專利名稱：診斷胰癌的方法
專利說明診斷胰癌的方法 發(fā)明領域 本發(fā)明提供了診斷胰癌的方法。

背景技術：
胰癌是一種致死疾病，它在美國的死亡率是每年超過27,000人。Lillemoe等(2000)。約85％診斷出該病的患者具有該疾病超出胰的轉移或擴散，且通過外科手術切除幾乎不可能治愈。如果較早發(fā)現(xiàn)生長，可以在具有好得多的治愈希望下切除。僅20％的腫瘤是可切除的，批準的化療方案的存活益處相當差，且治愈機會通常是25％或更小。Kroep等(1999)；Wiesenauer等(2003)；Ros等(2001)；Ryu等(2002)；和Ito等(2001)。早期診斷對于較早的成功治療是必需的。
盡管診斷成像方法如超聲波檢查(US)、內鏡超聲波檢查(EUS)、雙相(dualphase)螺旋計算機X線斷層攝影術(CT)、磁共振成像(MRT)、內窺鏡下逆行性膽管胰造影術(ERCP)和經(jīng)皮膚的或EUS-引導的細針抽吸(FNA)取得了進展，但由于放射性和成像特征的相似性和缺少胰癌的特異性臨床癥狀，難以區(qū)分胰癌和良性胰疾病、尤其慢性胰腺炎。
已經(jīng)將相當大努力指向開發(fā)用于早期診斷胰癌的工具。盡管如此，確定性診斷經(jīng)常依賴于在疾病已經(jīng)進展過早期治療可以實現(xiàn)的點后不可避免地進行的探查外科手術。20060029987。
外分泌胰的腫瘤可以源自導管、腺泡和基質細胞。80％的胰癌是源自導管上皮。60％這樣的腫瘤位于胰的頭部，10％在尾部，且30％位于胰體內或是彌散性的。Warshau等(1992)。在組織學上，這些腫瘤是分級和分化的，適度分化的和不良分化的。有些腫瘤分類成腺鱗的(adenosquamous)、粘蛋白的、未分化的或含有成骨細胞-樣巨大細胞的未分化的。Gibson等(1978)。
已經(jīng)闡述了與胰癌有關的各種基因表達概況和遺傳標記。20050009067；20040219572；和20030212264。
附圖簡述

圖1描述了顯示一組組織中的2個基因的強度的微陣列數(shù)據(jù)。(A)前列腺干細胞抗原(PSCA)。(B)凝固因子V(F5)。條線圖在y-軸上顯示了強度，且在x-軸上顯示了組織。Panc Ca，胰癌；Panc N，正常胰。
圖2描述了從Agilent生物分析儀得到的電泳圖譜。使用3小時(A)或16小時(B)蛋白酶K消化，從FFPE組織分離RNA。樣品C22(紅色)是1年齡塊，而樣品C23(藍色)是5年齡塊。大小梯顯示為綠色。
圖3描述了從3種不同qRTPCR方法得到的Ct值的對比在反轉錄中的隨機六聚體引發(fā)，隨后用得到的cDNA進行qPCR(RH 2步驟)，在反轉錄中基因-特異性的(反向引物)引發(fā)，隨后用得到的cDNA進行qPCR(GSP 2步驟)，或在單步反應中基因-特異性的引發(fā)和qRTPCR(GSP1步驟)。將來自11個樣品的RNA分入3種方法中，且測量3個基因的RNA水平β-肌動蛋白(A)、HUMSPB(B)和TTF(C)。用實線指示用每種方法得到的中值Ct值。
圖4描述了測定最優(yōu)化。(A和B)從Agilent生物分析儀得到的電泳圖譜。使用3小時(A)或16小時(B)蛋白酶K消化，從FFPE組織分離RNA。樣品C22(紅色)是1年齡塊，而樣品C23(藍色)是5年齡塊。大小梯顯示為綠色。(C和D)從3種不同qRTPCR方法得到的Ct值的對比在反轉錄中的隨機六聚體引發(fā)，隨后用得到的cDNA進行qPCR(RH2步驟)，在反轉錄中基因-特異性的(反向引物)引發(fā)，隨后用得到的cDNA進行qPCR(GSP 2步驟)，或在單步反應中基因-特異性的引發(fā)和qRTPCR(GSP 1步驟)。將來自11個樣品的RNA分入3種方法中，且測量2個基因的RNA水平β-肌動蛋白(C)、HUMSPB(D)。用實線指示用每種方法得到的中值Ct值。
圖5是顯示10個標記組在239個樣品之間的相對表達水平的熱圖(heatmap)。紅色指示更高的表達。
詳細描述 生物標記是指示的標記基因的表達水平的任何標記。該標記可以是直接的或間接的，且可以測量在給定生理參數(shù)下，且與內部對照、正常組織或另一種癌相比，該基因的超表達或表達不足。生物標記包括但不限于，核酸(超表達和表達不足，且直接的和間接的)。使用核酸作為生物標記，可以包括本領域已知的任何方法，包括但不限于，測量DNA擴增、RNA、微RNA、雜合性丟失(LOH)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs，Brookes(1999))、微衛(wèi)星DNA、DNA甲基化不足或過度甲基化。使用蛋白作為生物標記，可以包括本領域已知的任何方法，包括但不限于，測量量，活性，修飾如糖基化、磷酸化、ADP-核糖基化、遍在蛋白化等，免疫組織化學(IHC)。其它生物標記包括成像、細胞計數(shù)和細胞凋亡標記。
本文提供的指示的基因是與特定腫瘤或組織類型相關的那些基因。標記基因可以與許多癌癥類型相關，但是前提是，該基因的表達與使用本文所述算法鑒定為對特定起源是特異性的一種腫瘤或組織類型充分相關，該基因可以用于要求保護的發(fā)明中，以確定原發(fā)起源不明癌(CUP)的起源組織。本領域已知許多與一種或多種癌癥相關的基因。本發(fā)明提供了優(yōu)選的標記基因和甚至更優(yōu)選的標記基因組合。它們在本文中予以詳述。
如在“起源組織”中提及的“起源”是指組織類型(肺、結腸等)或組織學類型(腺癌、鱗狀細胞癌等)，這取決于特定醫(yī)學環(huán)境，且能被本領域技術人員所理解。
當標記基因含有SEQ ID NO指定的序列時，它與該序列相對應。當基因區(qū)段或片段含有足以辨別它是該基因的序列的參照序列或它的互補體的部分時，它與這樣的基因的序列相對應。當它的RNA、mRNA或cDNA與具有這樣的序列(例如探針)的組合物雜交時，或者，在肽或蛋白的情況下，它由這樣的mRNA編碼時，基因表達產物與這樣的序列相對應。當它含有足以辨別它是該基因或基因表達產物的序列的參照基因表達產物或它的互補體的部分時，基因表達產物的區(qū)段或片段與這樣的基因或基因表達產物的序列相對應。
本說明書中所述的和要求保護的本發(fā)明的方法、組合物、物品和試劑盒，包括一個或多個標記基因?！皹擞洝被颉皹擞浕颉痹谪灤┍菊f明書中用于指與任何基因相對應的基因和基因表達產物，且其超表達或表達不足與腫瘤或組織類型相關。在表1和15中更詳細地描述了優(yōu)選的標記基因。
表1 CUP組 本發(fā)明提供了診斷胰癌的方法。本發(fā)明因而提供了如下確定治療方向的方法，其中足夠早地鑒別出胰癌來避免切除，從而允許化療方案。
本發(fā)明另外提供了組合物，其含有選自SEQ ID NO39-41和43-45的至少一個分離的序列。本發(fā)明另外提供了試劑盒，其用于進行根據(jù)本文提供的方法的測定，且另外含有生物標記檢測試劑。
本發(fā)明另外提供了如下測量基因表達的方法，其中生成SEQ IDNO42和46的擴增子來測定基因表達，并對比這些擴增子中的至少一個與正常組織基因表達的水平，以診斷胰癌。
本發(fā)明另外提供了用于進行本文所述方法的微陣列或基因芯片。
本發(fā)明另外提供了診斷/預后組合(portfolio)，其包含本文所述基因組合的分離的核酸序列、它們的互補體、或其部分，其中所述組合足以測量或表征生物樣品中的基因表達，與來自不同癌或正常組織的細胞相比，所述生物樣品具有轉移細胞。
本發(fā)明所述的任意方法還可以包括，測量在樣品中組成型表達的至少一個基因的表達。
優(yōu)選地，胰癌的標記是凝固因子V(F5)、前列腺干細胞抗原(PSCA)、整聯(lián)蛋白、β6(ITGB6)、激肽釋放酶10(KLK10)、密蛋白18(CLDN18)、三件套蛋白同工型(trio isoform)(TR10)和類似于FK506結合蛋白的推定蛋白FLJ22041(FKBP10)。優(yōu)選地，一起測量F5和PSCA的生物標記。除了F5和/或PSCA之外，或作為替代，可以測量ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10和FKBP10的生物標記。F5描述在例如20040076955；20040005563；和WO2004031412中。PSCA描述在例如WO 1998040403；20030232350；和WO2004063355中。ITGB6描述在例如WO2004018999；和6339148中。KLK10描述在例如WO2004077060；和20030235820中。CLDN18描述在例如WO2004063355；和WO2005005601中。TR10描述在例如20020055627中。FKBP10描述在例如WO2000055320中。
本發(fā)明另外提供了如下提供預后的方法根據(jù)本文所述方法確定胰癌的存在，和鑒別其對應預后。
