí)的辦法是改善發(fā)酵條件，從培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件入手。如降低大腸桿菌的生長溫度，以減少肽鏈間疏水表面相互作用，增加折疊成可溶性空間結(jié)構(gòu)的機(jī)會。改變pH值、縮短誘導(dǎo)時間、降低誘導(dǎo)物濃度等，但這類方法多是以犧牲表達(dá)量為代價(jià)。
鑒于大腸桿菌胞內(nèi)折疊組裝能力非常有限，也可采用分泌途徑表達(dá)重組蛋白，包括轉(zhuǎn)運(yùn)(蛋白質(zhì)通過細(xì)菌的內(nèi)膜定位于周質(zhì)空間)、分泌(穿過外膜到達(dá)胞外)。外源蛋白在細(xì)菌周質(zhì)中的定位表達(dá)需要在N端融合一段細(xì)菌蛋白的疏水性信號肽，融合蛋白跨內(nèi)膜后，細(xì)菌的信號肽酶將信號肽切除，因而可獲得具有天然一級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。同時，氧化性的周質(zhì)間隙可以模擬真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境，便于新生肽鏈折疊成天然結(jié)構(gòu)。此外，周質(zhì)間隙中蛋白水解酶較少，可使產(chǎn)物不易被降解，而提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性。胞外分泌避免許多問題如包涵體的形成，同時可使純化較為簡單。但這一系統(tǒng)的缺點(diǎn)是表達(dá)低，此外，信號序列雖不干擾融合蛋白的生物活性，但去除較困難或去除不徹底。
通過替換個別氨基酸，來尋找可生成天然蛋白的突變體，這種方法對一些蛋白的表達(dá)是行之有效的。但在實(shí)踐中則存在兩個問題一是難以預(yù)測哪種氨基酸的替代利于天然蛋白的生成；更重要的是由此產(chǎn)生的突變基因產(chǎn)物，溶解性雖有提高，但是對于蛋白質(zhì)的功能、穩(wěn)定性和藥物學(xué)特性可能會有不良影響。
融合蛋白表達(dá)，是防止包涵體形成的另一胞內(nèi)表達(dá)重要方式。雖然融合蛋白表達(dá)解決了外源基因表達(dá)的很多問題，但是，融合表達(dá)也有其缺點(diǎn)，如果融合蛋白的兩部分互相作用很容易受蛋白酶的水解，融合蛋白部分與基因表達(dá)產(chǎn)物間的斷裂及效率和成本，分離純化去除融合蛋白時的成本等，也使得融合表達(dá)有其局限性。
近年來，為克服包涵體的形成，在表達(dá)外源基因的同時，共表達(dá)分子伴侶或折疊酶或相關(guān)功能蛋白，通常將這些輔助蛋白的基因克隆到相容質(zhì)粒中。相當(dāng)多的嘗試獲得了明顯的成功。例如，共表達(dá)GroES和GroEL可顯著提高D-核酸糖1，5-二磷酸加氧酶/酸化酶的折疊和組裝效率，從而提高可溶性重組蛋白的產(chǎn)量；也能提高可溶性乙酰輔酶A脫氫酶的產(chǎn)量和組裝效率，DnaK的共表達(dá)能減小人生長激素hGH包涵體并提高表達(dá)水平；也能提高可溶性膠原酶的產(chǎn)量。但這方面也有許多問題，其中最主要的是在一個宿主細(xì)胞中很難獲得兩個表達(dá)質(zhì)粒，且其遺傳穩(wěn)定性也不理想。

發(fā)明內(nèi)容
基于外源目的基因在原核細(xì)胞非融合表達(dá)的現(xiàn)狀，尤其是表達(dá)產(chǎn)物富含二硫鍵的包涵體解決，利用大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行基因工程藥物生產(chǎn)時，包涵體變性/復(fù)性生物活性收率低，或?yàn)榻鉀Q可溶性表達(dá)等所引起生產(chǎn)成本提高的現(xiàn)實(shí)問題。本發(fā)明的目的是提供一種原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，它是利用生物技術(shù)，構(gòu)建一個轉(zhuǎn)錄單位，這個轉(zhuǎn)錄單位含有一種或二種具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的輔助蛋白基因，通過表達(dá)的一種或二種輔助蛋白來促進(jìn)該轉(zhuǎn)錄單位的外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)非融合可溶性表達(dá)，而且上述的表達(dá)均在同一個原核宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施和原則來達(dá)到1.設(shè)計(jì)一個原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單位，這個轉(zhuǎn)錄單位的最上游是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，這個區(qū)域用于重組(克隆)欲表達(dá)的各種外源目的基因，其目的是使外源目的基因能夠得以高效表達(dá)。
2.轉(zhuǎn)錄單位的啟動子與終止子是目前大多數(shù)原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，如T7-lac(乳糖)雙啟動子和T7終止子，T7啟動子和終止子，T3啟動子和終止子，SP6啟動子和終止子，乳糖啟動子和終止子等等。
3.獨(dú)立翻譯調(diào)控的特征是通過原核細(xì)胞的rbs(核糖體結(jié)合位點(diǎn))或稱S-D序列以及AUG啟始密碼子調(diào)控外源目的基因的翻譯或特定輔助蛋白基因的翻譯。
4.在具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的多克隆位點(diǎn)區(qū)域后面，是具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的特定輔助蛋白基因區(qū)域。在此區(qū)域后面也可加上具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的另一種特定輔助蛋白基因區(qū)域。通過一種或二種輔助蛋白來促進(jìn)外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)非融合可溶性表達(dá)。
5.所說的特定輔助蛋白是指硫氧還蛋白還原酶TrxA，二硫鍵異構(gòu)酶DsbA、DsbB、PDI，脯氨酸順反異構(gòu)酶PPI，分子伴侶GroES、GroEL、DnaK、DnaJ等蛋白，以及有關(guān)能促進(jìn)翻譯的蛋白正確折疊而使其處于可溶的一類蛋白等。
6.上述原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單位的構(gòu)成順序是轉(zhuǎn)錄啟動子-rbs-AUG翻譯啟始密碼子-多克隆位點(diǎn)-rbs-AUG翻譯啟始密碼子-特定輔助蛋白基因-翻譯終止密碼子-轉(zhuǎn)錄終止子(簡稱轉(zhuǎn)錄單位I)?；蚴寝D(zhuǎn)錄啟動子-rbs-AUG翻譯啟始密碼子-多克隆位點(diǎn)-rbs-翻譯AUG啟始密碼子-特定輔助蛋白基因I-翻譯終止密碼子-rbs-翻譯AUG啟始密碼子-特定輔助蛋白基因II-翻譯終止密碼子-轉(zhuǎn)錄終止子(簡稱轉(zhuǎn)錄單位II)。
