專利名稱：一種高效香蕉離體快繁新方法
專利說明一種高效香蕉離體快繁新方法 [技術(shù)領(lǐng)域] 本發(fā)明涉及利用巴西香蕉未成熟雄花為外植體離體進(jìn)行快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗的方法。
[背景技術(shù)] 廣義的香蕉包括香蕉(Banana)和大蕉(Plantain)兩大類。香蕉和大蕉屬于芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa)(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)主編.果樹栽培學(xué)各論(南方本).農(nóng)業(yè)出版社.1993104)。幾乎所有食用蕉都是由原始野生尖葉蕉(Musa acuminata Colla)和長(zhǎng)梗蕉(Musa balbisiana Colla)自交或雜交后代進(jìn)化而成的。鮮食香蕉大多為三倍體AAA，即它們的染色體都來自尖葉蕉，是尖葉蕉自交或體細(xì)胞突變的后代。大蕉也是三倍體，染色體組成為AAB或ABB，即它們的染色體來自尖葉蕉和長(zhǎng)梗蕉。除三倍體以外，還有二倍體AA、AB和四倍體AAAA、BBBB，但種類稀少(Samson JA.Tropical Fruits.Londonlongman，1980119)。栽培香蕉(Musa spp.)為單性三倍體(AAA、AAB、ABB)，具有高度不育性。
香蕉為多年生常綠大型草本單子葉植物，地下莖為一粗大球莖，根、葉、花及繁殖用的吸芽由此長(zhǎng)出。最初由中央圓柱組織上的頂芽萌發(fā)，不斷抽生葉片，葉柄上伸，葉鞘緊接為假莖，假莖下面形成球莖，每片葉鞘基部潛伏芽能長(zhǎng)成吸芽，吸芽和母體球莖組成蕉叢。香蕉植株生長(zhǎng)發(fā)育到一定階段，假莖生長(zhǎng)點(diǎn)停止抽葉而進(jìn)行生殖分化，抽出穗狀花序。
栽培香蕉多為三倍體，單性結(jié)實(shí)。一串果穗有果4～18梳，每梳有果指7～35條，梳果由上逐漸變小，蕉果自開花到收獲需65～170天，高溫季節(jié)60～90天可收獲，低溫季節(jié)則需120天以上(農(nóng)業(yè)部發(fā)展南亞熱帶作物辦公室主編.中國(guó)熱帶亞熱帶果樹.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.199849-50)。
香蕉在世界熱帶水果和中國(guó)熱帶水果生產(chǎn)中都占有重要的經(jīng)濟(jì)地位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界香蕉產(chǎn)量在水果中居第3位，僅次于葡萄和柑橘。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2005年全世界120多個(gè)國(guó)家(地區(qū))種植香蕉，收獲面積為443.95萬公頃，總產(chǎn)量達(dá)7246.46萬噸，2004年世界香蕉出口1594萬噸，出口值接近50億美元，是世界貿(mào)易量最大的水果。中國(guó)2004年全國(guó)香蕉種植面積約為28.5萬公頃，產(chǎn)量達(dá)629萬噸，產(chǎn)值為94億元，2005年全國(guó)香蕉種植面積約為27.4萬公頃，產(chǎn)量達(dá)639萬噸，產(chǎn)值超過100億元，從業(yè)人員達(dá)110多萬，香蕉產(chǎn)業(yè)已成為我國(guó)南亞熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)支柱性產(chǎn)業(yè)，在熱區(qū)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有非常重要的地位。
傳統(tǒng)的香蕉繁殖有兩種方法，一種是直接利用母株生長(zhǎng)的吸芽進(jìn)行繁殖，但是該方法由于產(chǎn)生的吸芽速度慢，繁殖系數(shù)低，影響母株的生長(zhǎng)，不適應(yīng)現(xiàn)代大規(guī)模的商品生產(chǎn)已經(jīng)逐漸淘汰，目前只有少數(shù)農(nóng)戶家庭種植還在采用；另一種是利用吸芽球莖人工進(jìn)行繁芽的組織培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)是目前香蕉生產(chǎn)中種苗繁殖的主要手段。該技術(shù)是我國(guó)科研工作者在上世紀(jì)80年代后期由于反季節(jié)香蕉栽培技術(shù)的開發(fā)，市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)香蕉種苗需求量增大，為滿足市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)種苗需要而研發(fā)的。