專利名稱：一種乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生態(tài)制劑是指攝入動物體內(nèi)可以促進動物胃腸道微生態(tài)平衡或增強非特異性免疫功能來預(yù)防疾病，間接起到促進動物生長作用和提高飼料轉(zhuǎn)化率的活性微生物培養(yǎng)物。研究表明，以乳酸菌為主的微生態(tài)制劑可以替代飼料中添加的抗生素。飼喂含微生態(tài)制劑的飼料可以大大減少抗生素的使用量，避免抗生素在動物體內(nèi)的高殘留問題，提高肉類產(chǎn)品的質(zhì)量，對我國養(yǎng)殖業(yè)和肉類出口有重大的意義。
乳酸菌是微生態(tài)制劑中最重要的一類，可以促進營養(yǎng)物的消化吸收，產(chǎn)生乳酸等物質(zhì)抑制腸道腐敗菌、致病菌的繁殖，抑制腸道感染，解除腹瀉，并具有免疫賦活等作用。但一般乳酸菌對干燥、高溫、胃酸和膽汁等不良環(huán)境因子的抗性差，能活著進入腸道的乳酸菌種類和數(shù)量不多，目前市場上大部分產(chǎn)品都存在活菌數(shù)衰減的問題。
由于抗生素的藥殘問題，微生態(tài)制劑取代抗生素作為飼料添加劑越來越普及。微生態(tài)制劑作為安全的生物制品，在飼料中添加可以預(yù)防和治療動物胃腸道感染，增強動物免疫力，促進動物生長，不存在使用抗生素時的體內(nèi)藥物殘留問題，美國準(zhǔn)許直接飼喂的微生物已有40多種，年使用量在10000噸以上；在歐洲僅法國市場上銷售的微生態(tài)制劑品種就不下50個；日本估計使用量也在1000噸以上；我國對微生態(tài)制劑的開發(fā)利用起步比較晚，盡管發(fā)展比較快，但一直都沒有比較理想的產(chǎn)品面世，進口的產(chǎn)品價格比較昂貴，所以用量并不高，目前年使用量也在1000噸左右。
乳酸菌在維護人和高等動物機體健康方面的作用為越來越多的研究工作者所注目，目前在食品、飲料、飼料、醫(yī)藥等方面已廣泛應(yīng)用。目前我國市場上的微生態(tài)制劑產(chǎn)品大部分都為性能較差的枯草芽孢桿菌制劑或地衣芽孢桿菌制劑，現(xiàn)有的乳酸菌制劑也大都因?qū)Σ涣辑h(huán)境抗性差而產(chǎn)品性狀極不穩(wěn)定，因而在對抗生素的取代方面無根本性進展。我國飼料行業(yè)微生態(tài)制劑的生產(chǎn)除菌種比較落后外，生產(chǎn)廠家大都采用固體發(fā)酵法生產(chǎn)微生態(tài)制劑，生產(chǎn)出來的產(chǎn)品穩(wěn)定性較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有微生態(tài)制劑存在活菌數(shù)衰減的問題，采用能夠耐熱、耐干燥和耐酸的乳酸芽孢桿菌制備新的微生態(tài)制劑，以克服活菌數(shù)衰減的問題。
本發(fā)明的另一個目的提供上述微生態(tài)制劑的制備方法，利用該方法生產(chǎn)的微生態(tài)制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性比較好。
本發(fā)明的進一步目的是提供上述微生態(tài)制劑在制備動物生長促進劑或胃腸藥物中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用產(chǎn)芽孢乳酸桿菌為出發(fā)菌種，利用液體發(fā)酵法進行菌種培養(yǎng)。先對菌種進行擴大培養(yǎng)，然后接種到發(fā)酵罐中發(fā)酵，結(jié)束后采用離心機離心收集菌體，然后添加載體進行氣流干燥，最大限度的實現(xiàn)了菌體含量和產(chǎn)量的穩(wěn)定。在飼料中添加該微生態(tài)制劑可以代替目前作為生長促進劑的抗生素或激素類產(chǎn)品，不僅可以解決畜產(chǎn)品藥物殘留的問題，還可以起到促進動物健康，改善動物肉質(zhì)等多項功能。
