專利名稱：一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種模型的建立方法，具體地說是關(guān)于一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法。
背景技術(shù)：
將體外培養(yǎng)的細胞回植入體內(nèi)，這些細胞可以繼續(xù)形成代表其來源的組織。因此，將體外培養(yǎng)的細胞回植入體內(nèi)以觀察細胞的功能、起源以及影響因素被作為一種研究模型得到廣泛應用。承載細胞移植的支架材料包括人工合成材料以及天然材料?？谇谎芯款I(lǐng)域曾有研究者用牙根或根片來承載細胞。但研究者用體外共培養(yǎng)的方式來觀察體外細胞形成的組織，并未將承載根片的細胞植入體內(nèi)。有研究者將附著了細胞的牙根植入腭部牙槽骨內(nèi)，仍沒有脫離牙周韌帶細胞起源的微環(huán)境，因此，可能受到局部區(qū)域生長因子的影響。并且，植入的細胞是直接與周圍組織細胞相接觸的，可能受到細胞生長環(huán)境中其他細胞的信號影響。目前，有微囊包裹技術(shù)(Encapsulation)，用于胰島移植的研究。在胰島外面包裹一層膜狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，使胰島與宿主的免疫系統(tǒng)隔離開來，免受宿主的免疫細胞以及免疫大分子的攻擊，同時小分子的營養(yǎng)成分、氧氣、胰島分泌的胰島素等又可以自由進出包囊。1980年，Lim等發(fā)明了海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(alginale-polylysine-alginale，APA)微囊包裹技術(shù)。但未見有用不可吸收性膜來包裹的研究。另外，關(guān)于應用不可吸收性膜的引導組織再生術(shù)，旨在隔離牙齦結(jié)締組織和上皮細胞，在口腔醫(yī)學領(lǐng)域也取得了較好的效果。但沒有將接種細胞的根片包裹以避免裸鼠細胞侵入影響的技術(shù)。
現(xiàn)有技術(shù)有下列缺點(1)與細胞共培養(yǎng)的根片植入體內(nèi)，由于接種的細胞是直接與周圍組織細胞相接觸的，可能受到生長環(huán)境中其他細胞的信號影響。
(2)微囊包裹技術(shù)正在研究過程中，可能不適合于包裹本研究中體積較大的根片，所需成本較高。
釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)已被廣泛地應用于牙周組織再生的基礎(chǔ)研究及臨床治療，但是關(guān)于其作用的具體機制還不是很清楚。大部分的研究集中于EMPs對體外培養(yǎng)細胞的增殖、分化及基質(zhì)合成等方面。但應用不同的細胞得出了不同的結(jié)論。
現(xiàn)有已經(jīng)公開的技術(shù)能夠在體外觀察EMPs對骨髓基質(zhì)細胞在根片表面附著生長的影響，但還沒有實驗來研究其對細胞分化的生理功能方面的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法，包括以下步驟(1)制備根片、釉基質(zhì)蛋白、骨髓基質(zhì)細胞；(2)將上述根片的根面用釉基質(zhì)蛋白覆蓋；
(3)將骨髓基質(zhì)細胞接種在步驟(2)獲得根片表面上；(4)將步驟(3)獲得根片置入聚四氟乙烯膜的口袋內(nèi)；(5)將口袋包繞的根片放入裸鼠皮下。
其中步驟(1)所述的骨髓基質(zhì)細胞選自豬骨髓基質(zhì)細胞、狗骨髓基質(zhì)細胞、兔骨髓基質(zhì)細胞。步驟(1)所述的骨髓基質(zhì)細胞優(yōu)選自豬骨髓基質(zhì)細胞。步驟(2)所述的根片表面用200μg/ml釉基質(zhì)蛋白溶液覆蓋。步驟(3)所述的接種骨髓基質(zhì)細胞后根片用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。步驟(3)所述的接種骨髓基質(zhì)細胞后根片也可用DEX培養(yǎng)液培養(yǎng)。