本發(fā)明另外提供了發(fā)現(xiàn)生物標記的方法，其包含，測定特定轉移灶中標記基因的表達水平，測量標記基因的生物標記，以確定其表達，根據(jù)本文所述方法分析標記基因的表達，并確定所述標記基因是否對胰癌是有效特異性的。
本發(fā)明另外提供了組合物，其包含選自SEQ ID NO39-46的至少一個分離的序列。
本發(fā)明另外提供了用于進行本文所述測定的試劑盒、物品、微陣列或基因芯片、診斷/預后組合，和報告通過本發(fā)明方法得到的結果的患者報告。
已僅僅罕見地發(fā)現(xiàn)，僅僅特定核酸序列在組織樣品中的存在或不存在，就具有診斷或預后價值。另一方面，關于各種蛋白、肽或mRNA的表達的信息，日益顯得重要。僅僅具有表達蛋白、肽或mRNA的潛力的核酸序列(這樣的序列稱作“基因”)在基因組中的存在本身，不能確定蛋白、肽或mRNA是否在給定細胞中表達。能表達蛋白、肽或mRNA的給定基因是否表達，且在什么程度發(fā)生這樣的表達，如果發(fā)生的話，由許多復雜因素決定。不考慮理解和評價這些因素的困難，測定基因表達可以提供關于重要事件的發(fā)生的有用信息，所述重要事件例如腫瘤發(fā)生、轉移、細胞凋亡和其它臨床上相關的現(xiàn)象。在基因表達概況中，可以發(fā)現(xiàn)關于基因有活性或無活性程度的相關指示。本發(fā)明的基因表達概況用于為CUP提供診斷和治療患者。
在上述方法中，所述樣品可以通過本領域已知的任意方法制備，包括但不限于，大組織制劑和激光捕獲顯微解剖。大組織制劑可以從例如活組織檢查或外科手術樣品得到。
在上述方法中，所述基因表達測量也可以包括，測量在樣品中組成型表達的至少一個基因的表達水平。
在上述方法中，特異性優(yōu)選地是至少約40％，且靈敏度是至少約80％。
在上述方法中，樣品中相對于良性細胞或正常組織的預定截止水平是至少約1.5-倍超表達或表達不足。
在上述方法中，相對于良性細胞或正常組織，具有轉移細胞的樣品中的預定截止水平具有至少統(tǒng)計學顯著的p-值超表達，優(yōu)選地p-值小于0.05。
在上述方法中，基因表達可以通過本領域已知的任意方法測量，包括但不限于，微陣列或基因芯片，通過聚合酶鏈反應(PCR)例如反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行的核酸擴增，測量或檢測由基因編碼的蛋白，例如通過對蛋白特異性的抗體，或測量基因的特征，例如DNA擴增、甲基化、突變和等位基因變異。微陣列可以是，例如，cDNA陣列或寡核苷酸陣列。所有這些方法且可以另外含有一種或多種內部對照試劑。
本發(fā)明提供了如下生成胰癌預后患者報告的方法，其中確定本文所述任一種方法的結果，且制備展示該結果的報告，和由此生成的患者報告。報告還可以含有患者結果的評估和/或與患者群體有關的危險概率。
樣品制備需要收集患者樣品。在本發(fā)明的方法中使用的患者樣品是被懷疑含有患病細胞的樣品，所述患病細胞例如在組織細針抽吸(FNA)中從小結獲得的細胞。從活組織檢查或外科手術樣品和激光捕獲顯微解剖得到的大組織制劑也適用。激光捕獲顯微解剖(LCM)技術是一種選擇要研究的細胞的方式，它使由細胞類型不均勻性造成的變異性最小化。結果，可以容易地檢測出正常或良性和癌細胞之間的標記基因表達的中等或小變化。樣品也可以包含從外周血提取的循環(huán)上皮細胞。這些可以根據(jù)許多方法得到，但是最優(yōu)選的方法是，6136182所述的磁分離技術。一旦已得到含有目標細胞的樣品，就使用適當組合中的基因的生物標記獲取基因表達概況。
確立基因表達概況的優(yōu)選方法包括，測定由可以編碼蛋白或肽的基因產生的RNA的量。這可以通過下述方法實現(xiàn)反轉錄酶PCR(RT-PCR)、競爭RT-PCR、實時RT-PCR、差示RT-PCR、RNA印跡分析和其它相關試驗。盡管可能使用單個的PCR反應進行這些技術，但最好擴增從mRNA產生的互補DNA(cDNA)或互補RNA(cRNA)，并通過微陣列分析它。許多不同的陣列構型和它們的生產方法是本領域技術人員已知的，且記載在例如5445934；5532128；5556752；5242974；5384261；5405783；5412087；5424186；5429807；5436327；5472672；5527681；5529756；5545531；5554501；5561071；5571639；5593839；5599695；5624711；5658734；和5700637中。
微陣列技術允許同時測量數(shù)千個基因的穩(wěn)態(tài)mRNA水平，從而為鑒定如不受控制的細胞增殖的開始、停滯或調節(jié)的作用提供強有力的工具。目前廣泛使用兩種微陣列技術，第一種是cDNA陣列，且第二種是寡核苷酸陣列。雖然這些芯片存在構造差異，但是基本上所有的下游數(shù)據(jù)分析和輸出是相同的。這些分析的結果，一般是從用于檢測與微陣列中已知位置的核酸序列雜交的樣品中的cDNA序列的標記探針接收的信號強度的測量值。通常，信號強度與在樣品細胞中表達的cDNA以及因此mRNA的量成比例。大量的這種技術是可以獲得和有用的。確定基因表達的優(yōu)選的方法可參見，6271002；6218122；6218114；和6004755。
可以通過比較所述信號強度來分析表達水平。這最好通過生成試驗樣品與對照樣品中基因表達強度的比率矩陣來進行。例如，可以把患病組織的基因表達強度，與從相同類型的良性或正常組織中產生的表達強度進行比較。這些表達強度的比率顯示了試驗樣品與對照樣品之間在基因表達中的倍數(shù)改變。
選擇可以基于統(tǒng)計學檢驗，所述統(tǒng)計學檢驗產生與腫瘤原始起源部位相關因子之間的每個基因的差別表達的顯著性證據(jù)有關的排序表。這樣的檢驗的實例包括ANOVA和Kruskal-Wallis。排序可以用作模型中的權重，所述模型設計用于將這些加權的總和、最高達截止值解釋為有利于一類的證據(jù)勝過另一類。文獻所述的以前證據(jù)也可以用于調節(jié)權重。
優(yōu)選實施方案是，通過鑒別穩(wěn)定的對照集合，和將該集合換算至所有樣品間零方差，標準化每個測量值。該對照集合定義為任意單個內源轉錄物，或內源轉錄物的集合，其受測定中的系統(tǒng)誤差影響，且不清楚其獨立于該誤差而變化。用樣品特異性的因子調節(jié)所有標記，所述因子對于對照集合(例如平均值或中值)的任意描述性統(tǒng)計或對于直接測量產生零方差。或者，如果僅與系統(tǒng)誤差有關的對照變化的前提不成立，然而進行標準化時產生的分類誤差更小，對照集合將仍然按照所述使用。非內源峰值(spike)對照也是有用的，但不是優(yōu)選的。
基因表達概況也可用很多方式展示。最常用的是將原始熒光強度或比率矩陣排列為樹形圖，其中的列表示試驗樣品，且行表示基因。這樣排列數(shù)據(jù)，以便具有相似表達概況的基因彼此接近。每個基因的表達比用顏色顯示。例如，小于1的比率(下調)出現(xiàn)在譜的藍色部分，而大于1的比率(上調)出現(xiàn)在譜的紅色部分。商業(yè)化的計算機軟件程序可用于展示這種數(shù)據(jù)，包括“GeneSpring”(Silicon Genetics，Inc.)和“Discovery”以及“Infer”(Partek，Inc.)。
在測量蛋白水平以確定基因表達的情況下，本領域已知的任何方法都是適用的，前提是它導致充分的特異性和靈敏性。例如，通過結合對蛋白特異性的抗體或抗體片段，并測量抗體-結合的蛋白的量，可以測量蛋白水平?？梢杂梅派湫缘摹晒獾幕蚱渌蓹z測的試劑標記抗體，以促進檢測。檢測的方法包括但不限于，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和免疫印跡技術。
在實施例中描述了在本發(fā)明的方法中使用的受調節(jié)的基因。與具有不同起源癌的那些患者相比，差別表達的基因在具有特定起源癌的患者中受到上調或下調。上調和下調是相對的術語，指發(fā)現(xiàn)的基因表達量相對于一些基線的可檢測的差異(超過用于測量它的系統(tǒng)中的噪音的影響)。在該情況下，基于算法來確定基線。然后，使用相同的測量方法，相對于基線水平上調或下調患病細胞中的目標基因。在本上下文中，患病的指身體狀態(tài)的改變，其中斷或擾亂身體功能的正確性能，或具有擾亂身體功能的正確性能的潛力，如細胞的不受控制的增殖所發(fā)生的。當一個人的基因型或表型的一些方面與疾病的存在相一致時，即可診斷他患有疾病。但是，進行診斷或預后的行為，可以包括確定疾病/狀態(tài)問題，例如確定復發(fā)的可能性，治療的類型和治療監(jiān)控。在治療監(jiān)控中，通過對比隨時間推移的基因表達，來確定基因表達概況是否已經(jīng)變化，或正在變化成與正常組織相一致的模式，從而作出關于給定治療過程效果的臨床判斷。
可以將基因分組，從而使得得到的關于組中基因集合的信息提供作出臨床上相關判斷(例如診斷、預后或治療選擇)的可靠基礎。這些基因集合構成本發(fā)明的組合。與大多數(shù)診斷標記一樣，經(jīng)常需要使用足以作出正確的醫(yī)學判斷的最少數(shù)目的標記。這可以防止在進一步分析期間的治療的延遲，以及時間和資源的無價值的利用。
