專利名稱：納豆激酶的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納豆激酶(nattokinase)的制造方法。
技術(shù)背景血栓性疾病嚴(yán)重威脅著人類的生命與健康，其發(fā)病率及死亡率居各種 疾病之首。溶解血栓是治療這類疾病的首選方法。但當(dāng)前的溶栓劑，如尿 激酶、鏈激酶、重組組織型纖溶酶原激活劑等，存在半衰期短、副作用大、 價(jià)格昂貴等各種缺點(diǎn)，難以成為適用的大眾藥品。1987年須見洋行在日本 的傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆中發(fā)現(xiàn)了 一種具有強(qiáng)烈纖溶活性的酶，定名為納豆激 酶(Nattokinase, NK)。研究表明，納豆激酶是一種絲氨酶蛋白酶(絲氨酸 蛋白酶)，能顯著溶解體內(nèi)外血栓，明顯縮短優(yōu)球蛋白的溶解時(shí)間 (Euglobulinlysis time, ELT),并能刺激靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活劑 (t-PA)，從而更有效地發(fā)揮溶栓效果。因此納豆激酶是一種很有潛力的新 型口服溶栓藥物。目前，納豆激酶的分離純化工藝常采用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法，如 有機(jī)溶劑沉淀、鹽析、離心、凝膠色譜、疏水色譜、離子交換色鐠等純化 方法。從固體發(fā)酵納豆中分離純化納豆激酶的一種先前技術(shù)的工藝為生 理鹽水抽提納豆激酶，加入硫酸銨(硫酸氨銨)在25%飽和度下過夜，再 于4°C ， 7000轉(zhuǎn)/分鐘離心40分鐘，收集上清上5Butyl-Toyoperal疏水柱， 收集活性峰再次進(jìn)行飽和度25%的硫酸銨沉淀，取上清進(jìn)行飽和度60%的 硫酸銨沉淀，然后上CM-Toyopearl離子交換柱，收集活性峰再上 Sephadex-G50,收集活性峰并透析過夜。采用上述工藝制造納豆激酶，收率 低，最終獲得的產(chǎn)品很少。1998年5月12日公告的第5,750,650號(hào)美國(guó)專利揭露了另一種分離純 化納豆激酶的方法從發(fā)酵液中提取納豆激酶時(shí)，采用無水乙醇沉淀、Butyl Sepharose柱層析、脫鹽濃縮后過陰離子交換柱(Mono-Q )，洗脫液再上疏 水層析柱(Alkyl Sepharose )得到回收率為22.0%的純納豆激酶。采用此方 法來分離純化納豆激酶雖然一定程度上提高了純納豆激酶的回收率，但回 收率依然很低。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了 一種回收率較高的納豆激酶的制造方法。本發(fā)明提供一種納豆激酶的制造方法，其包括如下步驟發(fā)酵，將納 豆激酶從納豆菌(natto bacilli)中釋放出來，發(fā)酵液中含有納豆激酶及菌體； 將發(fā)酵液中納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎，釋放出發(fā)酵過程中，卡在細(xì)胞壁的 納豆激酶；將細(xì)胞壁破碎后的發(fā)酵液離心并收集上清液；純化所述上清液， 荻得純化后的納豆激酶溶液。本發(fā)明提供的納豆激酶的制造方法中，包括了細(xì)胞破碎的步驟，即將 納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎，將細(xì)胞壁破碎后，可以將在發(fā)酵過程中被卡在 納豆菌細(xì)胞壁的納豆激酶均釋放出來。因此，相較于先前技術(shù)的納豆激酶 的制造方法，本發(fā)明提供的納豆激酶的制造方法可較大程度上提升納豆激 酶的回收率。而且，針對(duì)同一發(fā)酵方法，本發(fā)明提供的納豆激酶的制造方 法可將納豆激酶的回收率提升40~ 50%。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所提供的納豆激酶的制造方法主要包括發(fā)酵、細(xì)菌破碎、離心 (去除殘?jiān)?、精制(或稱為純化)等步驟，下面將逐步詳述。 本發(fā)明所提供的納豆激酶的制造方法第一實(shí)施方式詳述如下。 1 )發(fā)酵從固體培養(yǎng)基挑取表達(dá)納豆激酶的單菌落接入10毫升的種子培養(yǎng)基 中，150轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)下?lián)u床培養(yǎng)8小時(shí)，按1%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基 中，再于28。C、 150轉(zhuǎn)/分鐘下發(fā)酵罐培養(yǎng)100小時(shí)。發(fā)酵過程中，納豆激 酶會(huì)從納豆菌中釋放出來，液體中含有納豆激酶及菌體。2)纟田』包石皮;爭(zhēng)如上所述，在發(fā)酵過程中，納豆激酶會(huì)從納豆菌中釋放出來。經(jīng)研究 表明，發(fā)酵只能釋放出納豆菌中所含有的部分納豆激酶，約有50%左右的 納豆激酶受到納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁的阻礙，會(huì)卡在納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁而
