專利名稱：雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種既能抑制乳腺癌轉移又能抑制乳腺癌生長的雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用。
背景技術：
惡性腫瘤的轉移并非隨機性遷徙，不同種類的癌細胞按其固有的遷徙路徑，向特定器官定向轉移。已有多種學說試圖解釋這種現象。“土壤學說”假設，不同的器官提供適合特定癌細胞生長的特殊微環(huán)境；“返巢學說”認為，不同器官具有識別、吸引或捕捉特定癌細胞的能力。然而多年來對引起此現象的內在機制缺乏充分的有說服力的證據予以闡明(Phlip M.Murphy Chemokines andthe molecular basis of cancer metastasis.N Engl J Med.2001 Sep 13；345(11)833-5.)。Muller等在趨化因子與腫瘤轉移相關性方面的研究成果為“返巢學說”提供了有力的證據，他們發(fā)現人乳腺癌細胞及其轉移瘤雖具有17種趨化因子受體基因，但僅趨化因子受體CXCR4(CXC chemokine receptor4)和CCR7(CC chemokine receptor7)的表達水平顯著高于正常乳腺細胞。與此相應，在乳腺癌細胞常規(guī)首先轉移的器官，如肺、肝、骨髓及淋巴結等CXCR4與CCR7的特異性配體CXCL12(CXC chemokine12)和CCL21(CC chemokine21)亦呈現高水平表達，而非常規(guī)性轉移器官卻呈低水平表達。由CXCR4和CCR7介導的信號促進在乳腺癌細胞肌動蛋白聚合、偽足形成，繼而誘導粘附和浸潤反應。動物實驗表明中和CXCR4與CXCL12的相互作用可有效削弱乳腺癌細胞向局部淋巴結和肺組織的轉移。由此提出關于CXCR4與其配體CXCL12的相互作用支配乳腺癌細胞進行多步驟有序轉移的特定模式即癌組織的上皮細胞通過克隆增生，侵入局部組織，誘導血管生成和趨化因子受體CXCR4在其表面表達。當癌細胞從原發(fā)腫瘤脫離，穿過淋巴和血管壁遷移至血液循環(huán)時，表達CXCR4的癌細胞通過與配體CXCL12特異性結合的方式，被其血管內皮高表達CXCL12的組織器官所捕獲，從而遷移至特定組織形成轉移腫瘤(Muller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breastcancer metastasis.Nature.2001Mar 1；410(6824)50-6)。該乳腺癌細胞轉移模式的提出為有效防治乳腺癌的轉移開拓出嶄新的思路，即根據CXCL12的構效關系進行定向遺傳改造，獲得保留其對CXCR4的高親和力，而取消其內在活性的CXCR4特異性拮抗劑SDF-1/54R(發(fā)明名稱為“基質細胞衍生因子-1重組突變體SDF-1/54R的構建、制備及其應用”，專利申請?zhí)枮椤?3146833.0”)。通過拮抗劑競爭性地阻斷野生型CXCL12與CXCR4的結合，破壞原發(fā)灶與遠程特定轉移器官之間所存在的CXCL12梯度，切斷乳腺癌轉移的潛在通路，從而制約乳腺癌的轉移。
新近HER-2/neu(c-ErbB-2)癌基因在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中所起的重要作用引起病理學家和臨床醫(yī)學家的高度關注。HER-2/neu基因定位于人17號染色體，編碼一185KD的跨膜糖蛋白，即表皮生長因子-2受體(HER-2)。與表皮生長因子受體家族(EGFR)其它成員一樣，HER-2具有酪氨酸激酶活性，介導參與調節(jié)細胞的生長與分化信號的傳導。HER-2可以單體、同源或異源二聚體的形式存在與細胞膜，以異源二聚體的酪氨酸激酶活性為最強。在正常細胞表面，HER-2表達甚微，幾乎無異源二聚體存在；因而介導促生長信號的能力亦相對微弱。但HER-2在許多腫瘤細胞則以異源二聚體的形式高水平表達，進而形成強烈的促生長信號。有證據提示HER-2/neu過度表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉移密切相關。動物實驗發(fā)現HER-2/neu在轉基因小鼠乳腺上皮表達可誘發(fā)轉移性腫瘤。臨床研究表明約20～30％的浸潤性乳腺癌患者的乳腺癌細胞HER-2/neu明顯擴增，HER-2高度表達，而且轉移灶與原發(fā)灶癌細胞的表達水平一致；凡高水平HER-2表達的浸潤性乳腺癌病例，對常化療不敏感、預后不良、容易轉移、死亡率高。Herceptin是一新近被FDA批準進入III期抗乳腺癌臨床試驗的重組人HER-2單克隆抗體。其臨床前研究表明Herceptin通過直接阻斷HER-2的胞外段，可明顯抑制HER-2表達陽性的乳腺癌細胞生長。臨床中心試驗表明Herceptin與化療藥聯合，可明顯提高治療反應率，延緩病程，增加生存期。以上證據支持HER-2可作為新的特異性治療浸潤性乳腺癌的靶點(M.J.Duffy Biochemical markers in breast cancerwhichones are clinically useful Clinical Biochemistry 2001；34347-352)。
小分子富亮氨酸蛋白糖甙家族成員飾膠蛋白(Decorin)因被證實是一強的腫瘤細胞生長負性調節(jié)因子而成為腫瘤研究領域的熱點。Decorin由核心蛋白及其以共價鍵相連的氨基糖甙鏈組成，未成熟肽含有359個氨基酸。內源性Decorin可被血管、結蒂組織和某些腫瘤等組織表達，尤以急性損傷組織的上皮下層表達甚強。在腫瘤組織，Decorin由其兩種主要支架細胞成纖維細胞和平滑肌細胞分泌產生并高濃度聚集于腫瘤細胞間的基質中。作為EGFR天然配體，Decorin通過與EGFR相互作用，抑制腫瘤細胞生長、浸潤和遠距離轉移。Decorin對腫瘤細胞生長的負性調節(jié)作用以及高度濃集于腫瘤細胞侵及的微環(huán)境的特性，實際上是宿主天然抗腫瘤免疫功能的體現(Marko Stander，Ulrike Naumann and Wolfgang Wick Transforming growth factor-beta and P21multiple molecular targets of decorin-mediated suppression of neoplastic growthCell Tissue Res 1999；296221-227；Renato V.Iozzo，David K.Moscatello，DavidJ.McQuillan et al.Decorin is a biological ligand for the epidermal growth factor.The Journal of Biological Chemistry 1999；274(8)4489-4492)。