7.上述轉(zhuǎn)錄單位I或轉(zhuǎn)錄單位II重組至原核細(xì)胞的克隆質(zhì)粒，該克隆質(zhì)粒本身具備可遺傳特征和抗生素抗性基因(如卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素等)，利用原核宿主細(xì)胞的復(fù)制酶系進(jìn)行自身復(fù)制。含有重組的轉(zhuǎn)錄單位I或轉(zhuǎn)錄單位II的質(zhì)粒即原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，就是本發(fā)明所述的‘原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系’，利用原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯酶系以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)(針對轉(zhuǎn)錄單位的)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄單位I或轉(zhuǎn)錄單位II中各基因的表達(dá)。
8.當(dāng)欲表達(dá)的各種外源目的基因被重組在7.所述的原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，利用原核宿主細(xì)胞的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯酶系，使外源目的基因、一種(轉(zhuǎn)錄單位I)或二種(轉(zhuǎn)錄單位II)輔助蛋白基因分別在同一個宿主細(xì)胞得以共表達(dá)。通過一種或二種輔助蛋白促進(jìn)外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)非融合可溶性表達(dá)。
9.基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)必須具備下列的條件需用原核的啟動子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。此外，需要原核細(xì)胞核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)，rbs與起始密碼子之間的距離對高效表達(dá)是十分重要的，rbs與AUG距離為3～11bp較為合適。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明是將一種特定輔助蛋白基因或二種特定輔助蛋白基因與預(yù)表達(dá)的外源目的基因共建在一個轉(zhuǎn)錄單位中，在同一個原核表達(dá)宿主細(xì)胞，通過特定輔助蛋白基因與預(yù)表達(dá)的外源目的基因各自獨(dú)立翻譯調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行胞內(nèi)共同表達(dá)，利用特定輔助蛋白實(shí)現(xiàn)外源目的基因的非融合可溶性表達(dá)，尤其是含有較多二硫鍵的肽鏈得以非融合可溶性表達(dá)。如80個左右氨基酸殘基組成的含四對二硫鍵的肽鏈，通過本原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，在原核細(xì)胞的一般生理?xiàng)l件下，使其在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量占菌體總蛋白的10％以上，90％以上的表達(dá)產(chǎn)物為可溶性。


圖1是轉(zhuǎn)錄單位I特征概括圖。
圖2是為重組了外源目的基因的轉(zhuǎn)錄單位I特征概括圖。
圖3是轉(zhuǎn)錄單位II特征概括圖。
圖4是為重組了外源目的基因的轉(zhuǎn)錄單位II特征概括圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1，是由T7-lac(乳糖)雙啟動子和T7終止子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄單位。轉(zhuǎn)錄單位的各基因均由原核細(xì)胞SD序列、翻譯啟始密碼子和翻譯終止密碼子分別調(diào)控各基因的翻譯。轉(zhuǎn)錄單位的最上游是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，該區(qū)域是用于重組(克隆)預(yù)表達(dá)的各種外源目的基因，其目的是使外源目的基因能夠得以高效表達(dá)。緊隨著該區(qū)域后面是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的硫氧還蛋白還原酶TrxA基因。構(gòu)建的措施和原則按上述轉(zhuǎn)錄單位I的模式來實(shí)施。轉(zhuǎn)錄單位重組(克隆)至原核細(xì)胞的克隆質(zhì)粒中，利用該原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控區(qū)及原核宿主細(xì)胞的復(fù)制酶系進(jìn)行自身復(fù)制，利用該原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因及其調(diào)控區(qū)進(jìn)行克隆篩選。
表達(dá)的外源目的基因是抗神經(jīng)興奮肽II(anti-neuroexcitation peptideII，ANEP II)，ANEP II由72個氨基酸殘基組成，分子量8268Da，含八個半胱氨酸殘基，形成四對二硫鍵。將ANEP II基因重組在原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，在ANEP II基因前加上AUG啟始密碼子，ANEP II基因的末端加翻譯終止密碼子。獲得的重組pSYPU-1-ANEP II表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核細(xì)胞-大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明ANEP II表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的15％以上，ANEP II主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的90％以上。
實(shí)施例2.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1a的構(gòu)建與pSYPU-1的原理及形式一樣，不同之處是抗生素抗性基因是氨芐青霉素。