本發(fā)明具體步驟如下牙齒去掉牙冠，制作根片。消毒，根面用EMPs覆蓋。放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。抽取髂骨骨髓，全骨髓培養(yǎng)法獲得骨髓基質(zhì)細胞，制成細胞懸液，接種到根片表面。靜置培養(yǎng)7天后，經(jīng)掃描電鏡確定細胞在根面上生長良好。傾去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗，置入聚四氟乙烯膜做成的口袋內(nèi)。(聚四氟乙烯口袋的制備將聚四氟乙烯膜折疊成雙層，寬度約15mm，置于平板上。將細刃狀的帶柄鐵質(zhì)工具在爐火上灼燒，直至鐵具末端變紅，表示已達到較高溫度。迅速沿著雙層薄膜整齊劃痕。高溫作用下，兩層薄膜粘合在一起。間隔約10mm，按上述方法再作一道劃痕，即做成只有一端開口的口袋。包裝多個聚四氟乙烯薄膜做成的口袋，進行高溫高壓消毒，以備放置根片所用。)在裸鼠背部作縱形切口，暴露皮下組織。將屏障膜包繞的根片放入皮下，嚴密縫合傷口。術(shù)后，觀察動物傷口愈合及活動情況。傷口愈合良好，動物無異常。分別于術(shù)后3周和8周處死動物，分離周圍組織，根片與屏障膜一起固定，石蠟包埋，制作5μm切片。HE染色，進行組織學觀察。
本發(fā)明所公開一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法，其優(yōu)點表現(xiàn)在(1)本發(fā)明將細胞體外培養(yǎng)與體內(nèi)生長相結(jié)合，并用屏障膜隔離裸鼠細胞的影響，可以觀察EMPs對骨髓基質(zhì)細胞分化的影響，從而為研究EMPs的作用機制提供有效的研究模型。
(2)在本發(fā)明中，實驗的前3周，聚四氟乙烯膜能將裸鼠細胞阻擋在外側(cè)，有利于骨髓基質(zhì)細胞在根片表面生長分化，不受裸鼠細胞影響。至8周時，不同的處理組形成了不同的組織解構(gòu)，表明EMPs可促進豬骨髓基質(zhì)細胞向成牙骨質(zhì)細胞方向分化，亦表明了所用的研究模型是成功的。
(3)接種的骨髓基質(zhì)細胞在根面已經(jīng)定植、增殖并分化出類似牙骨質(zhì)和纖維組織的成分，表明EMPs可促進豬骨髓基質(zhì)細胞向成牙骨質(zhì)細胞方向分化，開拓了釉基質(zhì)蛋白新應用。


圖1豬BMSCs原代培養(yǎng)第5天，細胞呈紡錘形，形成成纖維細胞樣集落樣單位(CFUs)，(倒置顯微鏡，x50)。
圖2豬BMSCs原代培養(yǎng)第5天，細胞呈紡錘形，細胞核大，單核，位于中央，細胞有長的突起(倒置相差顯微鏡，x100)。
圖3植入屏障膜包繞的細胞-根片的裸鼠，傷口愈合良好。箭頭顯示標本植入部位。
圖43周標本，ePTFE膜與根片外側(cè)面之間有纖維組織形成，細胞成分較多；內(nèi)側(cè)面與屏障膜之間無組織結(jié)構(gòu)(箭頭所指)，裸鼠組織被阻擋在ePTFE膜外側(cè)(HE染色，x40).MePTFE膜；NFT新生的纖維組織；RS根片；MT裸鼠組織。
圖5實驗組1標本，術(shù)后8周。纖維組織沿根片表面生長(箭頭所指)，未見新生的礦化組織形成。HE染色，Ax40；Bx100。
圖6實驗組2標本，術(shù)后8周?？梢娦律难拦琴|(zhì)樣物形成，表面有復層排列的呈立方狀的細胞，類似成牙骨質(zhì)細胞(箭頭所示)。Dentin牙本質(zhì)；NCL新形成的牙骨質(zhì)樣組織；MePTFE膜。A、B、CHE染色，分別為x40、x100、x200。
圖7實驗組3標本，術(shù)后8周。形成骨樣組織，外側(cè)無纖維組織。鈣化物內(nèi)細胞成分較多，骨陷窩密集Dentin牙本質(zhì)；NBL新形成的骨樣組織；OC原有牙骨質(zhì)；MePTFE膜。A、CHE染色，分別為x40、x100。
圖8實驗組3標本，術(shù)后8周。形成的骨樣組織具有骨髓腔樣結(jié)構(gòu)(箭頭所示)。Dentin牙本質(zhì)；NBL新形成的骨樣組織；OC原有牙骨質(zhì)；MePTFE膜。AHE染色，x100；B硬組織切片，苦味酸-品紅染色，x100。
圖9實驗組4標本，術(shù)后8周。硬組織切片，苦味酸-品紅染色，x100。Dentin牙本質(zhì)；NCL新形成的牙骨質(zhì)樣組織；NFT新形成的纖維組織；MePTFE膜。