未能從納豆菌細(xì)胞中釋放出來，因此現(xiàn)有技術(shù)納豆激酶的制造方法無法利 用卡在納豆菌細(xì)胞壁的納豆激酶，因此，總是無法達(dá)到理想的回收率。為解決此問題，本發(fā)明提供了細(xì)胞破碎的步驟，即將納豆菌細(xì)胞的細(xì) 胞壁;皮^爭(zhēng)。將細(xì)胞壁;皮石卒后，可以將先前4支術(shù)中一皮卡在納豆菌細(xì)力包壁的納 豆激酶均釋放出來，因此，可較大程度上提升納豆激酶的回收率。本發(fā)明提供的細(xì)胞破碎步驟的第一種實(shí)施方式為瞬間(一般為1秒 以內(nèi))改變發(fā)酵液所處環(huán)境的壓力，例如，可瞬間提升至2000磅/平方英寸 (Psi)再瞬間降至常壓，以使納豆菌細(xì)胞壁破碎，此步驟重復(fù)進(jìn)行，以使 納豆菌細(xì)胞充分破碎。3) 離心用冷凍離心機(jī)將發(fā)酵液于0。C下以2000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)的速度離心8分鐘，收集上清液，于上清液中加入10。/。飽和度的硫酸銨(NH4)2S04沉淀，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清液，繼續(xù)在上清液中加入硫酸銨至60%的飽和度， 2000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集沉淀，將沉淀重懸于IO毫摩爾濃度、pH值為6的磷 酸緩沖液中，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集上清液，于0。C保存?zhèn)溆谩?) 精制，即純化用層析系統(tǒng)將上清液以10公分/小時(shí)(cm/h )的線速度加入凝膠層析柱 中，用10毫摩爾濃度(mM)的磷酸緩沖液以相同的線速度洗滌至出峰完 畢，用紫外檢測(cè)儀于波長(zhǎng)為280納米和260納米進(jìn)行檢測(cè)，收集保留體積 為9毫升處的洗脫液，收集液體積為3毫升，此步驟可稱作凝膠層析分離。5) 制成高純度納豆激酶產(chǎn)品將精制步驟中收集得到的洗脫液放置于去離子水中進(jìn)行透析脫鹽16小 時(shí)后，置于-2(TC冰箱下冷凍12小時(shí)將其進(jìn)行冷凍干燥，干燥時(shí)間為24小 時(shí)，即可得到高純度的納豆激酶產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的納豆激酶的制造方法第二實(shí)施方式詳述如下。1) 發(fā)酵從固體培養(yǎng)基挑取表達(dá)納豆激酶的單菌落接入200毫升的種子培養(yǎng)基 中，300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm )下?lián)u床培養(yǎng)25小時(shí)，按5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng) 基中，再于37。C、 300轉(zhuǎn)/分鐘下發(fā)酵罐培養(yǎng)150小時(shí)。2) 細(xì)胞破碎
本實(shí)施方式中，細(xì)胞破碎的步驟為將發(fā)酵液反復(fù)冷凍，將溫度降至-rc以下，形成水冰晶，以刺破納豆菌細(xì)胞壁。
3) 離心
用冷凍離心才幾將發(fā)酵液于20°C下以10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心15分鐘， 收集上清液，于上清液中加入40。/。飽和度的硫酸銨(NH4)2S04沉淀，10000 轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清液，繼續(xù)在上清液中加入硫酸銨(NH4)2S04至85%的飽 和度，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集沉淀，將沉淀重懸于100毫摩爾濃 度、pH值為8的磷酸緩沖液中，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清液，于20。C保 存?zhèn)溆谩?br> 4) 精制，即純化