表達(dá)的外源目的基因是止痛抗腫瘤肽I(analgesic-antitumoral peptideI，AGAP I)，AGAP I由74個氨基酸殘基組成，分子量7820Da，含八個半胱氨酸殘基，形成四對二硫鍵。將AGAP I基因重組在原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1a的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，在AGAP I基因前加上AUG啟始密碼子，AGAP I表達(dá)的末端加翻譯終止密碼子。獲得的重組pSYPU-1a-AGAP I表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原核細(xì)胞表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明AGAP I表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的15％以上，AGAP I主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的90％以上。
實(shí)施例3.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1b的構(gòu)建與pSYPU-1的原理及形式一樣，不同之處是抗生素抗性基因是氯霉素。
重組pSYPU-1b-ANEP II表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明ANEP II表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的12％以上，ANEP II主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的90％以上。
實(shí)施例4.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1c的構(gòu)建與pSYPU-1的原理及形式一樣，不同之處是抗生素抗性基因是四環(huán)素。
重組pSYPU-1c-ANEP II表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明ANEP II表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的11％以上，ANEP II主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的90％以上。
實(shí)施例5.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-2，是由T7啟動子和T7終止子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄單位。轉(zhuǎn)錄單位的各基因均由原核細(xì)胞SD序列、翻譯啟始密碼子和翻譯終止密碼子分別調(diào)控各基因的翻譯。轉(zhuǎn)錄單位的最上游是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，該區(qū)域是用于重組(克隆)預(yù)表達(dá)的各種外源目的基因，其目的是使外源目的基因能夠得以高效表達(dá)。緊隨著該區(qū)域后面是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的硫氧還蛋白還原酶TrxA基因。構(gòu)建的措施和原則按上述轉(zhuǎn)錄單位I的模式來實(shí)施。轉(zhuǎn)錄單位重組(克隆)至原核細(xì)胞的克隆質(zhì)粒中，利用該原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控區(qū)及原核宿主細(xì)胞的復(fù)制酶系進(jìn)行自身復(fù)制，利用該原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的抗生素抗性基因(卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素抗性基因)及其調(diào)控區(qū)進(jìn)行克隆篩選。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒分別相應(yīng)的是pSYPU-2、pSYPU-2a、pSYPU-2b、pSYPU-2c。
AGAP I基因分別克隆于原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-2、pSYPU-2a、pSYPU-2b、pSYPU-2c，重組了AGATP I基因的上述表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明AGAP I表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的12％以上，AGAP I主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的90％以上。
實(shí)施例6.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-11，是在實(shí)施例1.原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1的基礎(chǔ)上，由二種輔助蛋白促進(jìn)外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)非融合可溶性表達(dá)。
pSYPU-11由T7-lac雙啟動子和T7終止子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄單位的各基因均由原核細(xì)胞SD序列、翻譯啟始密碼子和翻譯終止密碼子分別調(diào)控各基因的翻譯。轉(zhuǎn)錄單位的最上游是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，該區(qū)域是用于重組(克隆)預(yù)表達(dá)的各種外源目的基因，其目的是使外源目的基因能夠得以高效表達(dá)。緊隨著該區(qū)域后面是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的硫氧還蛋白還原酶TrxA基因。緊隨著具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的硫氧還蛋白還原酶TrxA基因的后面，是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的另一個特定輔助蛋白基因-分子伴侶GroEL。構(gòu)建的措施和原則按上述轉(zhuǎn)錄單位II的模式來實(shí)施。轉(zhuǎn)錄單位重組(克隆)至原核細(xì)胞的克隆質(zhì)粒中，利用該原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控區(qū)及原核宿主細(xì)胞的復(fù)制酶系進(jìn)行自身復(fù)制，利用該原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因及其調(diào)控區(qū)進(jìn)行克隆篩選。