Manoranjan等用重組Decorin轉染HER-2高表達的乳腺肉瘤細胞MDA-453，使該細胞HER-2的表達量降低約40％，其酪氨酸激酶的活性幾乎完全喪失，內源性P21蛋白(一種強的細胞周期素依賴激酶抑制因子)活性增強，進而細胞持續(xù)處于周期停止、生長延遲的抑制狀態(tài)。裸鼠實驗顯示Decorin轉染HER-2高表達的乳腺肉瘤細胞MDA-453不能誘導腫瘤形成。因此，Decorin被認為是作為一種EGFR天然特異性拮抗劑，能安全有效地抑制HER-2高表達的腫瘤細胞(ManoranjanSantra，Inge Eichstetter and Renato V.Iozzo An anti-oncogenic role for Decorindown-regulation of ErbB2 leads to growth suppression and cytodifferentiation ofmammary carcinoma cells.The Journal of Biological Chemistry 2000；275(45)35153-35161)。

發(fā)明內容
為了解決上述現有技術中存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種利用CXCR4的拮抗劑SDF-1/54R通過人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)(IgG1Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)與Decorin連接構建成具有雙重靶效應基因嵌合重組體SDF-1/54R-IgG1HCHR-Decorin，該基因嵌合重組體既能抑制乳腺癌轉移又能抑制乳腺癌生長。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因嵌合重組體的構建方法。
本發(fā)明在獲得對CXCR4具高活性拮抗效應的CXCL12突變子SDF-1/54R的基礎上(發(fā)明名稱為“基質細胞衍生因子-1重組突變體SDF-1/54R的構建、制備及其應用”，專利申請?zhí)枮椤?3146833.0”)，借助人類IgGl抗體重鏈的鉸鏈區(qū)將重組Decorin成熟肽與CXCL12突變子SDF-1/54R連接，構建雙重靶效應的Decorin與SDF-1/54R基因嵌合重組體。該嵌合體具有同步識別CXCR4和HER-2高表達的乳腺腫瘤細胞，高選擇性地大量聚集乳腺原發(fā)腫瘤及其轉移灶組織，封閉CXCR4，破壞在原發(fā)灶與遠程特定轉移器官間存在的CXCL12梯度，切斷乳腺癌轉移的潛在通路，利用其結構中的Decorin，特異性阻斷HER-2高表達所產生的乳腺癌浸潤性生長和轉移產生的效應。
本發(fā)明通過如下技術方案來實現一種人基質細胞衍生因子-1(SDF-1，stramal cell derived factor-1)重組突變體SDF-1/54R通過人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)(IgG1 Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)與Decorin連接而形成的雙重靶效應基因嵌合重組體。
所述雙重靶效應基因嵌合重組體核酸編碼序列為aagcccgtcagcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtcaagcatctcaaaattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaagtgtgcattgacccgaagctcgagCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAggatccgatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttcgagccctccctaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatgccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggatcttccccctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaaccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagttagtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatctgtccaagaatcagctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccatgagaatgagatcaccaaagtgcgaaaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaactgggcaccaatccgctgaagagctcaggaattgaaaatggggctttccagggaatgaagaagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcattcctcaaggtcttcctccttcccttacggaattacatcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagcctgaaaggactgaataatttggctaagttgggattgagtttcaacagcatctctgctgttgacaatggctctctggccaacacgcctcatctgagggagcttcacttggacaacaacaagcttaccagagtacctggtgggctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcataacaacaatatctctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacacaacaccaaaaaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagcaacccggtccagtactgggagatacagccatccaccttcagatgtgtctacgtgcgctctgccattcaactcggaaactataag。