用層析系統(tǒng)將上清液以100公分/小時(shí)(cm/h)的線速度加入凝膠層析 柱中，用200毫摩爾濃度的磷酸緩沖液以相同的線速度洗滌至出峰完畢， 用紫外檢測(cè)儀于波長(zhǎng)為280納米和260納米進(jìn)行檢測(cè)，收集保留體積為15 毫升處的洗脫液，收集液體積為6毫升，此步驟可稱作凝膠層析分離。
5 )制成高純度納豆激酶產(chǎn)品
將精制步驟中收集得到的洗脫液放置于去離子水中進(jìn)行透析脫鹽32小 時(shí)后，置于-2(TC水箱下冷凍24小時(shí)將其進(jìn)行冷凍干燥，干燥時(shí)間為48小 時(shí)，即得到高純度的納豆激酶產(chǎn)品。
本發(fā)明所提供的納豆激酶的制造方法第三實(shí)施方式詳述如下。
1 )發(fā)酵
從固體培養(yǎng)基挑取表達(dá)納豆激酶的單菌落接入50毫升的種子培養(yǎng)基 中，240轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)下?lián)u床培養(yǎng)10小時(shí)，按4%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基 中，再于30。C、 220轉(zhuǎn)/分鐘下發(fā)酵罐培養(yǎng)120小時(shí)。
2) 細(xì)胞破碎
本實(shí)施方式中，細(xì)胞破碎的步驟為于發(fā)酵液中加入分解酶，以溶解 納豆菌細(xì)胞壁，此步驟中所述的分解酶可以選擇溶酶體(Lysosome)或酰 胺酶(Amidase)或葡糖苦酶(Glucosidase )等。
3) 離心
用冷凍離心機(jī)將發(fā)酵液于4°C下以8000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm )的速度離心10 分鐘，收集上清液，于上清液中加入20%飽和度的硫酸銨沉淀，8000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心收集上清液，繼續(xù)在上清液中加入硫酸銨至70%的飽和度，8000
轉(zhuǎn)/分鐘離心收集沉淀，將沉淀重懸于70毫摩爾濃度(mM)、 pH值為6.4 的磷酸緩沖液中，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集上清液，于4。C保存?zhèn)溆谩?) 精制，即純化用層析系統(tǒng)將上清液以30公分/小時(shí)(cm/h )的線速度加入凝膠層析柱 中，用40毫摩爾濃度(mM)的磷酸緩沖液以相同的線速度洗滌至出峰完 畢，用紫外檢測(cè)儀于波長(zhǎng)為280納米和260納米進(jìn)行檢測(cè)，收集保留體積 為10毫升處的洗脫液，收集液體積為5毫升，此步驟可稱作凝膠層析分離。5) 制成高純度納豆激酶產(chǎn)品將精制步驟中收集得到的洗脫液放置于去離子水中進(jìn)行透析脫鹽20小 時(shí)后，置于-2(TC冰箱下冷凍20小時(shí)將其進(jìn)行冷凍干燥，干燥時(shí)間為40小 時(shí)，即得到高純度的納豆激酶產(chǎn)品。綜上所述，本發(fā)明提供的納豆激酶的制造方法包括如下步驟1) 發(fā)酵，將納豆激酶從納豆菌中釋放出來，發(fā)酵液中含有納豆激酶及菌體，從固體培養(yǎng)基挑取表達(dá)納豆激酶的單菌落接入10-200亳升的種子培 養(yǎng)基中，150- 300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)下?lián)u床培養(yǎng)8 ~ 25小時(shí)，按1%~5%接 種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，再于28~37°C、 150 - 300轉(zhuǎn)/分鐘下發(fā)酵罐培養(yǎng) 100- 150小時(shí)；2) 細(xì)胞破碎，即將納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎本發(fā)明提供的細(xì)胞破碎步驟的第一種實(shí)施方式為瞬間(一般為1秒 以內(nèi))改變發(fā)酵液所處環(huán)境的壓力，例如，可瞬間提升至2000磅/平方英寸 (Psi)再瞬間降至常壓，以使納豆菌細(xì)胞壁破碎，此步驟重復(fù)進(jìn)行，以使 納豆菌細(xì)胞破碎充分；本發(fā)明提供的細(xì)胞破碎步驟的第二種實(shí)施方式為將發(fā)酵液反復(fù)冷凍， 將溫度降至-l。C以下，形成水冰晶，以刺破納豆菌細(xì)胞壁；本發(fā)明提供的細(xì)胞破碎步驟的第三種實(shí)施方式為于發(fā)酵液中加入分 解酶，以溶解納豆菌細(xì)胞壁，此步驟中所述的分解酶可以選擇溶酶體或酰胺酶或葡糖苷酶等；而且本發(fā)明提供的納豆激酶的制造方法中，細(xì)胞破碎的步驟并不限于 上述三種細(xì)胞破碎的方式；3) 離心