上述擴大培養(yǎng)的條件是溫度37℃，pH6.8，培養(yǎng)時間20小時；所述發(fā)酵的條件是溫度37℃，pH6.8，培養(yǎng)36小時。
本發(fā)明所采用的乳酸芽孢桿菌不僅具備普通乳酸菌的優(yōu)點，而且能夠耐熱、耐干燥和耐酸，與常見的乳酸菌相比，有很高的耐胃酸和膽汁的能力，同時具有生長速度快等優(yōu)點，這就保證了該菌株可以順利通過胃進入動物腸道并迅速發(fā)揮作用，抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長，在飼料中添加使用可以促進動物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率，可達到取代抗生素或激素類產(chǎn)品的目的。從而解決畜產(chǎn)品藥物殘留的問題，促進動物健康生長。
經(jīng)過實驗表明芽孢乳酸桿菌對大鼠高血脂癥有一定的治療作用，對正常大鼠的空腹血糖水平基本無影響，可降低實驗性糖尿病大鼠的血糖水平，對糖耐量的Cmax有明顯的降低作用，使糖耐量減低現(xiàn)象好轉(zhuǎn)。芽孢乳酸桿菌db-1在高劑量時可提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，對吞噬細胞功能有一定增強作用。芽孢乳酸桿菌db-1對小鼠溶血素試驗表明，該制劑對小鼠體液免疫功能有一定的增強作用。根據(jù)芽孢乳酸桿菌db-1對小鼠NK細胞活性影響試驗表明，在高劑量時，對ConA誘導(dǎo)下的小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化有增強作用。在中高劑量時，可增強小鼠NK細胞活性。
與現(xiàn)有微生態(tài)制劑相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明利用乳酸芽孢桿菌生產(chǎn)新的微生態(tài)制劑，與市場現(xiàn)有產(chǎn)品相比，有更高的活力，能避免在貯存運輸和加工使用過程中常見的活菌數(shù)衰減問題，對飼料加工過程中的逆環(huán)境有很高的抗性。該微生態(tài)制劑可以順利通過胃進入動物腸道并迅速發(fā)揮作用，抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長，在飼料中添加使用可達到取代抗生素時目的。本發(fā)明乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑的制備采用液體發(fā)酵法跟現(xiàn)有的固體發(fā)酵法相比，具有更高的穩(wěn)定性。另外，本發(fā)明的乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑能促進胃腸道微生態(tài)平衡，增強非特異性免疫功能；在飼料中添加使用可以促進動物生長和提高飼料轉(zhuǎn)化率，可達到取代抗生素或激素類產(chǎn)品的目的。從而解決畜產(chǎn)品藥物殘留的問題，促進動物健康生長。
具體實施例方式
實施例1 乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑的制備將試管中的乳酸芽孢桿菌D-1接種至三角瓶中擴培(37℃，pH6.8，培養(yǎng)20小時)，然后接種至500L發(fā)酵罐中發(fā)酵(接種量10％，溫度pH同上，培養(yǎng)36小時)，離心分離菌體，添加玉米淀粉載體混和(菌體與玉米淀粉的體積比為1∶2)，氣流干燥制得芽孢乳酸桿菌菌粉。擴培和發(fā)酵的培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
實施例2 乳酸芽孢桿菌的耐熱耐鹽耐酸實驗表1、乳酸芽孢桿菌耐熱性試驗


