專利名稱：永生化豬肝細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于生物人工肝的永生化豬肝細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)：
人工肝是公認(rèn)為治療肝衰竭的有效途徑之一，在臨床上得到廣泛的應(yīng)用；而且，生物人工肝是目前人工肝研究的熱點(diǎn)和發(fā)展方向。由于豬肝細(xì)胞的大小和結(jié)構(gòu)與人肝細(xì)胞相似，其生物功能和免疫功能與人肝細(xì)胞相似有較高的代謝活性，因而，大多數(shù)動(dòng)物和臨床的研究都是使用原代豬肝細(xì)胞。雖然原代豬肝細(xì)胞來(lái)源豐富，容易大量獲??；然而，由于原代肝細(xì)胞的在體外存活時(shí)間短、傳代困難、及質(zhì)量控制困難等不足之處，限制了生物型人工肝的發(fā)展。獲得大量的、高活性的豬肝細(xì)胞成了生物人工肝的臨床應(yīng)用的關(guān)鍵步驟和技術(shù)。目前，絕大多數(shù)均采用seglen的兩步灌流法或者改良的膠原酶灌流法，得到大量的原代的豬肝細(xì)胞；并且，采用該方法需要的成本高，且耗時(shí)長(zhǎng)，仍有一部分(5-10％)的死細(xì)胞。為此，試圖通過(guò)細(xì)胞永生化的技術(shù)，得到能夠無(wú)限傳代，具有原代豬肝細(xì)胞功能的豬肝細(xì)胞系。國(guó)外，也曾經(jīng)報(bào)道建立了永生化豬肝細(xì)胞，先構(gòu)建含SV40大T抗原基因的SV40LT/Bluescript SK重組載體，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將重組載體倒入到原代豬肝細(xì)胞，經(jīng)過(guò)藥物壓力篩選獲得永生化豬肝細(xì)胞，該細(xì)胞傳代60代，具有P450活性，尿素合成等一定的肝細(xì)胞功能，無(wú)致瘤性。但是由于該細(xì)胞在傳代過(guò)程中失去分泌白蛋白的功能，后來(lái)也未見(jiàn)該細(xì)胞在基礎(chǔ)或臨床上的應(yīng)用報(bào)道。為了能夠獲得可以持久表達(dá)白蛋白等具有原代豬肝細(xì)胞功能的豬肝細(xì)胞系，本發(fā)明的目的就是改進(jìn)豬肝細(xì)胞永生化的方法，而獲得無(wú)致瘤性、具有分泌白蛋白等肝細(xì)胞特異功能的永生化豬肝細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種永生化豬肝細(xì)胞的制備方法，該方法主要包括以下步驟(1)用Dispase-膠原酶灌流法分離豬的肝臟組織，得到高活率的新鮮原代豬肝細(xì)胞，經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)后更換培養(yǎng)液，在濃度為8ūg/ml的polybrene存在下，用含SV40大T抗原的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清對(duì)原代豬肝細(xì)胞進(jìn)行感染，1周后，用500ūg/ml的G418進(jìn)行藥物壓力篩選，待細(xì)胞克隆出現(xiàn)并生長(zhǎng)至1.0-2.0cm時(shí)，挑取單個(gè)克隆的細(xì)胞接種于6孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得能夠傳代的豬肝細(xì)胞。
(2)在濃度為8ūg/ml的polybrene存在下，用含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清對(duì)能夠傳代的豬肝細(xì)胞進(jìn)行再次感染，1周后，用2ūg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行藥物壓力篩選，待細(xì)胞克隆出現(xiàn)并生長(zhǎng)至1.0-2.0cm左右時(shí)，挑取單個(gè)克隆的細(xì)胞接種于6孔板，繼而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得永生化豬肝細(xì)胞。
上述步驟(1)中所述含SV40大T抗原重組病毒載體的逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建方法是以SV40 DNAstrain 776為模板，用PCR方法擴(kuò)增約2400bp的SV40大T基因的DNA片段，經(jīng)EcoRI/BamH I內(nèi)切酶的酶切、克隆、測(cè)序，獲得SV40 LT/pLXSN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
上述步驟(2)中所述含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法是用EcoRI內(nèi)切酶將hTERT從PIRES2-EGFP-hTERT亞克隆至pLPCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，獲得hTERT/pLPCX重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣沉淀法分別將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SV40 LT/pLXSN和hTERT/pLPCX轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PT67細(xì)胞，分別經(jīng)過(guò)G418和嘌呤霉素藥物篩選，獲得耐G418和嘌呤霉素藥物的兩種產(chǎn)毒細(xì)胞株，含SV40大T抗原的高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清，以及人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清。
本發(fā)明采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法將SV40大T抗原基因和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入到原代豬肝細(xì)胞，建立了永生化豬肝細(xì)胞系。所獲得的永生化豬肝細(xì)胞具有原代豬肝細(xì)胞的類似的典型形態(tài)學(xué)特征，和如氨代謝、尿素合成等生物學(xué)功能，傳代100代后，仍能夠繼續(xù)分泌白蛋白，且不具有致瘤性，細(xì)胞增殖速度快，每隔6小時(shí)細(xì)胞數(shù)增加一倍。
具體實(shí)施例方式
1、含SV40大T抗原重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建以上游引物5’-GCCCAGGATCCTTAACAACAACAACAAT-3’，下游引物5’-ACGCTGAATTCCCTCTGAGCTAT-3’為引物，以SV40DNA(strain 776)為模板，用高保真長(zhǎng)片斷PCR方法擴(kuò)增約2400bp的SV40大T DNA片段，分別經(jīng)EcoR I/BamH I內(nèi)切酶雙酶切后，插入至pLXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的EcoR I/BamH I位點(diǎn)；然后，用T4連接酶22℃連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5-alpha大腸桿菌，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)x-gal篩選，挑選無(wú)色菌落接種于3ml LB液中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒；經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，序列準(zhǔn)確無(wú)誤后，將含有SV40 LT重組質(zhì)粒的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用Endotoxin-Free的質(zhì)粒純化試劑盒純化SV40 LT/pLXSN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，供生產(chǎn)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒用。