確立基因表達組合的一個方法是通過使用最優(yōu)化算法，如廣泛用于確立股票組合的均值方差算法。這種方法詳細描述于20030194734。實質上，這種方法要求確立一組輸入值(金融應用中的股票，這里指通過強度測量的表達)，該輸入值將最優(yōu)化人們使用其接受的返回值(例如形成的信號)，同時使返回值的變異性最小化。很多商業(yè)軟件程序可以用來進行這種操作。在整個說明書中稱為“Wagner軟件”的“Wagner聯(lián)合均值-方差最優(yōu)化應用(Wagner Associates Mean-Variance OptimizationApplication)”是優(yōu)選的。這個軟件使用“Wagner聯(lián)合均值-方差最優(yōu)化文庫(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library)”的功能來測定有效的邊界，且在Markowitz意義上的最佳組合是優(yōu)選的。Markowitz(1952)。使用這種類型的軟件要求轉換微陣列數(shù)據(jù)，以便當該軟件用于其預期的金融分析目的時，數(shù)據(jù)能以使用股票返回值和風險測量值的方式作為輸入值而處理。
選擇組合的方法也包括啟發(fā)式規(guī)則的應用。優(yōu)選地，這些規(guī)則是基于生物學和用于產生臨床結果的技術的理解而制定的。更優(yōu)選地，它們可用于從最優(yōu)化方法中輸出。例如，組合選擇的均值方差方法可用于癌癥受試者中大量差異表達的基因的微陣列數(shù)據(jù)。從該方法中得到的輸出值將是一組最優(yōu)化的基因，其可包括一些在外周血液中和患病組織中表達的基因。如果用于測試方法中的樣品是獲自外周血液的，而且在癌中差異表達的某些基因也能在外周血中差異表達，那么就可以應用啟發(fā)式規(guī)則，其中從排除了在外周血中差異表達的那些的有效邊界選擇組合。當然，通過例如在數(shù)據(jù)預選擇過程中運用該規(guī)則，可以在形成有效邊界前應用該規(guī)則。
也可以應用與所討論的生物學不必然相關的其它啟發(fā)式規(guī)則。例如，人們可以應用只有規(guī)定百分比的組合可被特定的基因或基因的組所代表的規(guī)則。商業(yè)化可得的軟件，如Wagner軟件，容易提供這些類型的啟發(fā)式法。這也是有用的，例如，當準確度和精確度以外的因素(如預期的許可費)，對包括一個或多個基因的希求有影響時。
本發(fā)明的基因表達概況也可以與在癌癥診斷、預后或治療監(jiān)控中有用的其它非遺傳診斷方法聯(lián)合使用。例如，在一些情況下，有益地是把上述的基于基因表達的方法的診斷能力與來自常規(guī)標記如血清蛋白標記(例如，癌抗原27.29(“CA 27.29”))的數(shù)據(jù)結合起來。存在一系列這種標記，包括分析物，如CA 27.29。在一種這樣的方法中，從被治療的患者中周期性采血，然后對其進行酶免疫測定，以測定上述血清標記之一。當標記的濃度提示腫瘤復發(fā)或治療失敗時，取得可進行基因表達分析的樣品源。當存在可疑塊時，可以進行細針抽吸(FNA)，然后如上所述對從塊采集的細胞的基因表達概況進行分析?；蛘?，可以從與先前取出腫瘤的組織相鄰的區(qū)域采集組織樣品。當其它測試所得結果不明確時，這種方法是特別有用的。
根據(jù)本發(fā)明制備的試劑盒，包括用于確定基因表達概況的格式化測定。這些可以包括進行測定所需的所有或一些材料，如試劑和說明書和測定生物標記的介質。
本發(fā)明的物品包括用于治療、診斷、預后和以另外方式評價疾病的基因表達概況的表示法(representation)。這些概況表示法處理至一種可被機器自動讀取的介質，如計算機可讀介質(磁性的、光學的等)。物品也可包括在這種介質中評價基因表達概況的指令。例如，物品可包括CD ROM，它具有用于對比上述基因組合的基因表達概況的計算機指令。物品也可包括數(shù)字化地記錄在其中的基因表達概況，以便其可以用于與患者樣品的基因表達數(shù)據(jù)進行比較?；蛘?，概況可以不同的表示形式記錄。圖形記錄就是這樣一種格式。例如上面提到的Partek，Inc.的“DISCOVERY”和“INFER”軟件中整合的聚類算法，能最好的協(xié)助這些數(shù)據(jù)的顯現(xiàn)。
本發(fā)明的制品的不同類型，是用于揭示基因表達概況的介質或格式化的測定。這些可以包括，例如，微陣列，其中序列互補體或探針固定于基質上，指示目標基因的序列與之結合，從而產生關于其存在的可讀測定?；蛘?，本發(fā)明的物品可被制作成試劑盒，以用于進行指示用于檢測癌癥的目標基因表達水平的雜交、擴增和信號產生。
提供下面的實施例用于解釋而不是限制本發(fā)明。本文引用的所有參考文獻都在本文中引作參考。
實施例1 材料和方法 胰癌標記基因發(fā)現(xiàn)。
使用Trizol，從胰腫瘤、正常胰、肺、結腸、乳房和卵巢組織分離RNA。然后，將RNA用于產生擴增的、標記的RNA(Lipshutz等(1999))，其隨后在Affymetrix U133A陣列上雜交。然后以2種方式分析數(shù)據(jù)。
在第一種方法中，過濾該數(shù)據(jù)集，以僅保留在整個數(shù)據(jù)集間具有至少2次存在信號(present calls)的那些基因。該過濾剩下14,547個基因。測得2,736個基因與正常胰相對在胰癌中超表達，p值小于0.05。2,736個基因中的45個基因，也比在肺和結腸組織中發(fā)現(xiàn)的最大強度超表達至少2倍。最后，發(fā)現(xiàn)了6個探針集合，其比在肺、結腸、乳房和卵巢組織中發(fā)現(xiàn)的最大強度超表達至少2倍。
在第二種方法中，過濾該數(shù)據(jù)集，以僅保留在乳房、結腸、肺、和卵巢組織中具有僅僅2次存在信號的那些基因。該過濾剩下4,654個基因。發(fā)現(xiàn)4,654個基因中的160個基因，在胰組織(正常和癌癥)中具有至少2次存在信號。最后，選擇了8個探針集合，它們在胰癌和正常組織之間表現(xiàn)出最大差別表達。
組織樣品。
從許多商業(yè)賣主，獲取共260FFPE轉移和原發(fā)組織。測試的樣品包括30乳房轉移、30結腸直腸轉移、56肺轉移、49卵巢轉移43胰轉移、18前列腺原發(fā)和2前列腺轉移和32其它起源(6胃、6腎、3喉、2肝、1食管、1咽、1膽管、1胸膜、3膀胱、5黑素瘤、3淋巴瘤)。
RNA提取。
基于高純RNA石蠟試劑盒手冊(Roche)所述的方法和試劑，經(jīng)下述改進，從石蠟組織切片分離RNA。根據(jù)包埋的轉移灶的大小(2-5mm＝9×10μm，6-8mm＝6×10μm，8-≥10mm＝3×10μm)，將石蠟包埋的組織樣品切片，且置于RNA酶/DNA酶1.5ml Eppendorf管中。如下將切片脫蠟渦旋10-20秒后，在室溫在1ml二甲苯中溫育2-5分鐘。然后離心管，取出上清液，且重復脫蠟步驟。取出上清液后，加入1ml乙醇，將樣品渦旋1分鐘，離心，且取出上清液。將該過程重復另外一次。取出剩余的乙醇，在55℃烘箱中干燥沉淀5-10分鐘，且重新懸浮于100μl組織裂解緩沖液、16μl10％SDS和80μl蛋白酶K。渦旋樣品，且在設定為400rpm的熱混合儀(thermomixer)中在55℃溫育2小時。向每個樣品加入325μl結合緩沖液和325μl乙醇，然后混合，離心，且將上清液加到過濾器柱上。將過濾器柱和收集管一起在8000rpm離心1分鐘，且拋棄流過物(flow through)。進行一系列連續(xù)洗滌(500μl洗滌緩沖液I→500μl洗滌緩沖液II→300μl洗滌緩沖液II)，其中將每種溶液加到柱中，離心并拋棄流過物。然后將柱在最大速度離心2分鐘，置于新鮮的1.5ml管中，且加入90μl洗脫緩沖液。在室溫溫育1分鐘，隨后在8000rpm離心1分鐘后得到RNA。通過加入10μl DNA酶溫育緩沖液、2μl DNA酶I，并在37℃溫育30分鐘，DNA酶處理樣品。在加入20μl組織裂解緩沖液、18μl 10％SDS和40μl蛋白酶K后，滅活DNA酶。再次，將325μl結合緩沖液和325μl乙醇加入每個樣品中，然后混合，離心，且將上清液加到過濾器柱上。如上所述進行RNA的連續(xù)洗滌和洗脫，例外是，使用50μl洗脫緩沖液洗脫RNA。為了消除從柱攜帶的玻璃纖維污染，將RNA全速離心2分鐘，且將上清液移入新鮮的1.5mlEppendorf管。通過從分光光度計得到的OD 260/280讀數(shù)，定量樣品，且將樣品稀釋至50ng/μl。將分離的RNA在-80℃保藏在無RNA酶的水中備用。
TaqMan引物和探針設計。
適當mRNA參照序列登記號以及Oligo 6.0用于開發(fā)