圖10實驗組4標本，術(shù)后8周?？梢娫谠醒拦琴|(zhì)表面有新生的牙骨質(zhì)樣物形成，表面有單層排列的呈立方狀的細胞，類似成牙骨質(zhì)細胞(箭頭所示)。Dentin牙本質(zhì)；NCL新形成的牙骨質(zhì)樣組織；OC原有牙骨質(zhì)；NFT新形成的纖維組織；MePTFE膜。A、CHE染色，分別為x100、x200；右側(cè)為正常牙周組織標本，HE染色，x100。牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)染色接近，為細胞性牙骨質(zhì)。牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)交界處有清晰的淡染的纖維交錯帶。牙槽骨內(nèi)有骨髓腔，牙周韌帶纖維插入牙槽骨和牙骨質(zhì)中。AB牙槽骨，PDL牙周韌帶，C牙骨質(zhì)，D牙本質(zhì)。
圖11對照組組織學觀察，纖維組織形成(箭頭所示)。HE，x40。Dentin牙本質(zhì)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1豬骨髓基質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)材料與方法一、主要實驗材料1.實驗動物3月齡健康雜交豬，體重20kg左右，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物房提供，符合國家實驗動物檢疫標準。
2.骨髓穿刺用品無菌骨髓穿刺包(內(nèi)有16號骨髓穿刺針、紗布、洞巾)、一次性10m l空針、無菌50m l離心管、肝素3.細胞培養(yǎng)用液體和試劑(1)DMEM培養(yǎng)液及配制NaHCO33.7g(分析純AR，中國上海虹光化工廠)
L-谷氨酰胺 300mg(Sigma，USA)維生素C50mg(Sigma，USA)青霉素 200 000u(上海新華制藥廠)硫酸鏈霉素 200 000u(上海新華制藥廠)DMEM 10g(高糖型，Gibco，Invitrogen Corporation，USA)FBS100ml(Hyclone，南美洲，Cat NOCH30160.03)上述成分配制后，加入適量雙蒸水，磁力加熱攪拌器上充分溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4左右，補雙蒸水至1000ml。經(jīng)0.22μm無菌濾器過濾滅菌后，500毫升滅菌器分裝，4℃冰箱保存。
(2)礦化誘導液(本文中簡稱DEX培養(yǎng)液)在上述DMEM培養(yǎng)液中加入地塞米松2μl(2mg/ml，Sigma，USA)β-甘油磷酸鈉 2.16g(Sigma，USA)按同上方法消毒儲存?zhèn)溆谩?br> (3)PBS緩沖液NaCl8.0g/LKCl 0.2g/LNa2HPO4·12H2O 3.44g/LKH2PO40.2g/LpH值約為7.4，高溫高壓滅菌后，加入青霉素、硫酸鏈霉素各200 000u/L，分裝備用。
(4)0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液配制EDTA Na2·2H2O 0.2g(Amresco-0105，Sigma)胰蛋白酶(1∶250) 2.5g(Amresco-0458，Sigma)加入PBS緩沖液至1000ml，0.22μm無菌濾菌器滅菌，分裝，4℃冰箱貯存。
2.實驗儀器(1)CO2培養(yǎng)箱Hereaus HERA Cell 3180F INC，德國(2)倒置相差顯微鏡LEICA DMRIRB，Leica，德國(3)TDL-40型低速臺式大容量離心機上海安亭科學儀器廠，中國(4)血球計數(shù)板國營上海醫(yī)用光學儀器廠，中國(5)Sartorius BS124 S電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，中國(6)79-1型磁力加熱攪拌器常州國華電器有限公司，中國(7)DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司，中國(8)DK-8D電熱恒溫水槽上海精宏實驗設(shè)備有限公司，中國(9)TOMY AUTOCLAVE SS-325高壓滅菌器TOMY KOGYO，日本(10)Z 2型細胞粒度計數(shù)儀Beckman Coulter，美國3.細胞培養(yǎng)用器材培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板(Corning，NY14831，USA)二、方法1.豬骨髓基質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)(1)取材實驗動物經(jīng)氯胺酮10mg/kg肌注誘導后，肌注速眠新0.1ml/kg麻醉。動物側(cè)臥，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。用肝素化的16號無菌骨髓穿刺針，垂直進入髂前上棘后上方約1cm處，進入骨髓腔，抽取骨髓血約4ml，置于500u/ml肝素化的無菌離心管中。