2、含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建用EcoR I內(nèi)切酶酶切PIRES2-EGFP-hTERT質(zhì)粒得到hTERT cDNA片段，去磷酸化后，將其亞克隆至pLPCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多克隆位點(diǎn)的EcoR I位點(diǎn)；然后，用T4連接酶22℃連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5-alpha大腸桿菌，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)x-gal篩選，挑選無(wú)色菌落接種于3ml LB液中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒；經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，序列準(zhǔn)確無(wú)誤后，將含有hTERT重組質(zhì)粒的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用Endotoxin-Free的質(zhì)粒純化試劑盒純化hTERT/pLPCX重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，供生產(chǎn)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒用。
3、產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞株的建立、篩選，以及病毒滴度的測(cè)定將含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(hTERT/pLPCX)和含SV40大T抗原重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(SV40 LT/pLXSN)各10ūg，分別用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PT67細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，用10％DMSO處理2分鐘，換新鮮培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染72h后，經(jīng)轉(zhuǎn)染hTERT/pLPCX的細(xì)胞用4ūg/ml的嘌呤霉素，經(jīng)SV40 LT/pLXSN用500ūg/ml的G418進(jìn)行藥物壓力篩選1-3周，待細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至1.0-2.0cm時(shí)，挑取細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得耐G418和嘌呤霉素藥物的兩種產(chǎn)毒細(xì)胞株；同時(shí)收集培養(yǎng)上清液過(guò)0.45ptm的低蛋白吸附的一次性濾器，分裝后置-70℃保存。
生長(zhǎng)狀態(tài)良好的NIH 3T3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24h至60％匯合，將制備好的兩種病毒液相應(yīng)作10-2、10-4、10-6倍稀釋，加入polybrene至終濃度為8ūg/ml。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，將稀釋好的1ml的病毒液分別加入到NIH 3T3細(xì)胞培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)5h，補(bǔ)加2ml含10％胎牛血清的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24h，更換含10％胎牛血清的培養(yǎng)基，每3d，分別更換為含4ūg/ml的嘌呤霉素和500ūg/ml的G418培養(yǎng)液，培養(yǎng)14d待長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的集落后，傾去培養(yǎng)液，以純甲醛固定后用Giemsa染色并計(jì)數(shù)，得到兩種細(xì)胞上清的病毒滴度，含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(hTERT/pLPCX)和含SV40大T抗原重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(SV40LT/pLXSN)的細(xì)胞上清的病毒滴度分別為2.0×107和8.0×105。
4、原代豬肝細(xì)胞的分離及其永生化采用Dispase-膠原酶四步灌流法分離杜洛克豬肝組織，得到較高活率的新鮮原代豬肝細(xì)胞。將新鮮分離的豬肝細(xì)胞以8.0×105個(gè)濃度接種到T25塑料培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液中含10mg/L HGF，10ug/L EGF，250IU/L胰島素、200ug/L地塞米松，2mmol/L的谷氨酰胺，10％的胎牛血清，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中。
24h后更換培養(yǎng)液，用含SV40大T抗原的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清，對(duì)新鮮培養(yǎng)的原代豬肝細(xì)胞進(jìn)行感染(polybrene濃度為8ūg/ml)，1周后用500ūg/ml的G418進(jìn)行藥物壓力篩選4周，細(xì)胞克隆出現(xiàn)后，待細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至1.0-2.0cm時(shí)，挑取細(xì)胞克隆接種于6孔板，繼而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
再用含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清對(duì)能夠傳代的豬肝細(xì)胞進(jìn)行再次感染(polybrene濃度為8ūg/ml)，1周后用2ūg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行藥物壓力篩選，待細(xì)胞克隆生長(zhǎng)至1.0-2.0cm，挑取細(xì)胞克隆接種于6孔板，繼而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
進(jìn)一步做細(xì)胞形態(tài)學(xué)，生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定。