CUP測定(肺標記人表面活性劑、肺-相關蛋白B(HUMPSPBA)、甲狀腺轉錄因子1(TTF1)、橋粒芯糖蛋白3(DSG3)，結腸直腸標記鈣粘著蛋白17(CDH17)，乳房標記乳腺珠蛋白(mammaglobin)(MG)、前列腺-衍生的ets轉錄因子(PDEF)，卵巢標記wilms瘤1(WT1)，胰標記前列腺干細胞抗原(PSCA)、凝固因子V(F5)，前列腺標記激肽釋放酶3(KLK3))和持家測定β肌動蛋白(β-肌動蛋白)，羥甲基膽色烷合酶(PBGD)。在表2中列出了每個測定的引物和水解探針。通過設計外顯子-內含子剪接位點周圍的測定，排除基因組DNA擴增。在5′核苷酸處用FAM作為報道染料、且在3′核苷酸處用BHQ1-TT作為內部猝滅染料，標記水解探針。
定量實時聚合酶鏈反應。
在ABI Prism 7900HT序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)上，在384孔板中進行基因-特異性的RNA的定量。對于每個熱循環(huán)儀運行，放大校準器和標準曲線。每個標記的校準器由在來自大鼠腎的載體RNA中以1×105拷貝稀釋的靶基因體外轉錄物組成。持家標記的標準曲線由在來自大鼠腎的載體RNA中以1×107、1×105和1×103拷貝系列稀釋的靶基因體外轉錄物組成。在每個測定運行中也包括無靶對照，以確保沒有環(huán)境污染。所有樣品和對照都一式兩份運行。使用一般實驗室用試劑，在10μl反應物中進行qRTPCR，所述反應物含有RT-PCR緩沖液(50nMN-二(羥乙基)甘氨酸/KOH pH 8.2，115nM KAc，8％甘油，2.5mM MgCl2，3.5mM MnSO4，0.5mM每種dCTP、dATP、dGTP和dTTP)，添加劑(2mMTris-Cl pH 8，0.2mM牛清蛋白，150mM海藻糖，0.002％Tween 20)，酶混合物(2U Tth(Roche)，0.4mg/μl Ab TP6-25)，引物和探針混合物(0.2μM探針，0.5μM引物)。遵從下述循環(huán)參數(shù)1個在95℃1分鐘的循環(huán)；1個在55℃2分鐘的循環(huán)；斜升(Ramp)5％；1個在70℃2分鐘的循環(huán)；和40個在95℃15秒、58℃30秒的循環(huán)。完成PCR反應后，在ABI7900HT Prism軟件中設定基線和閾值，且將計算的Ct值輸出到Microsoft Excel中。
一步對兩步反應 每個反應使用100ng隨機六聚體或基因特異性的引物，進行第一鏈合成。在第一步中，將11.5μl混合物-1(引物和1ug總RNA)加熱至65℃5分鐘，然后在冰上冷卻。將8.5μl混合物-2(1x緩沖液，0.01mM DTT，0.5mM每種dNTP’s，0.25U/μl

10U/μl Superscript III)加入混合物-1，且在50℃溫育60分鐘，然后在95℃溫育5分鐘。將cDNA保藏在-20℃?zhèn)溆?。如上所述進行兩步反應的第二步的qRTPCR，循環(huán)參數(shù)如下1個在95℃1分鐘的循環(huán)；40個在95℃15秒、58℃30秒的循環(huán)。精確如前段所述，進行一步反應的qRTPCR。一步和兩步反應二者都在100ng模板(RNA/cDNA)上進行。完成PCR反應后，在ABI 7900HTPrism軟件中設定基線和閾值，且將計算的Ct值輸出到Microsoft Excel中。
熱圖的產生。
對于每個樣品，通過取每個CUP標記的平均Ct，且從平均Ct減去持家標記的平均值，計算ΔCt(ΔCt＝Ct(CUP標記)-Ct(Ave.HK標記))。測定每個樣品的每個起源組織標記集合(肺、乳房、前列腺、結腸、卵巢和胰)的最小ΔCt。將具有總最小ΔCt的起源組織評分為1，且所有其它起源組織評分為0。根據(jù)病理學診斷，分選數(shù)據(jù)。用修飾的可行性數(shù)據(jù)計算Partek Pro，且產生強度圖。
結果。
新胰起源腫瘤和癌癥狀態(tài)標記的發(fā)現(xiàn)。
首先，分析了5個胰標記候選物前列腺干細胞抗原(PSCA)、絲氨酸蛋白酶抑制劑，進化枝A成員1(SERPINA1)、細胞角蛋白7(KRT7)、基質金屬蛋白酶11(MMP11)和粘蛋白4(MUC4)(Varadhachary等(2004)；Fukushima等(2004)；Argani等(2001)；Jones等(2004)；Prasad等(2005)；和Moniaux等(2004))，其中使用DNA微陣列和一組13個胰管腺癌，5個正常胰組織，和98個來自乳房、結腸直腸、肺和卵巢腫瘤的樣品。僅PSCA表現(xiàn)出在高特異性(91/98或93％被正確地鑒別為非胰起源)的中等靈敏度(檢測了6/13或46％的胰腫瘤)(圖1A)。相反，KRT7、SERPINA1、MMP11和MUC4分別表現(xiàn)出在特異性分別為66％、91％、82％和81％的38％、31％、85％和31％的靈敏度。這些數(shù)據(jù)與在27個胰起源轉移和39個非胰起源轉移上為所有標記進行的qRTPCR十分一致，例外是MMP 11，它在qRTPCR和轉移中表現(xiàn)出更差的靈敏度和特異性。總之，在驟凍的、原發(fā)組織上的微陣列數(shù)據(jù)可以用作標記使用qRTPCR鑒別FFPE轉移為胰起源的能力的良好指示物，但是其它標記可能對最佳性能有用。
因為胰管腺癌從管上皮細胞發(fā)展而來，所述管上皮細胞僅占所有胰細胞的小百分比(其中腺泡細胞和胰島細胞占大多數(shù))，且因為胰腺癌組織含有顯著量的鄰近正常組織(Prasad等(2005)；和Ishikawa等(2005))，所以已經(jīng)難以鑒別也能將該器官從器官中區(qū)分開的胰癌標記(即，在癌癥中上調的)。對于在CUP組中的用途，這樣的區(qū)分是必需的。第一種查詢方法(見材料和方法)返回6個探針集合凝固因子V(F5)、類似于FK506結合蛋白的推定蛋白FLJ22041(FKBP10)、β6整聯(lián)蛋白(ITGB6)、轉谷氨酰胺酶2(TGM2)、異質核內核糖核蛋白A0(HNRP0)和BAXδ(BAX)。第二種查詢方法(見材料和方法)返回8個探針集合F5、TGM2、配對-樣同源域轉錄因子1(PITX1)、三件套蛋白同工型mRNA(TRIO)、p73H的mRNA(p73)、MGC10264的一種未知蛋白(SCD)和密蛋白18的2個探針集合。F5和TGM2存在于2種查詢結果中，且在二者中，F(xiàn)5似乎最有前途(圖1B)。
使用FFPE組織最優(yōu)化樣品制備和qRTPCR。
接著，在檢查標記組性能之前，使用固定的組織最優(yōu)化RNA分離和qRTPCR方法。首先，分析了將蛋白酶K溫育時間從16小時減小至3小時的作用。對產量沒有作用。但是，當使用更短的蛋白酶K步驟時，有些樣品表現(xiàn)出更長的RNA片段(圖2)。例如，當RNA是從1年齡塊(C22)中分離時，在電泳圖譜中沒有觀察到差異。但是，當RNA是從5年齡塊(C23)中分離時，如通過肩上的峰評估的，當使用更短的蛋白酶K消化時，觀察到更大部分的更高分子量RNA。當加工其它樣品時，該趨勢通常會保持，無論FFPE轉移的起源器官?？傊?，縮短蛋白酶K消化時間不犧牲RNA產量，且可能輔助分離更長的、更低降解的RNA。
接著，對比了3種不同的反轉錄方法使用隨機六聚體的反轉錄、隨后用qPCR(2步)，使用基因-特異性的引物的反轉錄、隨后用qPCR(2步)，和使用基因-特異性的引物的一步qRTPCR。從11個轉移分離RNA，并橫過3種方法對比β-肌動蛋白、人表面活性劑蛋白B(HUMSPB)、和甲狀腺轉錄因子(TTF)的Ct值(圖3)。所有對比都存在統(tǒng)計學顯著的差異(p＜0.001)。對于所有3個基因，使用隨機六聚體的反轉錄、隨后用qPCR(2步反應)產生最高的Ct值，而使用基因-特異性的引物的反轉錄、隨后用qPCR (2步反應)產生比對應的1步驟反應略微(但是統(tǒng)計學顯著的)更低的Ct值。但是，使用基因-特異性的引物的2步驟RTPCR具有更長的反轉錄步驟。當將每個樣品的HUMSPB和TTF Ct值對對應的β-肌動蛋白值標準化時，3種方法之間的標準化的Ct值沒有差異?？傊?，最優(yōu)化RTPCR反應條件可以產生更低的Ct值，這可以輔助分析更老的石蠟塊(Cronin等(2004))，且使用基因-特異性的引物的一步RTPCR反應可以產生與在對應的2步反應中產生的Ct值可比較的Ct值。
CUP qRTPCR測定的診斷性能。
接著，在239FFPE轉移上進行12qRTPCR反應(10標記和2個持家基因)。在表2中顯示了測定所用的標記。肺標記是人表面活性劑肺-相關蛋白B(HUMPSPB)、甲狀腺轉錄因子1(TTF1)和橋粒芯糖蛋白3(DSG3)。結腸直腸標記是鈣粘著蛋白17(CDH17)。乳房標記是乳腺珠蛋白(MG)和前列腺-衍生的Ets轉錄因子(PDEF)。卵巢標記是Wilms瘤1(WT1)。胰標記是前列腺干細胞抗原(PSCA)和凝固因子V(F5)，且前列腺標記是激肽釋放酶3(KLK3)。關于基因描述，見表15。
表2.引物和探針序列、登記號和擴增子長度.