表達(dá)的外源目的基因是ANEP II。將ANEP II基因重組在原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-11的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，在ANEP II基因前加上AUG啟始密碼子，ANEPII基因的末端加翻譯終止密碼子。獲得的重組pSYPU-11-ANEP II表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明ANEPII表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的12％以上，ANEP II主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的95％以上。
實(shí)施例7.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，將原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-11中的卡那霉素抗生素抗性基因卡那霉素，分別由氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素抗性基因替代，則分別得到原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-11a、pSYPU-11b、pSYPU-11c。
AGATP I基因分別克隆于原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-11a、pSYPU-11b、pSYPU-11c，重組了AGATP I基因的上述表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明AGATP I表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的11％以上，AGATP I主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的95％以上。
實(shí)施例8.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-12是由T7啟動子和T7終止子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄單位，該轉(zhuǎn)錄單位的的各基因組成與pSYPU-11系列一樣。
將原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-12中的卡那霉素抗生素抗性基因卡那霉素，分別由氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素抗性基因替代，則分別得到原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-12a、pSYPU-12b、pSYPU-12c。
AGAP I基因分別克隆于原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-12、pSYPU-12a、pSYPU-12b、pSYPU-12c，重組了AGATP I基因的上述表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE 3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分嚴(yán)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明AGATP I表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的10％以上，AGAP I主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的95％以上。
實(shí)施例9.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-21，是在實(shí)施例6.原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-11的基礎(chǔ)上，由二種輔助蛋白促進(jìn)外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)非融合可溶性表達(dá)。
pSYPU-21由T7-1ac雙啟動子和T7終止子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄單位的各基因均由原核細(xì)胞SD序列、翻譯啟始密碼子和翻譯終止密碼子分別調(diào)控各基因的翻譯。轉(zhuǎn)錄單位的最上游是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，該區(qū)域是用于重組(克隆)預(yù)表達(dá)的各種外源目的基因，其目的是使外源目的基因能夠得以高效表達(dá)。緊隨著該區(qū)域后面是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的硫氧還蛋白還原酶TrxA基因。緊隨著具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的硫氧還蛋白還原酶TrxA基因的后面，是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控的另一個特定輔助蛋白基因-分子伴侶DnaK。構(gòu)建的措施和原則按上述轉(zhuǎn)錄單位II的模式來實(shí)施。轉(zhuǎn)錄單位重組(克隆)至原核細(xì)胞的克隆質(zhì)粒中，利用該原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控區(qū)及原核宿主細(xì)胞的復(fù)制酶系進(jìn)行自身復(fù)制，利用該原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的卡那霉素抗性基因及其調(diào)控區(qū)進(jìn)行克隆篩選。