(2)洗滌與離心于離心管中加入無血清DMEM培養(yǎng)液約20ml，混勻制成細胞懸液，2000r/min(800g)離心20min，棄去大部分的上清液及漂浮的脂肪，保留界面層及下方的沉淀層。
(3)原代培養(yǎng)于保留離心管中加入含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，混勻，制成細胞懸液，按10ml/皿接種。大約1.5-2ml骨髓血接種于一皿直徑為10cm的培養(yǎng)皿。置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，進行原代培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)5天后，首次更換培養(yǎng)液。搖動培養(yǎng)皿，使未貼壁的細胞浮起，吸去含大量紅細胞的培養(yǎng)液。PBS洗滌1-2次，于倒置顯微鏡鏡下觀察，可見多個細胞克隆形成。加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)。
(4)傳代培養(yǎng)細胞生長達到接近融合狀態(tài)后，進行傳代。吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入3ml胰蛋白酶-EDTA消化液，鏡下見大部分細胞胞質(zhì)回縮、形態(tài)變圓后，加入約3ml含血清DMEM培養(yǎng)液終止胰酶的消化作用。收集細胞，吹打，制成細胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)細胞。細胞懸液1000r/min，離心5min，棄上清液，用新鮮培養(yǎng)液懸浮細胞，以2×104/cm2的細胞密度接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第二天，更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁的細胞。以后3天換液一次，待細胞達到80％融合后，同上傳代培養(yǎng)。
實施例2釉基質(zhì)蛋白的提取材料和方法一、實驗儀器和試劑1.釉基質(zhì)蛋白提取用主要儀器和試劑(1)牙胚取自六月齡健康豬上下頜骨內(nèi)正在發(fā)育的磨牙的牙胚。健康雜交豬由上海市東風肉聯(lián)廠提供(2)乙酸中國江蘇省無錫中西藥品器械集團有限公司，使用時用去離子水稀釋，終濃度為0.5M/L(3)三氯乙酸分析純AR，江蘇永華精細化學品有限公司，去離子水配成20％溶液(w/v，20g/100ml)(4)丙酮分析純，AR，江蘇省蘇州市第二化工研究所有限責任公司(5)低溫高速離心機Heraus 28 RS，Germany(6)超低溫冰箱(-80℃)REVCO，REVCO Scientific，Inc，USA(7)真空冷凍干燥器VIRTIS BENCHTOP，USA二、實驗方法取出-80℃凍存的牙胚，室溫下融化。將牙胚置于冰塊上，小心刮取牙胚表面的奶酪樣物質(zhì)，分裝入Eppendorf管。每管內(nèi)加1ml 0.5mol/L乙酸，搖勻，4℃冰箱內(nèi)過夜。小心吸取上清液和中間白色凝乳狀層，加入適量20％三氯乙酸，混勻。4℃離心15min，12 000轉(zhuǎn)/min。棄上清液，于沉淀物中加入丙酮少許，搖勻，同上轉(zhuǎn)速離心5min。棄上清，待丙酮充分揮發(fā)。每管內(nèi)加入去離子水以使沉淀物溶解或漂浮其中，-80℃冷凍后，-56℃真空干燥。提取物-80℃密封保存。
實施例3BMSCs復合根片裸鼠體內(nèi)移植實驗一、實驗材料1.齦下刮治器Gracey匙刮，上?？禈螨X科醫(yī)械廠2.EDTA凝膠240g/L，Biora AB，Sweden3.柏萊克-理克羅氏脫鈣液配制氯化鋁結(jié)晶 70克蒸餾水 1000ml甲酸50ml濃鹽酸(37％)85ml上述成分按比例混勻溶解后，備用。