該技術(shù)的應(yīng)用對(duì)我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展起到了極大的推進(jìn)作用，實(shí)現(xiàn)了在較短時(shí)間內(nèi)將優(yōu)良品種大面積推廣，使大規(guī)模商品化香蕉生產(chǎn)變成現(xiàn)實(shí)。但經(jīng)過近20年的應(yīng)用，目前已發(fā)現(xiàn)該方法在生產(chǎn)中存在一些不足，主要存在的問題有 1繼代數(shù)高。香蕉傳統(tǒng)的繁芽組培技術(shù)由于繁殖系數(shù)低，目前只能達(dá)到2.5-3.0左右，所以獲得大量種苗需要多次繼代培養(yǎng)，一般都達(dá)到繼代培養(yǎng)10-12代，如此才能獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。而組培苗隨著繼代數(shù)的增高，種苗質(zhì)量逐漸下降且變異率升高，對(duì)病蟲害抵抗能力降低。但生產(chǎn)中生產(chǎn)者為了追求高的經(jīng)濟(jì)利益及降低成本，往往通過繼代數(shù)量增加來增加種苗產(chǎn)量，因此造成大量劣質(zhì)種苗進(jìn)入市場(chǎng)，損害蕉農(nóng)利益，影響香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
2生產(chǎn)周期長(zhǎng)。目前的香蕉芽繁的組培方法從采集吸芽到12代的商品苗大概需要10-11個(gè)月的時(shí)間，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。
3易帶病毒。現(xiàn)有香蕉種苗生產(chǎn)采用的材料為香蕉球莖芽，球莖生長(zhǎng)于地下土壤中，容易感染多種病菌，雖然經(jīng)過嚴(yán)格篩選消毒，但仍然存在材料帶毒的危險(xiǎn)。為保證生產(chǎn)種苗質(zhì)量，每年所生產(chǎn)的種苗要經(jīng)過病毒檢測(cè)，增加了種苗生產(chǎn)成本。
4造成母株傷害。目前市場(chǎng)上商品化的香蕉組培苗主要采樣時(shí)間集中在每年的3-5月，此時(shí)的香蕉母株正處于高速生長(zhǎng)期，種苗繁殖材料的采集對(duì)香蕉母株會(huì)帶來一定的損傷，影響母株的產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)。
5生產(chǎn)成本高。香蕉組培苗生產(chǎn)是一項(xiàng)勞動(dòng)力密集的產(chǎn)業(yè)，繁殖系數(shù)低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，工廠勞動(dòng)力生產(chǎn)成本占到整個(gè)生產(chǎn)成本的70％以上，勞動(dòng)力生產(chǎn)成本過高。一般生產(chǎn)12代組培苗需要10-11月的時(shí)間，消耗大量的人力和和占用大量的生產(chǎn)資料，增加了生產(chǎn)成本。
以上香蕉組培生產(chǎn)方式中存在的不足和缺點(diǎn)，已經(jīng)開始制約香蕉產(chǎn)業(yè)快速健康的發(fā)展，同時(shí)也制約了香蕉產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步升級(jí)，具體表現(xiàn)有四個(gè)方面第一生產(chǎn)周期長(zhǎng)，市場(chǎng)反應(yīng)慢，不能靈活應(yīng)對(duì)市場(chǎng)需求。第二繼代數(shù)高引發(fā)的種苗品質(zhì)下降，帶來生產(chǎn)上的不良連鎖反應(yīng)。第三取材方法的缺陷導(dǎo)致了香蕉組培苗不能完全脫毒，而且取材當(dāng)年對(duì)母株可能產(chǎn)生傷害而導(dǎo)致產(chǎn)量下降和果實(shí)品質(zhì)降低。第四生產(chǎn)成本高。這種組培方式需要消耗大量人力物力，生產(chǎn)成本高，效率低。因此，開發(fā)一種新的組培技術(shù)來克服以上缺點(diǎn)，保證香蕉產(chǎn)業(yè)長(zhǎng)久健康發(fā)展已成為香蕉生產(chǎn)亟待解決的問題之一。而香蕉未成熟雄花組織培養(yǎng)技術(shù)將可彌補(bǔ)球莖組培苗繁殖方法的缺陷，為香蕉生產(chǎn)提供高質(zhì)量種苗提供保障。
香蕉未成熟雄花組織培養(yǎng)技術(shù)有以下六個(gè)方面的優(yōu)勢(shì) 1繁殖系數(shù)高，生產(chǎn)周期短。香蕉花蕾為無限花序，其頂端分生組織具有強(qiáng)大的原基系統(tǒng)，我們自主開發(fā)的香蕉未成熟雄花組培技術(shù)，繁殖系數(shù)可以達(dá)到25-30的水平。利用香蕉未成熟雄花切片，每株雄花可以切片20-24片，每一個(gè)雄花切片經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷分化成芽25-30個(gè)芽，繁殖系數(shù)高。單個(gè)香蕉未成熟雄花通過切片誘導(dǎo)分化一代就可以產(chǎn)生500-720株香蕉苗。因此生產(chǎn)相同數(shù)量的組培苗生產(chǎn)周期比芽繁芽方法相比縮短了3-4個(gè)月，生產(chǎn)周期大大縮短。