表達(dá)的外源目的基因是ANEP II。將ANEP II基因重組在原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-21的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，在ANEP II基因前加上AUG啟始密碼子，ANEPII表達(dá)的末端加翻譯終止密碼子。獲得的重組pSYPU-11-ANEP II表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明ANEPII表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的11％以上，ANEP II主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的95％以上。
實(shí)施例10.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，將原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-21中的卡那霉素抗生素抗性基因卡那霉素，分別由氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素抗性基因替代，則分別得到原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-21a、pSYPU-21b、pSYPU-21c。
AGAP I基因分別克隆于原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-21a、pSYPU-21b、pSYPU-21c，重組了AGAP I基因的上述表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明AGATP I表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的11％以上，AGAP I主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的95％以上。
實(shí)施例11.
按上述本發(fā)明目的的措施和原則，原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-22是由T7啟動子和T7終止子調(diào)控的轉(zhuǎn)錄單位，該轉(zhuǎn)錄單位的的各基因組成與pSYPU-21系列一樣。
將原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-22中的卡那霉素抗生素抗性基因卡那霉素，分別由氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素抗性基因替代，則分別得到原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-22a、pSYPU-22b、pSYPU-22c。
AGAP I基因分別克隆于原核細(xì)胞非融合表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-22、pSYPU-22a、pSYPU-22b、pSYPU-22c，重組了AGAP I基因的上述表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(37℃培養(yǎng)誘導(dǎo)3小時)后收集菌體并超聲裂菌，離心獲得上清和沉淀兩部分產(chǎn)物。菌體裂解液及超聲上清液、沉淀用小分子Tricine-SDS-PAGE分析。利用成像系統(tǒng)分析表明AGA0 I表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的10％以上，AGAPI主要存在于超聲裂菌上清液部分，占其總表達(dá)量的95％以上。
權(quán)利要求
1.原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于在一個原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄單位的啟動子與終止子是目前原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，T7-乳糖雙啟動子和T7終止子；T7啟動子和終止子；T3啟動子和終止子；SP6啟動子和終止子；乳糖啟動子和終止子；這個轉(zhuǎn)錄單位的最上游是一個具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，這個多克隆位點(diǎn)區(qū)域用于重組欲表達(dá)的各種外源目的基因，其目的是使外源目的基因能夠得以高效表達(dá)；獨(dú)立翻譯調(diào)控的特征是通過原核細(xì)胞的rbs，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，或稱S-D序列以及AUG啟始密碼子調(diào)控外源目的基因的翻譯或特定輔助蛋白基因的翻譯；在具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的多克隆位點(diǎn)區(qū)域后面，是具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的特定輔助蛋白基因區(qū)域，在此區(qū)域后面也可加上具有獨(dú)立翻譯調(diào)控特征的另一種特定輔助蛋白基因區(qū)域；上述原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單位的構(gòu)成順序是，轉(zhuǎn)錄啟動子-rbs-AUG翻譯啟始密碼子-多克隆位點(diǎn)-rbs-AUG翻譯啟始密碼子-特定輔助蛋白基因-翻譯終止密碼子-轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱轉(zhuǎn)錄單位I，rbs與AUG距離為3～11bp；或是，轉(zhuǎn)錄啟動子-rbs-AUG翻譯啟始密碼子-多克隆位點(diǎn)-rbs-翻譯AUG啟始密碼子-第一種特定輔助蛋白基因-翻譯終止密碼子-rbs-翻譯AUG啟始密碼子-第二種特定輔助蛋白基因-翻譯終止密碼子-翻譯終止密碼子-轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱轉(zhuǎn)錄單位II，rbs與AUG距離為3～11bp；特定輔助蛋白是指能促進(jìn)外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)非融合可溶性表達(dá)的一類蛋白，硫氧還蛋白還原酶TrxA，二硫鍵異構(gòu)酶DsbA、DsbB、PDI，脯氨酸順反異構(gòu)酶PPI，分子伴侶GroES、GroEL、DnaK、DnaJ以及有關(guān)能促進(jìn)翻譯的蛋白正確折疊而使其處于可溶的一類蛋白相關(guān)蛋白；轉(zhuǎn)錄單位I或轉(zhuǎn)錄單位II重組至一般性原核細(xì)胞的克隆質(zhì)粒，該質(zhì)粒本身具備可遺傳特征和抗生素抗性基因，卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素，利用原核宿主細(xì)胞的復(fù)制酶系進(jìn