4.聚四氟乙烯微孔薄膜(上海塑料研究所提供，牌號為H-PSFWM-0.10-90，厚度為0.10mm，寬度為90mm)5.石蠟包埋機Thermo Shandon Histocentre 2，England二、實驗方法
1.根片獲得及處理豬經(jīng)過量戊巴比妥鈉麻醉處死后，拔除牙齒，包括上下前牙、前磨牙和第一、二磨牙。用金剛砂車針片切，去掉牙冠，用齦下刮治器徹底刮除根面的牙周膜和牙骨質(zhì)，并進行根面平整，直至根面光滑。用金剛砂車針沿與牙齒長軸平行方向?qū)⒀例X片切為兩部分。用刮匙去凈牙髓組織，但不觸及內(nèi)側(cè)的前期牙本質(zhì)層。制成的根片，一側(cè)為面向牙周韌帶面(簡稱為外側(cè)面)，另一側(cè)為前期牙本質(zhì)面(簡稱為內(nèi)側(cè)面)。240g/L EDTA凝膠處理外側(cè)面2min，生理鹽水沖洗。將根片放入200 000U/ml的青霉素和鏈霉素液中浸泡24h。然后用紫外燈照射4小時，隨即放入4℃條件下的PBS緩沖液中(PH值7.4，青霉素、鏈霉素濃度為200U/ml)。24小時后取出根片，PBS液沖洗，置入48孔板中，外側(cè)面向上。
取40個根片，共分為4個實驗組實驗組1，根片表面未用200μg/mlEMPs溶液處理，接種BMSCs后用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；實驗組2根片表面用200μg/mlEMPs溶液處理，接種BMSCs后用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；實驗組3根片表面未用200μg/mlEMPs溶液處理，接種BMSCs后用DEX誘導液培養(yǎng)；實驗組4根片表面用200μg/mlEMPs溶液處理，接種BMSCs后用DEX誘導液培養(yǎng)。分別以相同處理但未接種BMSCs的根片作為相應的對照組。根片分組處理及各組根片數(shù)量情況如表1所示。
表1根片分組及各組根片數(shù)量情況

注#列“+”表示根片用EMPs處理；“-”表示根片無EMPs處理。
§列“+”表示根片接種BMSCs；“-”表示根片未接種BMSCs。
2.根片表面接種骨髓基質(zhì)細胞細胞傳代培養(yǎng)至第二代，取生長旺盛的骨髓基質(zhì)細胞，0.25％胰蛋白酶、0.02％EDTA消化，收集細胞，分別用DMEM培養(yǎng)液和DEX培養(yǎng)液懸浮細胞，制成單細胞懸液，濃度為320 000個/ml，按照表1所示分組，每孔接種0.5ml。按表1所示的對照組處理，表面用EMPs處理或不處理各兩個根片，接種不含骨髓基質(zhì)細胞的DEX培養(yǎng)液或DMEM培養(yǎng)液0.5ml。將48孔板放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。
3.根片裸鼠體內(nèi)植入BMSCs接種培養(yǎng)后7天，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)細胞生長旺盛。根片用PBS緩沖液漂洗，洗去培養(yǎng)液中血清成分。所有根片均用已消毒的聚四氟乙烯微孔薄膜呈袋狀包被備用。5周齡Bal/c裸鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后，消毒皮膚，在背部兩側(cè)皮膚分別作2個縱切口，分離，暴露皮下組織。將已包被的根片植入裸鼠皮下，嚴密縫合傷口。本實驗中，將11只裸鼠隨機分為3組DMEM培養(yǎng)液組5只裸鼠，每只裸鼠體內(nèi)植入實驗組1和組2各兩個根片；DEX培養(yǎng)液組5只裸鼠，每只裸鼠體內(nèi)植入實驗組3和組4各兩個根片；對照組1只裸鼠，植入對照組1、2、3和4各一個根片。術(shù)后記錄每個部位植入根片的組別。
4.裸鼠標本處理4.1脫鈣標本處理根片植入裸鼠體內(nèi)后，經(jīng)過3、8周，裸鼠斷頸處死，銳分離取材，將聚四氟乙烯膜包繞的根片取出，4℃條件下，10％福爾馬林固定24小時，標本用柏萊克-理克羅氏脫鈣液脫鈣3天。檢查見組織變軟即終止脫鈣。標本用流水沖洗24小時以洗去脫鈣液。自動脫水機梯度酒精脫水，石蠟包埋。與牙齒長軸方向平行，以牙齒近遠中方向作5μm厚連續(xù)切片，取中間部分切片用于蘇木精-伊紅染色。