*探針是5′FAM-3′BHQ1-TT 分析熱圖中的標準化的Ct值，揭示了乳房和前列腺標記的高特異性，結腸、肺和卵巢的中等特異性，和胰標記的稍微更低的特異性。組合標準化的qRTPCR數(shù)據(jù)和計算精制，提高了標記組的性能。從組合的標準化的qRTPCR數(shù)據(jù)與算法得到結果，并確定qRTPCR測定的準確度。
討論。
在該實施例中，在原發(fā)性腫瘤上使用基于微陣列的表達概況分析，以鑒別用于轉移的候選標記。原發(fā)性腫瘤可以用于發(fā)現(xiàn)轉移的起源腫瘤標記的事實，與最近的幾項發(fā)現(xiàn)相一致。例如，Weigelt及同事已經(jīng)表明，原發(fā)乳房腫瘤的基因表達概況在遠距離轉移中保持。Weigelt等(2003)。Italiano及同事發(fā)現(xiàn)，通過IHC評估的EGFR狀態(tài)在80原發(fā)結腸直腸腫瘤和80相關轉移中類似。Italiano等(2005)。80個中僅5個表現(xiàn)出EGFR狀態(tài)的不一致性。Italiano等(2005)。Backus及同事鑒別出了用于檢測乳腺癌轉移的推定標記，其中使用乳房和其它組織的全基因組的基因表達分析，并證實乳腺珠蛋白和CK19可以以90％靈敏度和94％特異性檢測乳房警戒淋巴結中臨床上起作用的轉移。Backus等(2005)。
使用原發(fā)組織進行的基于微陣列的研究證實了已知標記的特異性和靈敏度。結果，除了F5以外，使用的所有標記都對這里研究的組織具有高特異性。Argani等(2001；Backus等(2005)；Cunha等(2005)；Borgono等(2004)；McCarthy等(2003)；Hwang等(2004)；Fleming等(2000)；Nakamura等(2002)；和Khoor等(1997)。最近的研究使用IHC確定，PSCA在前列腺癌轉移中超表達。Lam等(2005)。Dennis等(2002)也證實，PSCA可以用作胰和前列腺的起源腫瘤標記。如本文所顯示的，在RNA水平發(fā)現(xiàn)有些前列腺組織中PSCA的強表達，但是由于在測定中包含PSA，所以現(xiàn)在可以分離前列腺和胰癌。該研究的一項新發(fā)現(xiàn)是，使用F5作為胰起源組織的互補(與PSCA互補)標記。在微陣列數(shù)據(jù)集(含有原發(fā)組織)和qRTPCR數(shù)據(jù)集(含有FFPE轉移)中，發(fā)現(xiàn)F5與PSCA互補(圖4和表3)。
表3可行性數(shù)據(jù)
以前的研究人員已經(jīng)使用IHC或微陣列生成了CUP測定。Su等(2001)；Ramaswamy等(2001)；和Bloom等(2004)。最近，已經(jīng)將SAGE與小qRTPCR標記組相結合。Dennis(2002)；和Buckhaults等(2003)。該研究首次組合了基于微陣列的表達概況分析和小組qRTPCR測定。使用原發(fā)組織的微陣列研究鑒別出了一些、但不是所有與以前通過SAGE研究鑒別出的標記相同的起源組織標記。一些研究已經(jīng)證實，基于SAGE和DNA微陣列的概況分析數(shù)據(jù)之間存在中等一致性，且該相關性對于具有更高表達水平的基因提高。van Ruissen等(2005)；和Kim(2003)。例如，Dennis及同事鑒別出了PSA、MG、PSCA和HUMSPB，而Buckhaults及同事(Dennis等(2002))鑒別出了PDEF。使用qRTPCR執(zhí)行CUP測定是優(yōu)選的，因為它是有力的技術，且可能具有勝過IHC的性能優(yōu)點。Al-Mulla等(2005)；和Haas等(2005)。如本文所示，通過在一步反應中使用基因-特異性的引物，改進了qRTPCR規(guī)程。這首次證實了基因-特異性的引物在含有FFPE組織的一步qRTPCR反應中的應用。其它研究人員已經(jīng)進行了2步qRTPCR(在一個反應中合成cDNA，隨后qPCR)，或已經(jīng)使用隨機六聚體或截短的基因-特異性的引物。Abrahamsen等(2003)；Specht等(2001)；Godfrey等(2000)；Cronin等(2004)；和Mikhitarian等(2004)。
實施例2 胰管腺癌從管上皮細胞發(fā)展而來，所述管上皮細胞在正常胰中僅占所有胰細胞的小百分比(其中腺泡細胞和胰島細胞占大多數(shù))。此外，胰腺癌組織含有顯著量的鄰近正常組織。Prasad等(2005)；和Ishikawa等(2005)。因此，為在胰腺癌中比在正常胰細胞中升高的基因，富集候選胰標記。第一種查詢方法返回6個探針集合凝固因子V(F5)、類似于FK506結合蛋白的推定蛋白FLJ22041(FKBP10)、β6整聯(lián)蛋白(ITGB6)、轉谷氨酰胺酶2(TGM2)、異質核內核糖核蛋白A0(HNRP0)和BAX δ(BAX)。第二種查詢方法(細節(jié)見材料和方法部分)返回8個探針集合F5、TGM2、配對-樣同源域轉錄因子1(PITX1)、三件套蛋白同工型mRNA(TRIO)、p73H的mRNA(p73)、MGC10264的一種未知蛋白(SCD)和密蛋白18的2個探針集合。
選擇共23個組織特異性的標記候選物，用于進一步通過qRT-PCR在轉移癌FFPE組織上進行RT-PCR驗證。標記候選物在來自肺、胰、結腸、乳房、卵巢、前列腺和前列腺原發(fā)癌的205FFPE轉移癌上測試。表4提供了為RT-PCR驗證選擇的組織特異性標記的基因符號，并也總結了用這些標記進行的檢驗的結果。
表4
基于它們的交叉反應性、在對應轉移組織中的低表達水平或冗余，在23個測試的標記中排除13個。選擇10個標記用于最后的測定形式。肺標記是人表面活性劑肺-相關蛋白B(HUMPSPB)、甲狀腺轉錄因子1(TTF1)和橋粒芯糖蛋白3(DSG3)。胰標記是前列腺干細胞抗原(PSCA)和凝固因子V(F5)，且前列腺標記是激肽釋放酶3(KLK3)。結腸直腸標記是鈣粘著蛋白17(CDH17)。乳房標記是乳腺珠蛋白(MG)和前列腺-衍生的Ets轉錄因子(PDEF)。卵巢標記是Wilms瘤1(WT1)。
使用FFPE組織最優(yōu)化樣品制備和qRT-PCR。接著，在檢查標記組性能之前，使用固定的組織最優(yōu)化RNA分離和qRTPCR方法。首先，分析了將蛋白酶K溫育時間從16小時減小至3小時的作用。對產量沒有作用。但是，當使用更短的蛋白酶K步驟時，有些樣品表現(xiàn)出更長的RNA片段(圖4A，B)。例如，當RNA是從1年齡塊(C22)中分離時，在電泳圖譜中沒有觀察到差異。但是，當RNA是從5年齡塊(C23)中分離時，如通過肩上的峰評估的，當使用更短的蛋白酶K消化時，觀察到更大部分的更高分子量RNA。當加工其它樣品時，該趨勢通常會保持，無論FFPE轉移的起源器官。總之，縮短蛋白酶K消化時間不犧牲RNA產量，且可能輔助分離更長的、更低降解的RNA。
接著，對比了3種不同的反轉錄方法使用隨機六聚體的反轉錄、隨后用qPCR(2步)，使用基因-特異性的引物的反轉錄、隨后用qPCR(2步)，和使用基因-特異性的引物的一步qRTPCR。從11個轉移分離RNA，并橫過3種方法對比β-肌動蛋白、HUMSPB(圖4C，D)和TTF的Ct值。所有對比的結果都顯示統(tǒng)計學顯著的差異(p＜0.001)。對于2個基因，使用隨機六聚體的反轉錄、隨后用qPCR(2步反應)產生最高的Ct值，而使用基因-特異性的引物的反轉錄、隨后用qPCR(2步反應)產生比對應的1步驟反應略微(但是統(tǒng)計學顯著的)更低的Ct值。但是，使用基因-特異性的引物的2步驟RTPCR具有更長的反轉錄步驟。當將每個樣品的HUMSPB Ct值對對應的β-肌動蛋白值標準化時，3種方法之間的標準化的Ct值沒有差異?？傊顑?yōu)化RTPCR反應條件可以產生更低的Ct值，這可以輔助分析更老的石蠟塊(Cronin等(2004))，且使用基因-特異性的引物的一步RTPCR反應可以產生與在對應的2步反應中產生的Ct值可比較的Ct值。
最優(yōu)化的qRTPCR測定的診斷性能。在260FFPE轉移灶的新集合上進行12qRTPCR反應(10標記和2個持家基因)。21個樣品產生持家基因的高Ct值，所以在熱圖分析中使用了僅239個樣品。分析熱圖中的標準化的Ct值，揭示了乳房和前列腺標記的高特異性，結腸、肺和卵巢的中等特異性，和胰標記的稍微更低的特異性(圖5)。組合標準化的qRTPCR數(shù)據(jù)和計算精制，提高了標記組的性能。
使用對2個持家基因的表達的平均值標準化的表達值，通過組合標準化的qRTPCR數(shù)據(jù)和算法，開發(fā)了預測轉移起源組織的算法，并通過進行l(wèi)eave-one-out交叉驗證檢驗(LOOCV)，測定qRTPCR測定的準確度。對于測定中包括的6個組織類型，分別估計出假陽性信號的數(shù)目(當將樣品錯誤預測為在測定中包括的其它腫瘤類型時(例如，將胰預測為結腸))和沒有將樣品預測為在測定組織類型中包括的那些類型(其它)的次數(shù)。LOOCV的結果在表5示出。
表5
為260個測試的樣品中的204個，以78％的總準確度正確預測了起源組織。相當大比例的假陽性信號是由于組織學上類似的組織中的標記交叉反應性。例如，源自咽、喉和食管的3種鱗狀細胞轉移癌被錯誤預測為肺，這是由于這些組織中的DSG3表達。CDH17在結腸GI癌以外(包括胃和胰)的陽性表達，造成6個測試的胃中的4個和43個測試的胰癌轉移中的3個錯誤分類成結腸。
除了LOOCV檢驗以外，將數(shù)據(jù)隨機分成3獨立對的訓練和試驗集合。每個分離含有約50％的每類樣品。在50/50分離時，在3獨立對的訓練和試驗集合中，測定總分類準確度是77％、71％和75％，從而證實了測定性能穩(wěn)定性。
最后，測試了48FFPE轉移癌的另一個獨立集合，其包括已知原發(fā)的轉移癌、含有通過病理學評價(包括IHC)提供的起源組織診斷的CUP樣品、和在測試IHC測試后保持CUP的CUP樣品。為每類樣品分別估計起源組織預測準確度。表6總結了測定結果。
表6 除了僅小量例外以外，起源組織預測與通過臨床/病理學評價(包括IHC)評估的已知原發(fā)或起源組織診斷相一致。類似于訓練集合，測定不能區(qū)分源自不同來源的鱗狀細胞癌，且將它們錯誤預測為肺。
測定也為在標準診斷試驗后保持CUP的11個樣品中的8個作出推定的起源組織診斷。CUP病例中的一個是特別令人感興趣的。具有前列腺癌歷史的男性患者被診斷出在肺和胸膜中的轉移癌。在轉移組織上進行的血清PSA試驗和使用PSA抗體的IHC是陰性的，所以病理學家的診斷是傾向于胃腸腫瘤的CUP。所述測定強烈(后驗概率0.99)預測起源組織是結腸。
討論。在該研究中，原發(fā)性腫瘤上的基于微陣列的表達概況分析用于鑒別為轉移灶使用的候選標記。原發(fā)性腫瘤可以用于發(fā)現(xiàn)轉移的起源腫瘤標記的事實，與最近的幾項發(fā)現(xiàn)相一致。例如，Weigelt及同事已經(jīng)表明，原發(fā)乳房腫瘤的基因表達概況在遠距離轉移中保持。Weigelt等(2003)。Backus及同事鑒別出了用于檢測乳腺癌轉移的推定標記，其中使用乳房和其它組織的全基因組的基因表達分析，并證實乳腺珠蛋白和CK19可以以90％靈敏度和94％特異性檢測乳房警戒淋巴結中臨床上起作用的轉移。Backus等(2005)。
在測定開發(fā)過程中，選擇集中于6個癌癥類型，包括在CUP中最普遍的肺、胰和結腸(Ghosh等(2005)；和Pavlidis等(2005))和治療可能對患者最有益的乳房、卵巢和前列腺。Ghosh等(2005)。但是，其它組織類型和標記也可以加入組中，只要不損害測定的總準確度即可，且如果適用，不妨礙RTPCR反應的邏輯(logistics)。
基于微陣列的使用原發(fā)組織的研究證實了已知標記的特異性和靈敏度。結果，大多數(shù)組織特異性的標記對這里研究的組織具有高度特異性。最近的使用IHC的研究發(fā)現(xiàn)，PSCA在前列腺癌轉移中超表達。Lam等(2005)。Dennis等(2002)也證實，PSCA可以用作胰和前列腺的起源腫瘤標記。在RNA水平，在有些前列腺組織中存在PSCA的強表達，但是，由于在測定中包括PSA，所以現(xiàn)在可以分離前列腺和胰癌。該研究的新發(fā)現(xiàn)是，使用F5作為胰起源組織的互補(與PSCA互補)標記。在微陣列數(shù)據(jù)集(含有原發(fā)組織)和qRTPCR數(shù)據(jù)集(含有FFPE轉移)中，發(fā)現(xiàn)F5與PSCA互補。
以前的研究人員已經(jīng)使用IHC(Brown等(1997)；DeYoung等(2000)；和Dennis等(2005a))或微陣列產生了CUP測定。Su等(2001)；Ramaswamy等(2001)；和Bloom等(2004)。最近，已經(jīng)將SAGE與小qRTPCR標記組相結合。Dennis(2002)；和Buckhaults等(2003)。該研究首次組合了基于微陣列的表達概況分析和小組qRTPCR測定。使用原發(fā)組織的微陣列研究鑒別出了一些、但不是所有與以前通過SAGE研究鑒別出的標記相同的起源組織標記。該發(fā)現(xiàn)不是令人奇怪的，因為研究已經(jīng)證實，基于SAGE和DNA微陣列的概況分析數(shù)據(jù)之間存在中等一致性，且該相關性對于具有更高表達水平的基因提高。van Ruissen等(2005)；和Kim(2003)。例如，Dennis及同事鑒別出了PSA、MG、PSCA和HUMSPB，而Buckhaults及同事(Buckhaults等(2003))鑒別出了PDEF。使用qRTPCR執(zhí)行CUP測定是優(yōu)選的，因為它是有力的技術，且可能具有勝過IHC的性能優(yōu)點。Al-Mulla等(2005)；和Haas等(2005)。此外，如本文所示，已通過在一步反應中使用基因-特異性的引物，改進了qRTPCR規(guī)程。這首次證實了基因-特異性的引物在含有FFPE組織的一步qRTPCR反應中的應用。其它研究人員已經(jīng)進行了2步qRTPCR (在一個反應中合成cDNA，隨后qPCR)，或已經(jīng)使用隨機六聚體或截短的基因-特異性的引物。Abrahamsen等(2003)；Specht等(2001)；Godfrey等(2000)；Cronin等(2004)；和Mikhitarian等(2004)。