2繼代數(shù)低。由于繁殖系數(shù)高，所以生產(chǎn)相同數(shù)量的組培苗，與傳統(tǒng)組培技術(shù)相比，香蕉未成熟雄花組織培養(yǎng)技術(shù)只需要繼代2-4代，大大降低了組培的繼代數(shù)，因此有效的防止了因?yàn)槔^代數(shù)高而出現(xiàn)的芽纖弱，生長(zhǎng)勢(shì)不均勻，幼芽變白，嚴(yán)重缺綠，缺乏生機(jī)和活力，生長(zhǎng)速度減慢，增殖率降低，變異率高等問題。香蕉未成熟組培苗繼代數(shù)低，出苗整齊健壯，抗病性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，變異率低，生根快。相對(duì)于傳統(tǒng)的組培技術(shù)有較大的優(yōu)勢(shì)。
3不帶病毒。該組織培養(yǎng)技術(shù)采用材料是香蕉未成熟雄花的生長(zhǎng)點(diǎn)，是高速生長(zhǎng)的部位，且被苞片天然嚴(yán)密包被，在自然條件下不帶病毒。
4取材更科學(xué)、簡(jiǎn)單，不傷害取材母株的正常生長(zhǎng)。與吸芽相比，花序組織具有取材方便、滅菌容易、節(jié)省種源等特點(diǎn)，是減少接種初期污染，提高成功率的良好外植體。
5取材和提高產(chǎn)量相結(jié)合。在實(shí)際取材過程中，利用香蕉生產(chǎn)中斷蕾所產(chǎn)生的花蕾，不僅可以獲得繁殖材料，而且還可提高取樣母株的產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了取材和高產(chǎn)技術(shù)的完美結(jié)合。
6花序攜帶方便，有利于國(guó)際種質(zhì)交流，對(duì)培育和引進(jìn)早熟、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)名貴的稀有品種，特別是引進(jìn)外國(guó)的優(yōu)良品種尤其有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[發(fā)明內(nèi)容] 一種高效香蕉繁殖新方法的發(fā)明內(nèi)容包括，外植體的選取、處理、誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的配方、誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)方法、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方、誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)方法以及組培苗催根、馴化及移栽等內(nèi)容。
1.外植體的選取 選取香蕉斷蕾期的新鮮香蕉雄花 2.外植體的處理 逐步剝除香蕉雄花苞片，至到雄花長(zhǎng)度為9-10厘米時(shí)轉(zhuǎn)人超凈工作臺(tái)，在超凈工作臺(tái)中繼續(xù)剝除香蕉雄花苞片，至到雄花長(zhǎng)度為2.0-2.5厘米，此部位的香蕉雄花由于還沒有發(fā)育成熟，因此稱未成熟香蕉雄花。將此部位的未成熟香蕉雄花縱向平均切為兩半，再橫切厚度為1.2毫米的薄片。
3.香蕉未成熟雄花切片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng) 將未成熟雄花切片接種于MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂，pH＝5.3的固體培養(yǎng)基上，25-26℃，黑暗培養(yǎng)。視切片的褐化程度，每5-10天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20-30天，至產(chǎn)生愈傷組織。
4.愈傷組織的分化培養(yǎng) 將產(chǎn)生愈傷組織的香蕉未成熟雄花切片接種于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂，pH＝5.8的固體培養(yǎng)基上。在26-28℃，光強(qiáng)度為1500lx條件下培養(yǎng)，每天光培養(yǎng)12小時(shí)，再黑暗培養(yǎng)12小時(shí)。每10天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)20-40天，至分化產(chǎn)生香蕉小苗。