普通光鏡的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖較快，呈橢圓形，梭形。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)永生化豬肝細(xì)胞具有原代豬肝細(xì)胞的大多數(shù)典型特征，如胞漿內(nèi)含有豐富的糖原顆粒、大量的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞間可見(jiàn)毛細(xì)膽管的形成以及各種細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)和典型的雙核細(xì)胞。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)白蛋白，al抗胰蛋白，asialoglycoprotein receptor，b-actin的mRNA的表達(dá)，以及端粒酶的mRNA的表達(dá)，SV40LT的mRNA的表達(dá)。并具有尿素合成和P450活性的生物學(xué)功能。
Western blot檢測(cè)到永生化豬肝細(xì)胞的細(xì)胞抽提物中白蛋白的表達(dá)，端粒酶和SV40LT蛋白的表達(dá)，永生化豬肝細(xì)胞傳代100代后，用ELISA定量法仍然可以檢測(cè)到永生化豬肝細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清豬的白蛋白。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察結(jié)果表明永生化豬肝細(xì)胞系典型的“S”特征，傳代一次只需3～4天時(shí)間，每隔6小時(shí)細(xì)胞數(shù)增加一倍。永生化豬肝細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)，6個(gè)月后無(wú)腫瘤形成。以上實(shí)驗(yàn)均表明永生化豬肝細(xì)胞具有與原代豬肝細(xì)胞的類似的形態(tài)和生物學(xué)功能，永生化豬肝細(xì)胞同樣具有表達(dá)和分泌ALB，尿素合成的能力、以及細(xì)胞色素P450活性，并且無(wú)潛在的致瘤性。
本發(fā)明方法所制備的永生化豬肝細(xì)胞作為生物型人工肝的肝細(xì)胞材料在生物型人工肝中起著重要作用，將為生物人工肝、細(xì)胞移植及體外藥物代謝模型等提供理想的肝細(xì)胞源。
權(quán)利要求
1.永生化豬肝細(xì)胞的制備方法，其特征在于以下步驟(1)用Dispase-膠原酶灌流法分離豬的肝臟組織，得到高活率的新鮮原代豬肝細(xì)胞，經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)后更換培養(yǎng)液，在濃度為8ūg/ml的polybrene存在下，用含SV40大T抗原的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清對(duì)原代豬肝細(xì)胞進(jìn)行感染，1周后，用500ūg/ml的G418進(jìn)行藥物壓力篩選，待細(xì)胞克隆出現(xiàn)并生長(zhǎng)至1.0-2.0cm時(shí)，挑取單個(gè)克隆的細(xì)胞接種于6孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得能夠傳代的豬肝細(xì)胞。(2)在濃度為8ūg/ml的polybrene存在下，用含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清對(duì)能夠傳代的豬肝細(xì)胞進(jìn)行再次感染，1周后，用2ūg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行藥物壓力篩選，待細(xì)胞克隆出現(xiàn)并生長(zhǎng)至1.0-2.0cm時(shí)，挑取單個(gè)克隆的細(xì)胞接種于6孔板，繼而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得永生化豬肝細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求1所述永生化豬肝細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述含SV40大T抗原重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法是以SV40DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增約2400bp的SV40大T基因的DNA片段，經(jīng)EcoR I/BamH I內(nèi)切酶的酶切、克隆、測(cè)序，獲得SV40LT/pLXSN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
3.按權(quán)利要求1所述永生化豬肝細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法是用EcoR I內(nèi)切酶將hTERT從PIRES2-EGFP-hTERT亞克隆至pLPCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，獲得hTERT/pLPCX重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
4.按權(quán)利要求1所述永生化豬肝細(xì)胞的制備方法，其特征在于用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣沉淀法分別將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SV40LT/pLXSN和hTERT/pLPCX轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PT67細(xì)胞，分別經(jīng)過(guò)G418和嘌呤霉素藥物篩選，獲得耐G418和嘌呤霉素藥物的兩種產(chǎn)毒細(xì)胞株，含SV40大T抗原的高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清，以及人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清。
全文摘要
永生化豬肝細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟用Dispase－膠原酶灌流法獲高活率的新鮮原代豬肝細(xì)胞，經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)后，在濃度為8ūg/ml的polybrene存在下，用含SV40大T抗原的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清對(duì)原代豬肝細(xì)胞進(jìn)行感染，1周后，用500ūg/ml的G418進(jìn)行藥物壓力篩選，待細(xì)胞克隆出現(xiàn)并生長(zhǎng)至1.0－2.0cm時(shí)，挑取單個(gè)克隆的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得能夠傳代的豬肝細(xì)胞。在濃度為8ūg/ml的polybrene存在下，用含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞上清對(duì)能夠傳代的豬肝細(xì)胞進(jìn)行再次感染，1周后，用2ūg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行藥物壓力篩選，待細(xì)胞克隆出現(xiàn)并生長(zhǎng)至1.0－2.0cm左右時(shí)，挑取單個(gè)克隆的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，獲永生化豬肝細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1869205SQ20061005085
公開(kāi)日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2006年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月23日
發(fā)明者李蘭娟, 潘小平 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)