總之，6個組織類型的測定的78％總準確度有利地與其它研究匹敵。Brown等(1997)；DeYoung等(2000)；Dennis等(2005a)；Su等(2001)；Ramaswamy等(2001)；和Bloom等(2004)。
實施例3 在該研究中，通過從MVO中選擇，并使用分類器來預測5種主要癌癥類型(包括乳房、結腸、肺、卵巢和前列腺)的組織起源和癌癥狀態(tài)，建立了使用基因標記組合的分類器。使用Affymetrix人U133AGeneChip，分析了378原發(fā)癌、23良性增生性上皮病變和103正常驟凍人組織樣品。還分析了白細胞樣品，以減去被白細胞背景細胞中的共表達潛在遮蓋的基因表達。開發(fā)了新的基于MVO的生物信息學方法，來選擇起源組織和癌癥狀態(tài)的基因標記組合。數(shù)據(jù)證實，26基因的組可以用作在5種癌癥類型中準確預測起源組織和癌癥狀態(tài)的分類器。因而，通過測定適度小數(shù)目的基因標記的基因表達概況，可以得到多癌癥分類方法。
表7顯示了為指定的組織起源鑒別的標記。關于基因描述，見表15。
表7 樣品集合包括共計299個轉移結腸、乳房、胰、卵巢、前列腺、肺和其它癌和原發(fā)前列腺癌樣品。執(zhí)行基于組織學評價、RNA得率和對照基因β-肌動蛋白的表達的QC。其它樣品類別包括源自胃(5)、腎(6)、膽管/膽囊(4)、肝(2)、頭和頸(4)、回腸(1)癌和一種間皮瘤的轉移。表8總結了結果。
表8 測試上述樣品，導致將標記集合縮小至表9中的那些，結果見表10。
表9
表10 結果表明，在205個石蠟包埋的轉移腫瘤中，166個樣品(81％)具有決定性的測定結果，表11。
表11 在假陽性結果中，許多錯誤源自組織學和胚胎學類似的組織，表12。
表12 為模型開發(fā)考慮下述參數(shù) 分離女性和男性集合的標記，并分別為男性和女性患者計算CUP概率。男性集合包括SP_B、TTF1、DSG3、PSCA、F5、PSA、HPT1；女性集合包括SP_B、TTF1、DSG3、PSCA、F5、HPT1、MGB、PDEF、WT1。從測定結果排除背景表達肺SP_B、TTF1、DSG3；卵巢WT1；和結腸HPT1。
將CUP模型調節(jié)至CUP患病率(％)肺23、胰16、結腸直腸9、乳房3、卵巢4、前列腺2、其它43。將男性患者的乳房和卵巢患病率調節(jié)至0％，且將女性患者的前列腺患病率調節(jié)至0％。
采取下述步驟 將標記置于類似的標尺上。
通過從每個組織特異性集合選擇最小值，將變量的數(shù)目從12減至8。
省去(leave out)1個樣品。從剩余的樣品建立模型。測試省去的樣品。重復到測試了100％樣品。
隨機省去約50％的樣品(每個組織約50％)。從剩余的樣品建立模型。測試約50％的樣品。對3個不同隨機分離進行重復。
將分類準確度調節(jié)至癌癥類型患病率，以產生表13總結的結果，原始數(shù)據(jù)如表14所示。
盡管已經(jīng)通過用于理解清楚的目的的說明和實施例比較詳細地描述了前述發(fā)明，但所述描述和實施例不應當理解為對本發(fā)明范圍的限制。
表13

表15
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tgggatggcg accgggcaag ctttcttcct cgagatgctc tgctgcttga gagctattgc300
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<213>人
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acatgagcgg catgggcg 78
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<212>DNA
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<211>22
<212>DNA
<213>人
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actccagaga ttcggtaggt ga 22
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<212>DNA
<213>人
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attgccaaga ttacttcaga ttacca 26
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<212>DNA
<213>人
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gcagagaagg agaagataac tcaaaaagaa acccaattgc caagattact tcagattacc60
aagcaaccca gaaaatcacc taccgaatct ctggagt 97
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tccctcggca gtggaagctt a 21
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<212>DNA
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ccaaaatcaa tggtactcat gcccgactg 29
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tccctcggca gtggaagctt acaaaacgac tgggaagttt ccaaaatcaa tggtactcat60
gcccgactgt ctaccaggca cacagagttt gagga 95
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cacttgtgga ttgattgtct tgga 24
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agttgctgat ggtcctcatg ctggcggccc tctcccagca ctgctacgca ggctctggct60
gccccttatt ggagaatgtg atttccaaga caatcaatcc acaagtg 107
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gattcactac tgtgcctcga ccagtg 86
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tatgtggtat cttctggaat atcatca27
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acaaagggaa acagatattg aagactc27
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tgaagaaata tcctgggatt attcagaatt tgtacaaagg gaaacagata ttgaagactc60
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ggcccaggca ctgctgcctg gaccacctca tccttggcct gtgcccaggg ccctgagttc120
tggtgccaaa gcctggagca agcattgcag tgcagagccc tagggcattg cctacaggaa180
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cacctgggcc tgtgcaaatc ccggcagcca gagccagagc aggagccagg gatgtcagac480
cccctgccca aacctctgcg ggaccctctg ccagaccctc tgctggacaa gctcgtcctc540
cctgtgctgc ccggggccct ccaggcgagg cctgggcctc acacacagga tctctccgag600
cagcaattcc ccattcctct cccctattgc tggctctgca gggctctgat caagcggatc660
caagccatga ttcccaaggg tgcgctagct gtggcagtgg cccaggtgtg ccgcgtggta720
cctctggtgg cgggcggcat ctgccagtgc ctggctgagc gctactccgt catcctgctc780
gacacgctgc tgggccgcat gctgccccag ctggtctgcc gcctcgtcct ccggtgctcc840
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caggcaatgc tccaggcctg tgttggctcc tggctggaca gggaaaagtg caagcaattt 1020
gtggagcagc acacgcccca gctgctgacc ctggtgccca ggggctggga tgcccacacc 1080
acctgccagg ccctcggggt gtgtgggacc atgtccagcc ctctccagtg tatccacagc 1140
cccgaccttt gatgagaact cagctgtcca gaaaaagaca ccgtccttta aagtgctgca 1200
gtatggccag acgtggtggc tcacacctgc aatcccagca ccttaggagg ccgaggcagg 1260
aggatccttg aggtcaggag ttcgagacca gcctcgccaa catggtgaaa ccccatttct 1320
actaaaaata caaaaaatta gccaagtgtg gtggcatatg cctgtaatcc caactactca 1380
gaaggccgag gcaggagaat tacttgaacg caggagaatc actgcagccc aggaggcaga 1440
ggttgcagtg agccgagatt gcaccactgc actccagcct gggtgacaga gcaagactcc 1500
atctcagtaa ataaataaat aaataaaaag cgctgcagta gctgtggcct caccctgaag 1560
tcagcgggcc caggcctacc tcactctctc ccttggcaga gaagcagacg tccatagctc 1620
ctctccctca caagcgctcc cagcctgccc tccagctgct gctctcccct cccagtctct 1680
actcactggg atgaggttag gtcatgagga caccaaaaac ctaaaaataa acaaaaagcc 1740
aaacaagcct tagcttttct taaagactga aatgcctgga agtgtccctt tatttataaa 1800
ataacttttg tcatatttct tatacatgtt tcttgtaaga aattcagaaa ctacagacaa 1860
agagagtgga aattacccac tgtcaggcct ctgagcccaa gctaagccat catatcccct 1920
gtgccctgca cgtatacacc cagatggcct gaagcaactg aagatccaca aaagaagtga 1980
aaatagccag ttcctgcctt aactgatgac attccaccat tgtgatttgt tcctgcccca 2040
ccctaactga tcaattgacc ttgtgacaat acaccttccc cacccttgag aaggtgcttt 2100
gtaatattct ccccacccac cccacgcccg cacccccgca cccttaagaa ggtattttgt 2160
aatattctct ccgccattga gaatgtgctt tgtaagatcc accccctgcc cacaaaaaat 2220
tgctcctaac tccaccgcct atcccaaacc tacaagaact aatgataatc ccaccaccct 2280
ttgctgactc tttttggact cagcccacct gcacccaggt gattaaaaag ctttattgtt 2340
cacacaaagc ctgtttggta gtctcttcac agggaagcat gtgacaccca caatcccacc 2400
tagcccagga gagagctacg gcagggtgtg tgttttgaca ctgagcttgg ggctttttcc 2460
atcttctccc cacagcctct ggctccacac ctccaccgtt caagcgccag aaagagctgt 2520
ctatgcagcc tgctcttggg cctggggatg agacacacaa ttcattggct cctggatttt 2580
aagtagacat ttgtaaatct atagctaact actgtcctta aagccattgt ttccattaca 2640
aaatccaact ctctgagaga aaagggtgtt ttaaatttaa aaaaataaaa acaaaaaagt 2700
ttgattgaga aaaaaaaaaa aaaa 2724