用冷凍離心才幾將發(fā)酵液于0 ~ 20°C下以2000 ~ 10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm )的 速度離心8~15分鐘，收集上清液，于上清液中加入10~40%飽和度的硫 酸銨沉淀，2000 ~ 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集上清液，繼續(xù)在上清液中加入硫 酸銨至60~85%的飽和度，2000- 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集沉淀，將沉淀重 懸于10~ 100毫摩爾濃度、pH值為6~8的磷酸緩沖液中，2000- 10000轉(zhuǎn) /分鐘離心10 30分鐘收集上清液，于0 20。C保存?zhèn)溆茫?br> 4) 精制，即純化
用層析系統(tǒng)將上清液以10~100公分/小時(shí)(cm/h)的線速度加入凝膠 層析柱中，用10-200毫摩爾濃度的磷酸緩沖液以相同的線速度洗滌至出 峰完畢，用紫外檢測(cè)儀于波長(zhǎng)為280納米和260納米進(jìn)行檢測(cè)，收集保留 體積為9~ 15毫升處的洗脫液，收集液體積為3 6毫升，此步驟可稱作凝 膠層析分離；
5) 制成高純度納豆激酶產(chǎn)品
將精制步驟中收集得到的洗脫液放置于去離子水中進(jìn)行透析脫鹽16 ~ 32小時(shí)后，置于-2(TC冰箱下冷凍12-24小時(shí)將其進(jìn)行冷凍干燥，干燥時(shí) 間為24-48小時(shí)，即得到高純度的納豆激酶產(chǎn)品。
另外，本發(fā)明的發(fā)酵、離心、純化以及制成高純度納豆激酶產(chǎn)品的步 驟并不限于上述實(shí)施方式所述，可以采用任何一種現(xiàn)有技術(shù)所提供的方法。
如上所述，本發(fā)明提供的納豆激酶的制造方法中，包括了細(xì)胞破碎的 步驟，即將納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎，將細(xì)胞壁破碎后，可以將在發(fā)酵過 程中被卡在納豆菌細(xì)胞壁的納豆激酶均釋放出來。因此，相較于現(xiàn)有技術(shù) 的納豆激酶的制造方法，本發(fā)明提供的納豆激酶的制造方法可較大程度上 提升納豆激酶的回收率。而且，針對(duì)同一發(fā)酵方法，本發(fā)明提供的納豆激 酶的制造方法可將納豆激酶的回收率提升40~ 50%。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施方式描述如上，然其并非用以限定本發(fā)明， 任何熟悉本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，亦可 做些許變動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所附的權(quán)利要求書的范圍 為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種納豆激酶的制造方法，其包括發(fā)酵，將納豆激酶從納豆菌中釋放出來，使發(fā)酵液中含有納豆激酶及納豆菌細(xì)胞；將發(fā)酵液中納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎，釋放出發(fā)酵過程中，卡在細(xì)胞壁的納豆激酶；以及將細(xì)胞壁破碎后的發(fā)酵液離心并收集上清液以制得納豆激酶溶液。
2. 權(quán)利要求1所述的納豆激酶的制造方法，其進(jìn)一步包括純化所述 的上清液，以獲得純化后的納豆激酶溶液。
3. 權(quán)利要求1所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述細(xì)胞壁破碎的 步驟包括于1秒內(nèi)改變發(fā)酵液所處環(huán)境的壓力，以使納豆菌細(xì)胞壁破碎。
4. 權(quán)利要求3所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述細(xì)胞壁破碎的 步驟中，改變發(fā)酵液所處環(huán)境的壓力為將發(fā)酵液所處環(huán)境的壓力于約1秒 內(nèi)提升至約2000磅/平方英寸(Psi)再瞬間降至常壓。
5. 權(quán)利要求3所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述細(xì)胞壁破碎的 步驟包括多個(gè)重復(fù)的約1秒內(nèi)改變發(fā)酵液所處環(huán)境的壓力的步驟。