表2、乳酸芽孢桿菌耐鹽度試驗

表3、乳酸芽孢桿菌耐酸度試驗

從表1、表2、表3可見，乳酸芽孢桿菌能夠耐酸、耐熱、耐鹽，可以抵抗動物體內(nèi)不良環(huán)境因子對其的影響，活著進入腸道，克服了現(xiàn)有微生態(tài)制劑存在活菌數(shù)衰減的問題。
實施例3 芽孢乳酸桿菌db-1安全性毒理學(xué)試驗一、材料昆明種小鼠(中山醫(yī)科大學(xué)動物中心提供)，桿菌(db-1)發(fā)酵液二、方法以Karber氏法測定小鼠經(jīng)口LD50，選用18-22g健康昆明小鼠50只，隨機分為五組。每組雌雄各半，將桿菌原液按10、5、2.5、1.25、0.625g/kg體重五種劑量分別給小鼠灌喂染毒，灌喂后觀察并記錄一周內(nèi)各組實驗動物的癥狀及死亡情況。

三、結(jié)果與結(jié)論觀察期間各組小鼠均無異常表現(xiàn)，亦均未發(fā)生死亡，見表4。
表4表明該樣品小鼠經(jīng)口LD50＞10.0g/kg b.w.按急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)屬無毒物質(zhì)。
實施例4 芽孢乳酸桿菌db-1粉劑飼養(yǎng)試驗1.芽孢乳酸桿菌制劑對乳豬黃白痢的預(yù)防試驗組2～3天齡(剪牙斷尾時)乳豬，取芽孢乳酸桿菌db-1粉劑6g(菌體含量＞1011CFU/g)溶于30ml生理鹽水中，按每頭3ml灌服一次。10天齡按每2g灌10頭的量再灌服一次。
對照組不灌服藥物。
各組試驗條件相同，其他飼養(yǎng)管理均按豬場原有正常飼養(yǎng)管理制度進行，結(jié)果見表5，可見芽孢乳酸桿菌制劑對乳豬黃白痢有預(yù)防作用。
表5

2.芽孢乳酸桿菌制劑對乳豬黃白痢的治療試驗組下痢乳豬，取芽孢乳酸桿菌粉劑2g(菌體含量＞1011CFU/g)溶于20ml生理鹽水中，按每頭2ml灌服，每日一次，灌服三次。
對照組采用常規(guī)抗菌素藥物“痢菌凈”治療各組試驗條件相同，其他飼養(yǎng)管理均按豬場原有正常飼養(yǎng)管理制度進行，結(jié)果見表6，可見芽孢乳酸桿菌制劑對乳豬黃白痢有很好的治療作用，效果比“痢菌凈”要好。
表6

3.芽孢乳酸桿菌制劑對仔豬生產(chǎn)性能的影響(廣東肇慶)3.1試驗材料芽孢乳酸桿菌db-1粉劑中試產(chǎn)品，活菌總數(shù)≥2×1010CFU/g。
試驗動物選用21日齡左右斷奶的體重相近杜大長三元雜仔豬120頭。
基礎(chǔ)日糧對照組與試驗組豬均使用營養(yǎng)水平相同的教槽料、斷奶仔豬料及小豬料配制的配合飼料。
3.2試驗方法28日齡杜大長三元雜仔豬120頭，按平均體重相近的原則隨機均分為對照組和試驗組。對照組斷奶仔豬及小豬按常規(guī)添加抗生素類促生長劑。試驗組飼料中均不添加抗生素類促生長劑，添加0.08％的乳酸桿菌粉劑。試驗組以及對照組均在斷奶至斷奶后5~7天用抗生素(支原凈+金霉素+強力霉素)飲水預(yù)防腹瀉以及呼吸道疾病，各組試驗期均為42天，各組飼養(yǎng)條件相同，飼養(yǎng)管理按豬場正常飼養(yǎng)管理制度進行。
3.3試驗內(nèi)容試驗開始時、70日齡早上空腹稱豬只體重及料重(稱重前一天晚上斷料，并將料槽中的料收回稱重)，記錄飼料消耗、體重變化、腹瀉情況及死淘頭數(shù)，計算飼料轉(zhuǎn)化率、平均日增重和育成率。觀察豬只健康狀況、糞便稀稠及氣味等情況。
3.4試驗結(jié)果芽孢乳酸桿菌粉劑對仔豬平均體重(kg)、平均日增重(g)的影響見表7。
表7