)行自身復(fù)制，含有重組的轉(zhuǎn)錄單位I或轉(zhuǎn)錄單位II的質(zhì)粒就是原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，利用原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯酶系以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)針對轉(zhuǎn)錄單位的，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄單位I或轉(zhuǎn)錄單位II中各基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位I的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T7-乳糖雙啟動子和T7終止子，特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，將此轉(zhuǎn)錄單位I克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，就是原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1系列，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨芐青霉素或氯霉素或四環(huán)素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-1或、pSYPU-1a或、pSYPU-1b或、pSYPU-1c。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位I的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T7啟動子和T7終止子，特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，將此轉(zhuǎn)錄單位I克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，就是原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-1系列，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨芐青霉素或氯霉素或四環(huán)素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-2或、pSYPU-2a或、pSYPU-2b或、pSYPU-2c。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位I的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T3啟動子和T3終止子，特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，將此轉(zhuǎn)錄單位I克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，就是原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-3系列，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨芐青霉素或氯霉素或四環(huán)素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-3、或pSYPU-3a、或pSYPU-3b、或pSYPU-3c。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位I的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是乳糖啟動子和終止子，特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，將此轉(zhuǎn)錄單位I克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，就是原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-4系列，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨芐青霉素或氯霉素或四環(huán)素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-4、或pSYPU-4a、或pSYPU-4b、或pSYPU-4c。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位I的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是SP6啟動子和終止子，特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，將此轉(zhuǎn)錄單位I克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，就是原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)質(zhì)粒pSYPU-5系列，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨芐青霉素或氯霉素或四環(huán)素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-5、或pSYPU-5a、或pSYPU-5b、或pSYPU-5c。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位I的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T7-乳糖雙啟動子和T7終止子或T7啟動子和終止子或T3啟動子和終止子或乳糖啟動子和終止子或SP6啟動子和終止子或原核細(xì)胞其他的啟動子和終止子或上述啟動子和終止子的自由組合，特定輔助蛋白基因是分子伴侶GroEL或二硫鍵異構(gòu)酶DsbA或DsbB或PDI或脯氨酸順反異構(gòu)酶PPI或分子伴侶GroES或DnaK或DnaJ或有關(guān)能促進(jìn)翻譯的蛋白正確折疊而使其處于可溶的一類蛋白，將此轉(zhuǎn)錄單位I克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的抗生素抗性基因是卡那霉素、或氨芐青霉素、或氯霉素、或四環(huán)素抗性基因，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是相應(yīng)系列的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位II的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T7-乳糖雙啟動子和T7終止子，第一種特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，第二種特定輔助蛋白基因是分子伴侶GroEL，將此轉(zhuǎn)錄單位II克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-11，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是氨芐青霉素、或氯霉素、或四環(huán)素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-11a或、pSYPU-11b或、pSYPU-11c。