所述雙重靶效應基因嵌合重組體氨基酸序列為Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu SerHis Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro
Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg GlnVal Cys Ile Asp Pro Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr HisThr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly ProGlu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val CysPro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp LeuGly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu LeuAsp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe LysAsn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile SerLys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg LeuTyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro LysThr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val ArgLys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu GlyThr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln GlyMet Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr SerIle Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp GlyAsn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn AsnLeu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp AsnGly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp AsnAsn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr IleGln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser SerAsp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser GlyVal Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro SerThr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn TyrLys。
本發(fā)明用特異性引物以SDF-54/R/pET-30a(+)為模板擴增SDF-54/R，并將其直接插入T-A克隆載體pMD18-T，然后在其3’-端順次加入人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)編碼序列和Decorin成熟肽編碼序列，構建成SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重組體。
為了實現上述發(fā)明目的，所述雙重靶效應基因嵌合重組體構建方法包括如下步驟(1)引物1和引物2以SDF-54/R/PET30a+為模板擴增SDF-54/R，在5’和3’端分別引入KpnI和XhoI酶切位點，在5’端引入腸激酶(EK，enterokinase)編碼序列，去除編碼序列3’端的終止密碼子；SDF-54/R PCR產物直接插入T-A克隆載體pMD18-T(TAKARA，大連)并轉化JM109。篩選白色的陽性菌落抽提質粒，酶切鑒定正確后進入下一步。
(2)SDF-54/R/pMD18-T重組體和IgG1HCHR分別用XhoI和BamHI進行雙酶切；酶切后的IgG1HCHR/XhoI+BamHI插入酶切后的SDF-54/R/pMD18-T/XhoI+BamHI，轉化JM109，挑取陽性菌落，酶切鑒定SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T正確后進入下一步。
(3)從人骨髓細胞中提取總RNA，反轉錄成cDNA，根據天然Decorin的基因序列設計兩條Decorin特異性核苷酸引物3和引物4，用引物3和引物4PCR擴增Decorin的成熟肽編碼序列，Decorin的PCR產物直接插入T-A克隆載體pMD18-T，篩選白色陽性菌落提取質粒酶切初步鑒定后進行測序確認。
(4)將Decorin從Decorin/pMD18-T用BamHI & EcoRI切下，插入同樣用BamHI和EcoRI雙酶切的SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T/BamHI+EcoRI，連接產物轉化JM109，挑取陽性菌落PCR初步鑒定，然后測序證實，測序表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重組體構建完全正確。
(5)用KpnI和EcoRI將SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin從SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T上切下，定向克隆至同樣被KpnI和EcoRI雙酶切的pET30-a(+)，轉化JM109。挑取陽性克隆抽提質粒做酶切鑒定。經確證的SDF-54/R-IgGlHCHR-Decorin/pET30-a(+)轉化BL21(DE3)，用IPTG進行誘導表達，收獲裂解菌體，上清液通過Ni親和介質進行純化，最后用腸激酶切掉His-Tag，過HPLC柱得到純化的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin重組蛋白。