芽孢乳酸桿菌粉劑對仔豬日料重比、腹瀉率、成活率的影響見表8。
表8

從以上結(jié)果可以看出，仔豬飼料中添加適量的芽孢乳酸桿菌制劑，可明顯降低仔豬的腹瀉，日增重明顯提高，飼料轉(zhuǎn)化率提高，成活率也有較明顯的提高。而且在試驗過程中觀察到，添加“乳酸桿菌粉劑”的試驗組仔豬較添加抗生素的對照組精神狀態(tài)好，食欲旺盛，患病次數(shù)很少，皮毛光滑，所拉糞便臭味降低。試驗結(jié)果說明添加適量的乳酸桿菌制劑，不僅可以提高仔豬的生產(chǎn)性能，而且還可以增進仔豬健康狀況及改善豬舍及豬場的飼養(yǎng)環(huán)境，在仔豬日糧中添加0.08％的芽孢乳酸桿菌db-1效果明顯。
4.芽孢乳酸桿菌制劑對AA肉雞生產(chǎn)性能和健康狀況的影響(山東)4.1試驗動物選用剛出生的商品AA肉雞5000只，試驗組2600只，對照組2400只。對照組選用山東六合生產(chǎn)的已添加抗生素的30％肉雞濃縮料配制的全價料。試驗組肉雞飼料使用濰坊美林生產(chǎn)的不含抗生素的5％肉雞預(yù)混料配制的全價料，并在飼料中添加0.05％芽孢乳酸桿菌制劑(含菌量≥2×1010CFU/g)。兩組肉雞飼料的營養(yǎng)水平相同，試驗期均為7周。
4.2飼養(yǎng)管理及疾病控制各組飼養(yǎng)條件相同，免疫程序相同(7日齡，新城疫喘支雙聯(lián)苗；14日齡，法氏囊疫苗；18日齡，球蟲；25日齡，新城疫疫苗)，對照組按常規(guī)使用抗生素預(yù)防和治療疾病，試驗組在1日齡開始，按400只/2g連續(xù)3天使用乳酸桿菌制劑飲水預(yù)防雛雞白痢等消化道疾病，使用純中藥制劑(廣州廣牧動物保健品廠生產(chǎn)的清肺散、清瘟敗毒藥)預(yù)防和治療呼吸道疾病，其它飼養(yǎng)管理按雞場常規(guī)飼養(yǎng)管理制度進行。
4.3結(jié)果與討論與添加抗生素的對照組相比，試驗組肉雞精神狀態(tài)好，食欲旺盛，生長速度快，均勻度較好，普遍健康體壯，而對照組則易患消化道疾病，尤其是雛雞白痢等消化道疾病發(fā)生較多。試驗組肉雞在7周齡時，平均體重超過對照組，全期飼料轉(zhuǎn)化率也高于對照組。
表9.芽孢乳酸桿菌制劑對AA肉雞增重的影響(g) 表10.芽孢乳酸桿菌制劑對AA肉雞料肉比及成活率的影響 在AA肉雞日糧中添加0.05％的芽孢乳酸桿菌制劑，飼養(yǎng)的肉雞在7周齡達到要求體重，且肉雞消化道疾病發(fā)生減少，而且飼料轉(zhuǎn)化率較對照組高。本試驗證明乳酸桿菌制劑可預(yù)防雛雞白痢，并對肉雞生產(chǎn)性能有較明顯的改善作用，使用效果明顯?？傮w來看，添加乳酸桿菌制劑的試驗組成本較低，效益更高。
本批試驗組肉雞由山東煙臺檢驗檢疫局檢測結(jié)果顯示，該批肉雞胴體及內(nèi)臟中無任何抗生素藥物殘留，完全達到出口歐盟、日本的標(biāo)準(zhǔn)。
實施例6 芽孢乳酸桿菌db-1粉劑小范圍人群飲用試驗結(jié)果由表11可見，芽孢乳酸桿菌db-1粉劑對增加小腸蠕動速度，改善腸道功能有較好的療效。
表11

權(quán)利要求
1.一種乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑，包括菌種和載體，其特征在于所述菌種為乳酸芽孢桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑，其特征在于所述載體為淀粉。
3.權(quán)利要求1所述的乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于采用液體發(fā)酵法制備乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述采用液體發(fā)酵法制備乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑為將乳酸芽孢桿菌擴大培養(yǎng)，然后在發(fā)酵罐中發(fā)酵，離心分離菌體，添加載體，干燥得到乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述擴大培養(yǎng)的條件是溫度37℃，pH6.8，培養(yǎng)時間20小時；所述發(fā)酵的條件是溫度37℃，pH6.8，培養(yǎng)36小時。
6.權(quán)利要求1所述乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑在制備動物生長促進劑或胃腸藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體公開了一種乳酸芽孢桿菌微生態(tài)制劑及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明采用產(chǎn)芽孢乳酸桿菌為出發(fā)菌種，利用液體發(fā)酵法進行菌種培養(yǎng)。先對菌種進行擴大培養(yǎng)，然后接種到發(fā)酵罐中發(fā)酵，結(jié)束后采用離心機離心收集菌體，然后添加載體進行氣流干燥，最大限度的實現(xiàn)了菌體含量和產(chǎn)量的穩(wěn)定。在飼料中添加該微生態(tài)制劑可以代替目前作為生長促進劑的抗生素或激素類產(chǎn)品，不僅可以解決畜產(chǎn)品藥物殘留的問題，還可以起到促進動物健康，改善動物肉質(zhì)等多項功能。
文檔編號C12N1/20GK1857326SQ20061003433
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月16日
發(fā)明者杜冰, 吳建忠, 劉長海 申請人:仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院