5.壯苗培養(yǎng) 將分化的小苗轉(zhuǎn)到MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L+30g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂，pH＝5.8的固體培養(yǎng)基上。在26-28℃，光強(qiáng)度為1500-1700lx的條件下進(jìn)行光培養(yǎng)，每15天更換一次培養(yǎng)基。
6.生根培養(yǎng) 經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，將香蕉苗接種于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊5.5g/L，pH＝5.8的培養(yǎng)基上，在28℃條件下，每天光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，連續(xù)培養(yǎng)30-40天至誘導(dǎo)出較高質(zhì)量的根系，成為生根苗。
7.生根苗馴化及移栽 生根苗經(jīng)2-3天的自然光煉苗后，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于營(yíng)養(yǎng)袋中，在大棚育苗2-3個(gè)月，再移栽入大田定植。
結(jié)果分析 1香蕉未成熟雄花在自然生長(zhǎng)的狀態(tài)下不帶細(xì)菌和病毒，在超凈工作臺(tái)小心剝除雄花苞片，至未成熟雄花長(zhǎng)度為2.0厘米時(shí)切片，由于外殖體沒有經(jīng)過消毒的步驟，減少了傷害，極大提高了外殖體的出愈和分化率。
2選取香蕉斷蕾期的新鮮香蕉未成熟雄花切片，得到的切片褐化少，出愈快，出愈多，分化順利。一定要選取新鮮的香蕉雄花，否則切片嚴(yán)重褐化，出愈少和分化困難，極大地影響香蕉組培苗的獲得。
3切片厚度對(duì)出愈和分化也有很重要的影響，太薄的切片褐化后生長(zhǎng)緩慢，容易死亡，出愈率低；切片太厚，厚度超過2毫米時(shí)，切片膨大速度快，快速增大為一團(tuán)，也不易出愈分化，試驗(yàn)中切片厚度在1.2毫米時(shí)出愈和分化達(dá)到最佳。
4利用香蕉未成熟雄花切片，每株雄花可以切片20-24片，每一個(gè)雄花切片通過誘導(dǎo)愈傷分化成芽25-30個(gè)，繁殖系數(shù)高。單個(gè)香蕉未成熟雄花通過切片誘導(dǎo)分化一代就可以產(chǎn)生500-720株香蕉苗，這大大高于香蕉芽繁芽組培技術(shù)的繁殖系數(shù)。
5由于繁殖系數(shù)高，所以生產(chǎn)相同數(shù)量的組培苗，與目前芽繁芽組培技術(shù)相比，香蕉未成熟雄花組織培養(yǎng)技術(shù)只需要繼代2-4代就可以了，大大降低了組培的繼代數(shù)。由于繼代數(shù)很低，因此有效的防止了因?yàn)槔^代數(shù)高而出現(xiàn)的芽纖弱和參差不齊，幼芽變白，嚴(yán)重缺綠，缺乏生機(jī)活力，生長(zhǎng)速度減慢，增殖率降低，變異率高等問題。香蕉未成熟組培苗繼代數(shù)低，出苗整齊健壯，抗病性強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，變異率低，生根快。相對(duì)于芽繁芽的組培技術(shù)有極大的優(yōu)勢(shì)。
[具體實(shí)施方式
] 1材料 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所試驗(yàn)基地采集的巴西香蕉新鮮斷蕾雄花。
2方法 2.1材料的處理 將新鮮采集的香蕉雄花逐步剝除苞片，至到雄花長(zhǎng)度為9-10厘米時(shí)轉(zhuǎn)人超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)中繼續(xù)剝除香蕉雄花苞片，至到雄花長(zhǎng)度為2.0厘米，縱向平均切為兩半，再橫切厚度為1.2毫米薄片。
2.2愈傷組織培養(yǎng) 將切片接種于MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂，pH＝5.3的固體培養(yǎng)基上，25-26℃，黑暗培養(yǎng)，視切片的褐化程度，每5-10天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間20-30天，產(chǎn)生愈傷組織。
2.3分化培養(yǎng) 將生長(zhǎng)愈傷組織的香蕉未成熟雄花切片接種于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂，pH＝5.8的固體培養(yǎng)基上，26-28℃，光培養(yǎng)，強(qiáng)度為1500lx，每10天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間20-40天，分化香蕉小苗。