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位II的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T7啟動子和終止子或T3啟動子和終止子或乳糖啟動子和終止子或SP6啟動子和終止子，第一種特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，第二種特定輔助蛋白基因是分子伴侶GroEL，將此轉(zhuǎn)錄單位II克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的抗生素抗性基因是卡那霉素、或氨芐青霉素、或氯霉素、或四環(huán)素抗性基因，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是相應(yīng)系列的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位II的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T7-乳糖雙啟動子和T7終止子，第一種特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，第二種特定輔助蛋白基因是分子伴侶DnaK，將此轉(zhuǎn)錄單位II克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是卡那霉素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-21，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中的抗生素抗性基因是氨芐青霉素、或氯霉素、或四環(huán)素，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是pSYPU-21a或、pSYPU-21b或、pSYPU-21c。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或1 0所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位II的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T7啟動子和終止子或T3啟動子和終止子或乳糖啟動子和終止子或SP6啟動子和終止子，第一種特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA基因，第二種特定輔助蛋白基因是分子伴侶DnaK，將此轉(zhuǎn)錄單位II克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨芐青霉素或氯霉素或四環(huán)素抗性基因，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是相應(yīng)系列的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11所述的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，其特征在于轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)是T7-乳糖雙啟動子和T7終止子或T7啟動子和終止子或T3啟動子和終止子或乳糖啟動子和終止子或SP6啟動子和終止子或原核細(xì)胞其他的啟動子和終止子或上述啟動子和終止子的自由組合，第一種和第二種特定輔助蛋白基因是硫氧還蛋白還原酶TrxA或二硫鍵異構(gòu)酶DsbADsbB或PDI或脯氨酸順反異構(gòu)酶PPI或分子伴侶GroES或GroEL或DnaK或DnaJ或有關(guān)能促進(jìn)翻譯的蛋白正確折疊而使其處于可溶的一類蛋白，但所述的第一種和第二種特定輔助蛋白在一個轉(zhuǎn)錄單位中不能是一樣的，將上述轉(zhuǎn)錄單位克隆至一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒中，一般性的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒的抗生素抗性基因是卡那霉素或氨芐青霉素或氯霉素或四環(huán)素抗性基因，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒就是相應(yīng)系列的原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系。
全文摘要
本發(fā)明是一種原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，它是將一種特定輔助蛋白基因或二種特定輔助蛋白基因與預(yù)表達(dá)的外源目的基因共建在一個轉(zhuǎn)錄單位中，在同一個原核表達(dá)宿主細(xì)胞，通過特定輔助蛋白基因與預(yù)表達(dá)的外源目的基因各自獨(dú)立翻譯調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行胞內(nèi)共同表達(dá)，利用特定輔助蛋白實(shí)現(xiàn)外源目的基因的非融合可溶性表達(dá)，尤其是含有較多二硫鍵的肽鏈得以非融合可溶性表達(dá)。如80個左右氨基酸殘基組成的含四對二硫鍵的肽鏈，通過本原核細(xì)胞非融合可溶性表達(dá)體系，在原核細(xì)胞的一般生理?xiàng)l件下，使其在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量占菌體總蛋白的10％以上，90％以上的表達(dá)產(chǎn)物為可溶性。
文檔編號C12N15/74GK101016552SQ200710006608
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月16日
發(fā)明者張景海, 劉巖峰, 吳春福 申請人:沈陽藥科大學(xué)