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<213>人
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gaaacttaaa ggtgtttacc ttgtcatcag catgtaagct aattatctcg ggcaagatgt 60
aggcttctat tgtcttgttg ctttagcgct tacgccccgc ctctggtggc tgcctaaaac 120
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gaggactcgg tccactccgt tacgtgtaca tccaacaaga tcggcgttaa ggtaacacca 240
gaatatttgg caaagggaga aaaaaaaagc agcgaggctt cgccttcccc ctctcccttt 300
tttttcctcc tcttccttcc tcctccagcc gccgccgaat catgtcgatg agtccaaagc 360
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cctaccacat gacggcggcg ggggtgcccc agctctcgca ctccgccgtg gggggctact 600
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gcgcctctgg ccccggatgg tacggcgcca acccagaccc gcgcttcccc gccatctccc 720
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tcttctcgca ggcgcaggtg tacgagctgg agcgacgctt caagcaacag aagtacctgt 900
cggcgccgga gcgcgagcac ctggccagca tgatccacct gacgcccacg caggtcaaga 960
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agcaactgca gcaggacagc ggcggcggcg ggggcggcgg gggcaccggg tgcccgcagc1080
agcaacaggc tcagcagcag tcgccgcgac gcgtggcggt gccggtcctg gtgaaagacg1140
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agcagcaggc gcagcaccag gcgcaggccg cgcaggcggc ggcagcggcc atctccgtgg1260
gcagcggtgg cgccggcctt ggcgcacacc cgggccacca gccaggcagc gcaggccagt1320
ctccggacct ggcgcaccac gccgccagcc ccgcggcgct gcagggccag gtatccagcc1380
tgtcccacct gaactcctcg ggctcggact acggcaccat gtcctgctcc accttgctat1440
acggtcggac ctggtgagag gacgccgggc cggccctagc ccagcgctct gcctcaccgc1500
ttccctcctg cccgccacac agaccaccat ccaccgctgc tccacgcgct tcgacttttc1560
ttaacaacct ggccgcgttt agaccaagga acaaaaaaac cacaaaggcc aaactgctgg1620
acgtctttct ttttttcccc ccctaaaatt tgtgggtttt tttttttaaa aaaagaaaat1680
gaaaaacaac caagcgcatc caatctcaag gaatctttaa gcagagaagg gcataaaaca1740
gctttggggt gtcttttttt ggtgattcaa atgggttttc cacgctaggg cggggcacag1800
attggagagg gctctgtgct gacatggctc tggactctaa agaccaaact tcactctggg1860
cacactctgc cagcaaagag gactcgcttg taaataccag gatttttttt tttttttgaa1920
gggaggacgg gagctgggga gaggaaagag tcttcaacat aacccacttg tcactgacac1980
aaaggaagtg ccccctcccc ggcaccctct ggccgcctag gctcagcggc gaccgccctc2040
cgcgaaaata gtttgtttaa tgtgaacttg tagctgtaaa acgctgtcaa aagttggact2100
aaatgcctag tttttagtaa tctgtacatt ttgttgtaaa aagaaaaacc actcccagtc2160
cccagccctt cacatttttt atgggcattg acaaatctgt gtatattatt tggcagtttg2220
gtatttgcgg cgtcagtctt tttctgttgt aacttatgta gatatttggc ttaaatatag2280
ttcctaagaa gcttctaata aattatacaa attaaaaaga ttctttttct gattaaaaaa2340
aaaaaaaaaa aa2352
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ttttcttaga cattaactgc agacggctgg caggatagaa gcagcggctc acttggactt 60
tttcaccagg gaaatcagag acaatgatgg ggctcttccc cagaactaca ggggctctgg120
ccatcttcgt ggtggtcata ttggttcatg gagaattgcg aatagagact aaaggtcaat180
atgatgaaga agagatgact atgcaacaag ctaaaagaag gcaaaaacgt gaatgggtga240
aatttgccaa accctgcaga gaaggagaag ataactcaaa aagaaaccca attgccaaga300
ttacttcaga ttaccaagca acccagaaaa tcacctaccg aatctctgga gtgggaatcg360
atcagccgcc ttttggaatc tttgttgttg acaaaaacac tggagatatt aacataacag420
ctatagtcga ccgggaggaa actccaagct tcctgatcac atgtcgggct ctaaatgccc480
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atcctccagt attttcacaa caaattttca tgggtgaaat tgaagaaaat agtgcctcaa600
actcactggt gatgatacta aatgccacag atgcagatga accaaaccac ttgaattcta660
aaattgcctt caaaattgtc tctcaggaac cagcaggcac acccatgttc ctcctaagca720
gaaacactgg ggaagtccgt actttgacca attctcttga ccgagagcaa gctagcagct780
atcgtctggt tgtgagtggt gcagacaaag atggagaagg actatcaact caatgtgaat840
gtaatattaa agtgaaagat gtcaacgata acttcccaat gtttagagac tctcagtatt900
cagcacgtat tgaagaaaat attttaagtt ctgaattact tcgatttcaa gtaacagatt960
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gaaattggtt tgaaatacaa actgatccta gaactaatga aggcatcctg aaagtggtga 1080
aggctctaga ttatgaacaa ctacaaagcg tgaaacttag tattgctgtc aaaaacaaag 1140
ctgaatttca ccaatcagtt atctctcgat accgagttca gtcaacccca gtcacaattc 1200
aggtaataaa tgtaagagaa ggaattgcat tccgtcctgc ttccaagaca tttactgtgc 1260
aaaaaggcat aagtagcaaa aaattggtgg attatatcct gggaacatat caagccatcg 1320
atgaggacac taacaaagct gcctcaaatg tcaaatatgt catgggacgt aacgatggtg 1380
gatacctaat gattgattca aaaactgctg aaatcaaatt tgtcaaaaat atgaaccgag 1440
attctacttt catagttaac aaaacaatca cagctgaggt tctggccata gatgaataca 1500
cgggtaaaac ttctacaggc acggtatatg ttagagtacc cgatttcaat gacaattgtc 1560
caacagctgt cctcgaaaaa gatgcagttt gcagttcttc accttccgtg gttgtctccg 1620
ctagaacact gaataataga tacactggcc cctatacatt tgcactggaa gatcaacctg1680
taaagttgcc tgccgtatgg agtatcacaa ccctcaatgc tacctcggcc ctcctcagag1740
cccaggaaca gatacctcct ggagtatacc acatctccct ggtacttaca gacagtcaga1800
acaatcggtg tgagatgcca cgcagcttga cactggaagt ctgtcagtgt gacaacaggg1860
gcatctgtgg aacttcttac ccaaccacaa gccctgggac caggtatggc aggccgcact1920
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gagggtcccc tgggtgtccc tgagctgcct gtgtctctgc ctccttccgc atgtggtccc540
aggaaccaca gaggacacat taataactgg aagtaaaact cctgccccag tcacctcaac600
aggctcaaca acagcgacac tagagggaca atcaactgca gcttcttcaa ggacctctaa660
tcaggacata tcagcttcat ctcagaacca ccagactaag agcacggaga ccaccagcaa720
agctcaaacc gacaccctca cgcagatgat gacatcaact cttttttctt ccccaagtgt780
acacaatgtg atggagactg ttacgcagga gacagctcct ccagatgaaa tgaccacatc840
atttccctcc agtgtcacca acacactcat gatgacatca aagactataa caatgacaac900
ctccacagac tccactcttg gaaacacaga agagacatca acagcaggaa ctgaaagttc960
taccccagtg acctcagcag tctcaataac agctggacag gaaggacaat cacgaacaac 1020
ttcctggagg acctctatcc aagacacatc agcttcttct cagaaccact ggactcggag1080
cacgcagacc accagggaat ctcaaaccag caccctaaca cacagaacca cttcaactcc1140
ttctttctct ccaagtgtac acaatgtgac agggactgtt tctcagaaga catctccttc1200
aggtgaaaca gctacctcat ccctctgtag tgtcacaaac acatccatga tgacatcaga1260
gaagataaca gtgacaacct ccacaggctc cactcttgga aacccagggg agacatcatc1320
agtacctgtt actggaagtc ttatgccagt cacctcagca gccttagtaa cagttgatcc1380
agaaggacaa tcaccagcaa ctttctcaag gacttctact caggacacaa cagctttttc1440
taagaaccac cagactcaga gcgtggagac caccagagta tctcaaatca acaccctcaa1500
caccctcaca ccggttacaa catcaactgt tttatcctca ccaagtggat tcaacccaag1560
tggaacagtt tctcaggaga cattcccttc tggtgaaaca accatctcat ccccttccag1620