4.2不脫鈣標本處理同上取材后，標本用10％福爾馬林固定24小時，流水沖洗1小時后，置入70％酒精固定，甲基丙烯酸甲酯自塑化液包埋標本，與牙齒長軸平行，近遠中向用硬組織切片機(Leica SP 1600，Germany)做80μm厚硬組織切片。將切片黏附在塑料玻片上，經(jīng)過打磨(靜電植砂氧化鋁耐水砂紙，1200目，中國上海)拋光(金剛玉磨光粉，山東淄博)，超聲震蕩洗滌2min，擦干，進行苦味酸-品紅染色(1)0.1％甲酸浸泡3min(上海振興化工一廠)(2)20％甲醇固定2h(3)60℃ Stevenel染液染色2min(進口分裝，水浴箱JuLaboTW12 Germany)(4)苦味酸(進口分裝)染色1min(5)100％乙醇脫水，鏡下觀察結(jié)果一、豬BMSCs培養(yǎng)原代細胞接種后第三天，在倒置顯微鏡下見培養(yǎng)皿內(nèi)充滿血細胞。密集的血細胞之間有散在的折光性強的透光點。第5天，鏡下觀察見透光點明顯增大增多。更換培養(yǎng)液后，培養(yǎng)皿內(nèi)仍有較多量的紅細胞和較大的有核血細胞等。BMSCs貼壁生長，呈紡錘形，有不規(guī)則細胞突起，細胞單核，較大，位于中央。BMSCs以成纖維細胞集落樣方式生長，集落中央細胞密集，向周圍呈放射狀排列，較稀疏，集落單位呈團狀、島狀分布，見圖1、圖2。細胞生長增殖迅速，鏡下可見較多的細胞分裂相。大約每隔3天傳代一次。
二、根片裸鼠體內(nèi)移植1.動物及傷口愈合情況大體觀察根片植入裸鼠體內(nèi)后，動物活動良好，未出現(xiàn)飲食異常及消瘦現(xiàn)象。術(shù)后兩周拆除縫線，觀察傷口愈合情況。傷口愈合不完全一致，大部分傷口愈合良好，屏障膜包繞根片位于裸鼠皮下，無暴露，見圖3。有4個植入?yún)^(qū)出現(xiàn)少量ePTFE膜暴露在皮膚外，但傷口無感染跡象，直到8周取材時亦無傷口感染。另有一個標本在8周取材時發(fā)現(xiàn)聚四氟乙烯膜內(nèi)有波動感，外觀為淡黃色，示形成膜袋內(nèi)膿腫。標本大體情況見表2。
表2各組標本愈合及數(shù)量分布情況

2.組織學觀察2.13周取材標本HE染色，顯微鏡下可見根片表面的牙骨質(zhì)有的完全刮除，有的只部分刮除。在4個實驗組的標本上，可見在屏障膜和根片外側(cè)面(即接種了BMSCs的根面?zhèn)?之間為纖維結(jié)締組織形成，細胞成分較多，與根片長軸平行排列。然而對側(cè)的屏障膜和根面之間未見組織結(jié)構(gòu)，屏障膜內(nèi)可見細胞成分，表明裸鼠的細胞成分被阻擋在膜的外面，見圖4所示。
2.28周取材標本2.2.1.實驗組1標本觀察，即DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)、根片未用EMPs處理，接種BMSCs組。HE染色顯微鏡下觀察，有4個標本顯示根面牙骨質(zhì)未完全去除，但不論有無牙骨質(zhì)存在，均顯示纖維結(jié)締組織沿根片表面生長，未見鈣化樣物質(zhì)在根面形成；在對側(cè)，屏障膜與前期牙本質(zhì)面之間有亦有纖維結(jié)締組織形成，但纖維成分較細小，與外側(cè)的裸鼠纖維組織成分結(jié)構(gòu)相似，屏障膜內(nèi)見有細胞存在，見圖5。硬組織切片兩個標本，形成組織結(jié)構(gòu)同上，未見根面有鈣化物形成。
2.2.2.在實驗組2，即DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)、根片用EMPs處理，接種BMSCs組。僅一個標本顯示為細胞性牙骨質(zhì)樣物形成于根片表面，有結(jié)締組織相鄰，圖6。另3個標本表現(xiàn)為纖維結(jié)締組織生長。硬組織切片兩個標本，一個為纖維結(jié)締組織生長，另一個為少量鈣化物形成。
2.2.3.實驗組3，即DEX培養(yǎng)液培養(yǎng)、根片未用EMPs處理，接種BMSCs組。HE染色顯示5個標本中的3個顯示為更像骨樣物沿著牙根表面，骨陷窩密集，外側(cè)無纖維結(jié)締組織，見圖7。有一個標本顯示為有骨髓腔形成，圖8所示。另外兩個標本顯示為纖維結(jié)締組織形成。硬組織切片標本兩個，其中一個標本顯示新形成的組織有明顯的骨髓腔樣結(jié)構(gòu)，見圖9。