2.4壯苗培養(yǎng) 將分化的小苗轉(zhuǎn)到MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L+30g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂，pH＝5.8的固體培養(yǎng)基上，26-28℃，光培養(yǎng)，光強(qiáng)度為1500-1700lx，每15天更換一次培養(yǎng)基。
2.5催根培養(yǎng) 經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，將香蕉苗接種于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊5.5g/L，pH＝5.8，28℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，光強(qiáng)度為1500lx。連續(xù)培養(yǎng)30-40天則誘導(dǎo)出較高質(zhì)量的根系，成為生根苗。
2.6生根苗馴化及移栽 生根苗經(jīng)2-3天的自然光溫?zé)捗绾螅磧舾颗囵B(yǎng)基，移栽于營(yíng)養(yǎng)袋中，在大棚育苗2-3個(gè)月，再移栽入大田定植。
權(quán)利要求
1一種高效香蕉繁殖新方法，其發(fā)明特征在于外植體的選取和處理，誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基配方和方法，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配方和方法等。
2根據(jù)權(quán)利要求1所述其外植體選取和處理的特征在于選取香蕉斷蕾期的新鮮香蕉雄花，逐步剝除雄花苞片至雄花長(zhǎng)度為2.0-2.5厘米，將此部位的未成熟雄花縱向平均切為兩半，再橫切厚度為1.2毫米的薄片。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述其誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基配方和方法的特征在于MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂，pH＝5.3的固體培養(yǎng)基。將權(quán)利要求2所敘的切片接種于該固體培養(yǎng)基上，25-26℃，黑暗培養(yǎng)，每5-10天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間20-30天，產(chǎn)生愈傷組織。
4根據(jù)權(quán)利要求1所述的其誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配方和方法的特征在于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂，pH＝5.8的固體培養(yǎng)基。將權(quán)利要求3產(chǎn)生的愈傷組織接種于該固體培養(yǎng)基上，26-28℃，每天光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，每10天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間20-40天，分化香蕉小苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用巴西香蕉未成熟雄花為外植體，離體快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗的方法。采取斷蕾期新鮮香蕉雄花，剝?nèi)∥闯墒觳糠智谐杀∑M(jìn)行組織培養(yǎng)，每片外植體繁殖系數(shù)達(dá)到25－30，大大降低了組培的繼代數(shù)和生產(chǎn)周期，得到高效優(yōu)質(zhì)的組培苗。本技術(shù)由于在取材上的創(chuàng)新和組培技術(shù)含量的升高，降低了生產(chǎn)周期和繼代數(shù)，解決了目前香蕉組培技術(shù)中生產(chǎn)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)成本高、繼代數(shù)高、取材有帶病毒幾個(gè)關(guān)鍵問題。該技術(shù)將促進(jìn)香蕉優(yōu)良種苗的快速繁殖和生產(chǎn)，加速香蕉良種推廣速度，實(shí)現(xiàn)香蕉產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步和快速升級(jí)。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1934934SQ20061014266
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者張建斌, 徐碧玉, 金志強(qiáng), 楊小亮, 賈彩紅, 劉菊華, 王家保, 譚光蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所