tgtcagcaat acattcctgg taacatcaaa ggtgttcaga atgccaatct ccagagactc1680
tactcttgga aacacagagg agacatcact atctgtaagt ggaaccattt ctgcaatcac1740
ttccaaagtt tcaaccatat ggtggtcaga cactctgtca acagcactct cccccagttc1800
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aggacggcct catgagagga gctcattctc tccaggtgtg tctcaagaaa tatttactct1920
acatgaaaca acaacatggc cttcctcatt ctccagcaaa ggccacacaa cttggtcaca1980
aacagaactg ccctcaacat caacaggtgc tgccactagg cttgtcacag gaaatccatc2040
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aggagagccc accacatact cctcccacag cacaactctc ccaaaaacaa caggggcagg2160
cgcccagaca caatggacac aagaaacggg gaccactgga gaggctcttc tcagcagccc2220
aagctatagt gtgattcaga tgataaaaac ggccacatcc ccatcttctt cacctatgct2280
ggatagacac acatcacaac aaattacaac ggcaccatca acaaatcatt caacaataca2340
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cccgcagacc acacaagaat cacaaaccac gaggtccgtc tcccccatga ctgacaccaa2460
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cgccatttcc cggatggccc agactcagag gacaggaacc agcagagggt ctgacactat3240
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gaagacagac ggtgggagac gcacagccac atcaccaccc cccacaacct cccagaccat3600
catttccacc attcccagca ctgccatgca cacccgctcc acagctgccc ccatccccat3660
cctgcctgag agaggagttt ccctcttccc ctatggggca ggcgccgggg acctggagtt3720
cgtcaggagg accgtggact tcacctcccc actcttcaag ccggcgactg gcttccccct3780
tggctcctct ctccgtgatt ccctctactt cacagacaat ggccagatca tcttcccaga3840
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ccctgtggcc ctggtggctc cgttctggga cgatgctgac ttctccactg gtcgggggac3960
cacattttat caggaatacg agacgttcta tggtgaacac agcctgctag tccagcaggc4020
cgagtcttgg attagaaaga tgacaaacaa cgggggctac aaggccaggt gggccctaaa4080
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tgggatgcag tgggacgtgg cccagcgctc aggcaacccg gtgctcatgg gcttctctag4260
tggagatggc tatttcgaaa acagcccact gatgtcccag ccagtgtggg agaggtatcg4320
ccctgataga ttcctgaatt ccaactcagg cctccaaggg ctgcagttct acaggctaca4380
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ccaggccacc aacttcatcg cctttgcggc tcagtaccgc tccagcagcc tgggccccgt4980
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agtcctcctg agccgcaacg gctctgaggt ctcggccagc ttcgacggct gggccaccgt5160
ctcggtgatc gcgctctcca acatcctcca cgcctccgcc agcctcccgc ccgagtacca5220
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gcaggtgcac agggggaggc cataaagatc aaacatgcat ggatgggtcc tcacgcagac7200
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tggtttactt caaattaact ctatttaaat aaagtctctc tgactttttg tgtctccaaa7380
a7381
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<212>DNA
<213>人
<400>103
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cacagcacag acctctaccg tgtttctctt ccatccctaa accacttcct taaaatgttt1740
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acagctggct aggacccctc tgccttcctt cccaatcctg actggctcct agggaagggg1980
aaggctcctg gagggcagcc ctacctctcc catgcccttt gccctcctcc ctcgcctcca2040
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gtgggaggga gggcagagct ctgcacactc aaaggctaaa ctggtgtcag tccttttttc2280
ctttgttcca aataaaagat taaaccaaaa aaaaaaaaaa aaa 2323
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<212>DNA
<213>人
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tcacgtgacc cgggcgcgct gcggccgccc gcgcggaccc ggcgagaggc ggcggcggga 60
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atctggaaga agatgggctg aggcccccag ctgccttgga ctgtgttttt cctccataaa540
ttatggcatt tttctgggag gggtggggat tgggggacat gggcattttt cttacttttg600
taattattgg ggggtgtggg gaagagtggt cttgaggggg taataaacct ccttcgggac660
acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 741
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<212>DNA
<213>人
<400>105
cccaggccca ccccacccag cacccctggc gcagggactg ctggaacctg gctgtgcgcg 60
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caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagcaaaaa gacgtcggag aaaagtgccg cgaaaaaatg 1620
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tctgtctata tcgactaaaa aaaaaaaaaa aaa 2373
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<212>DNA
<213>人
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aattcccggc tcggggacct ccacgcaccg cggctagcgc cgacaaccag ctagcgtgca 60
aggcgccgcg gctcagcgcg taccggcggg cttcgaaacc gcagtcctcc ggcgaccccg120
aactccgctc cggagcctca gccccctgga aagtgatccc ggcatccgag agccaagatg180
ccggcccact tgctgcagga cgatatctct agctcctata ccaccaccac caccattaca240
gcgcctccct ccagggtcct gcagaatgga ggagataagt tggagacgat gcccctctac300
ttggaagacg acattcgccc tgatataaaa gatgatatat atgaccccac ctacaaggat360
aaggaaggcc caagccccaa ggttgaatat gtctggagaa acatcatcct tatgtctctg420
ctacacttgg gagccctgta tgggatcact ttgattccta cctgcaagtt ctacacctgg480
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aagttttcag aaacacatgc tgatcctcat aattcccgac gtggcttttt cttctctcac720
gtgggttggc tgcttgtgcg caaacaccca gctgtcaaag agaaggggag tacgctagac780
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cactcctttc cctatgacta ctctgccagt gagtaccgct ggcacatcaa cttcaccaca 1140
ttcttcattg attgcatggc cgccctcggt ctggcctatg accggaagaa agtctccaag 1200
gccgccatct tggccaggat taaaagaacc ggagatggaa actaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaataaaa aaaaaaaaaa aaaa 131權利要求
1.鑒別胰癌的方法，其包含下述步驟
a.獲得含有轉移細胞的樣品；
b.測量與F5、PSCA、ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10或FKBP10標記基因的表達有關的生物標記；
其中在預定截止水平以上或以下的標記基因表達水平是樣品中存在胰癌的指示。
2.權利要求1的方法，其中所述標記基因是F5和PSCA。
3.權利要求2的方法，其中所述標記基因還包含，或被替換為，ITGB6、KLK10、CLDN18、TR10和/或FKBP10。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中使用SEQ ID NO39-41和43-45中的至少一個，測量基因表達。
5.組合物，其含有選自SEQ ID NO39-41和43-45的至少一個分離的序列。
6.用于進行根據(jù)權利要求1-3之一的測定的試劑盒，其含有生物標記檢測試劑。
7.用于進行權利要求1-3之一的方法的微陣列或基因芯片。
8.診斷/預后組合，其包含權利要求1-3或1-3之一所述基因組合的分離的核酸序列、它們的互補體、或其部分，其中所述組合足以測量或表征生物樣品中的基因表達，與來自不同癌或正常組織的細胞相比，所述生物樣品具有轉移細胞。
9.根據(jù)權利要求1-3或1-3之一的方法，還包括測量在樣品中組成型表達的至少一個基因的表達。
全文摘要
本發(fā)明提供了如下鑒別起源不明轉移灶的起源的方法獲得含有轉移細胞的樣品；測量與至少2種不同癌有關的生物標記；將來自生物標記的數(shù)據(jù)組合進算法中，其中所述算法相對參照標準化所述生物標記；和采用截止值，其最優(yōu)化每種生物標記的靈敏度和特異性，使癌的患病率加權和選擇起源組織；基于通過算法測定的最高概率，確定起源，或確定該癌不是源自特定癌集合；和任選地測量對一種或多種其它不同癌特異性的生物標記，并為其它生物標記重復所述步驟。
文檔編號C12Q1/68GK101405406SQ200680043209
公開日2009年4月8日 申請日期2006年9月19日 優(yōu)先權日2005年9月19日
發(fā)明者Y·王, D·塔蘭托夫 申請人:維里德克斯有限責任公司