2.2.4.組4，即DEX培養(yǎng)液培養(yǎng)、根片用EMPs處理，接種BMSCs組。HE染色顯示4個標本中的3個根片表面有牙骨質(zhì)樣物形成，表面有一層立方狀的細胞，并有纖維結(jié)締組織與之相鄰，硬組織切片兩個標本，有一個形成牙骨質(zhì)樣物，見圖10。
2.2.5.在未接種BMSCs的對照組，8周時，無論應用EMPs與否，在兩側(cè)均有少量纖維結(jié)締組織形成，但無鈣化物形成，見圖11。
綜合分析術(shù)后3周和術(shù)后8周各組標本總數(shù)，牙骨質(zhì)樣鈣化物、骨樣鈣化物及纖維結(jié)締組織形成占各組總標本的比例分布情況如3所示表3根片植入裸鼠體內(nèi)后不同處理組形成的組織結(jié)構(gòu)特征與各組總標本數(shù)的比例分布

通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)在實驗的前3周，聚四氟乙烯膜能將裸鼠細胞阻擋在外側(cè)，有利于骨髓基質(zhì)細胞在根片表面生長分化，不受裸鼠細胞影響。至8周時，不同的處理組形成了不同的組織解構(gòu)，表明EMPs可促進豬骨髓基質(zhì)細胞向成牙骨質(zhì)細胞方向分化，亦表明了所用的研究模型是成功的。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法，包括以下步驟(1)制備根片、釉基質(zhì)蛋白、骨髓基質(zhì)細胞；(2)將上述根片的根面用釉基質(zhì)蛋白覆蓋；(3)將骨髓基質(zhì)細胞接種在步驟(2)獲得的根片表面上；(4)將步驟(3)獲得根片置入聚四氟乙烯膜的口袋內(nèi)；(5)將口袋包繞的根片放入裸鼠皮下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模型建立方法，其特征在于步驟(1)所述的骨髓基質(zhì)細胞選自豬骨髓基質(zhì)細胞、狗骨髓基質(zhì)細胞、兔骨髓基質(zhì)細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的模型建立方法，其特征在于步驟(1)所述的骨髓基質(zhì)細胞優(yōu)選自豬骨髓基質(zhì)細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模型建立方法，其特征在于步驟(2)所述的根片表面用200μg/ml釉基質(zhì)蛋白溶液覆蓋。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模型建立方法，其特征在于步驟(3)所述的接種骨髓基質(zhì)細胞后根片用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模型建立方法，其特征在于步驟(3)所述的接種骨髓基質(zhì)細胞后根片用DEX培養(yǎng)液培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測細胞分化功能模型的建立方法，該方法包括以下步驟(1)制備根片、釉基質(zhì)蛋白(EMPs)、骨髓基質(zhì)細胞；(2)將上述根片的根面用釉基質(zhì)蛋白覆蓋；(3)將骨髓基質(zhì)細胞接種在步驟(2)獲得根片表面上；(4)將步驟(3)獲得根片置入聚四氟乙烯膜的口袋內(nèi)；(5)將口袋包繞的根片放入裸鼠皮下。本發(fā)明優(yōu)點表現(xiàn)在將細胞體外培養(yǎng)與體內(nèi)生長相結(jié)合，并用屏障膜隔離裸鼠細胞的影響，可以觀察EMPs對骨髓基質(zhì)細胞分化的影響，從而為研究EMPs的作用機制提供有效的研究模型。在實驗至8周時，不同的處理組形成了不同的組織結(jié)構(gòu)，EMPs處理的根面有細胞性牙骨質(zhì)樣物形成，表明EMPs可促進豬骨髓基質(zhì)細胞向成牙骨質(zhì)細胞方向分化，亦表明了所用的研究模型是成功的。
文檔編號C12Q1/04GK1884491SQ200610028508
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月30日
發(fā)明者束蓉, 宋愛梅, 謝玉峰, 宋忠臣, 王曉春 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院