6. 權(quán)利要求1所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述細(xì)胞壁破碎的步驟包括將發(fā)酵液反復(fù)冷凍，將溫度降至約-rc以下，形成水水晶，以刺破納豆菌細(xì)胞壁。
7. 權(quán)利要求1所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述細(xì)胞壁破碎的 步驟包括于發(fā)酵液中加入分解酶，以溶解納豆菌細(xì)胞壁。
8. 權(quán)利要求7所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述分解酶為溶酶 體(Lysosome)或酰胺酶(Amidase )或葡糖芬酶(Glucosidase )。
9. 權(quán)利要求1所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述的發(fā)酵步驟包 括從固體培養(yǎng)基挑取表達(dá)納豆激酶的單菌落接入約10-200毫升的種子 培養(yǎng)基中，約150 ~ 300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)下?lián)u床培養(yǎng)約8 ~ 25小時(shí)，按約1 % ~ 5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，再于約28 ~ 37°C 、 150 ~ 300轉(zhuǎn)/分鐘(rpm )下發(fā)酵罐培養(yǎng)約100- 150小時(shí)。
10. 權(quán)利要求1所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述的離心步驟包 括用冷凍離心才幾將發(fā)酵液于約0 ~ 2CTC下以約2000 ~ 10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm )的速度離心約8~ 15分鐘，收集上清液，于上清液中加入約10~40%飽 和度的硫酸銨(NH4)2S04沉淀，約2000~ 10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心收集上 清液，繼續(xù)在上清液中加入石克酸銨至約60 ~ 85%的飽和度，約2000 ~ 10000 轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心收集沉淀，將沉淀重懸于約10 100毫摩爾濃度(mM )、pH值約為6~8的磷酸緩沖液中，約2000- 10000轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)離心 約10~30分鐘收集上清液，于約0 20。C保存?zhèn)溆谩?br> 11. 權(quán)利要求2所述的納豆激酶的制造方法，其中，所述的純化步驟包 括用層析系統(tǒng)將上清液以約10 ~ 100公分/小時(shí)(cm/h )的線速度加入凝 膠層析柱中，用約10-200毫摩爾濃度(mM)的磷酸緩沖液以相同的線速 度洗滌至出峰完畢，用紫外檢測(cè)儀于波長(zhǎng)為約280納米(nm)和約260納 米(nm)進(jìn)行檢測(cè)，收集保留體積為約9~ 15毫升(ml )處的洗脫液，收 集液體積為約3 6毫升(ml)，此步驟可稱作凝膠層析分離。
12. 權(quán)利要求1所述的納豆激酶的制造方法，其中，該納豆激酶的制造 方法進(jìn)一步包括如下步驟將納豆激酶溶液放在去離子水(離子水)中透 析脫鹽然后干燥而制得納豆激酶產(chǎn)品。
13. 權(quán)利要求11所述的納豆激酶的制造方法，其步驟進(jìn)一步包括將 精制步驟中收集得到的洗脫液放置于去離子水中進(jìn)行透析脫鹽約16-32小 時(shí)后，置于-2(TC冰箱下冷凍約12 24小時(shí)將其進(jìn)行冷凍干燥，干燥時(shí)間為 約24 ~ 48小時(shí)，即得到高純度的納豆激酶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明為一種納豆激酶的制造方法，其包括如下步驟發(fā)酵，將納豆激酶從納豆菌中釋放出來，發(fā)酵液中含有納豆激酶及菌體；將發(fā)酵液中納豆菌細(xì)胞的細(xì)胞壁破碎，釋放出發(fā)酵過程中，卡在細(xì)胞壁的納豆激酶；將細(xì)胞壁破碎后的發(fā)酵液離心并收集上清液；以及，純化所述上清液，獲得純化后的納豆激酶溶液。采用本發(fā)明的納豆激酶的制造方法，可有效提升納豆激酶的回收率。
文檔編號(hào)C12N9/50GK101117631SQ20061010911
公開日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日
發(fā)明者呂志翼, 楊文仁, 鄭俊明 申請(qǐng)人:人宇生物科技股份有限公司