所述人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)(IgG1 Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)編碼序列 CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA 由上海生工合成，在5’-端帶有XhoI限制性酶切位點，3’-端帶有BamHI限制性酶切位點。
所述引物1為5’-ggggtaccgacgacgacgacaagaagcccgtcagcctgagctacagat-3’；所述引物2為5’-ccgctcgagcttcgggtcaatgcacac-3’；所述引物3為5’cgggatccgatgaggcttctgggataggcc-3’，所述引物3含有酶切位點BamHI；所述引物4為5’ggaattcttacttatagtttccgagtt-3’，所述引物4含有酶切位點EcoRI和終止密碼子。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述雙重靶效應基因嵌合重組體在抑制人乳腺癌細胞或組織的生長和轉移中的應用。
本發(fā)明與現有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明SDF-1/54R-IgG1HCHR-Decorin嵌合重組體具有如下特點1)能同步識別CXCR4和HER-2高表達的乳腺腫瘤細胞，故高選擇性地大量聚集乳腺原發(fā)腫瘤及其轉移灶組織；2)利用其結構中CXCR4拮抗性配體部分與CXCR4特異性結合，封閉CXCR4，破壞了在原發(fā)灶與遠程特定轉移器官間存在的CXCL12梯度，切斷乳腺癌轉移的潛在通路；3)利用其結構中Decorin，特性異性阻斷HER-2高表達所產生的乳腺癌浸潤性生長和轉移產生的效應。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例1SDF-1/54R-IgG1HCHR-Decorin嵌合基因及其原核表達系統(tǒng)的構建1、用引物15’-ggggtaccgacgacgacgacaagaagcccgtcagcctgagctacagat-3’和引物2 5’-ccgctcgagcttcgggtcaatgcacac-3’以SDF-54/R/pET30-a(+)(發(fā)明名稱“基質細胞衍生因子-1重組突變體SDF-1/54R的構建、制備及其應用”，專利申請?zhí)枴?3146833.0”)為模板擴增SDF-54/R，在5’和3’端分別引入KpnI和XhoI酶切位點，在5’端引入EK識別位點-(Asp)4Lys編碼序列以便切除最終表達的融合蛋白的His-Tag，同時去除編碼序列3’端的終止密碼子。PCR循環(huán)為94℃預變性5min，然后94℃10s，55℃10s，72℃10s，32個循環(huán)，最后72℃延伸3min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離得200bp左右的條帶，與理論大小一致。SDF-54/R PCR產物用TAKARA公司生產的DNA膠回收試劑盒回收目的條帶，用質粒連接試劑盒(TAKARA，大連)進行連接直接插入T-A克隆載體pMD18-T(TAKARA，大連)并用CaCl2法轉化JM109。篩選白色的陽性菌落，擴增并按質粒小量抽提試劑盒(Omega)的操作說明提取重組質粒，KpnI和XhoI酶切鑒定表明SDF-54/R已正確插入pMD18-T，SDF-54/R/pMD18-T初步鑒定構建成功。
2、人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)(IgG1 Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)編碼序列為 CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC ATG CCCACCGTGCCCA 由上海生工合成，在5’-端和3’-端分別帶有XhoI和BamHI限制性酶切位點。
3、SDF-54/R/pMD18-T重組體和IgG1HCHR分別用XhoI和BamHI(TAKARA，大連)進行雙酶切。乙醇沉淀法純化酶切產物IgG1HCHR/XhoI+BamHI；1％瓊脂糖凝膠電泳分離，TAKARA公司生產的DNA膠回收試劑盒回收酶切產物SDF-54/R/pMD18-T/XhoI+BamHI。用DNALigation KitVersion2(TAKARA，大連)將IgG1HCHR/XhoI+BamHI連接入T-A克隆載體pMD18-T(TAKARA，大連)并用CaCl2法轉化JM109。挑取陽性菌落，擴增并E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit I(按質粒小量抽提試劑盒)(Omega)的操作說明提取重組質粒。KpnI和BamHI雙酶切鑒定表明IgG1HCHR已正確插入SDF-54/R/pMD18-T，初步鑒定表明SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T構建成功。
4、取正常人骨髓，用TRIZOL組織裂解液(TRIZOLLS Reagent(Invitrogen)裂解骨髓組織，并按操作說明提取總RNA，然后采用第一鏈反轉錄聚合酶鏈式反應合成系統(tǒng)(SuperScript First-Strand Synthesis System forRT-PCR，Invitrogen)按試劑盒提供的方法合成cDNA.根據GENEBANK提供的Decorin的基因序列設計引物3為5’cgggatccgatgaggcttctgggataggcc3’；引物4為5’ggaattcttacttatagtttccgagttg3’，引物3含有酶切位點BamHI，引物4含有酶切位點EcoRI和終止密碼子，用引物3和引物4PCR擴增Decorin的成熟肽編碼序列。PCR循環(huán)為94℃預變性5min，然后94℃10s，56℃10s，72℃15s，32個循環(huán)，最后72℃延伸5min。經1％瓊脂糖凝膠電泳分離得1000bp左右的條帶，與理論大小一致；用TAKARA公司生產的DNA膠回收試劑盒回收目的條帶?；厥盏腜CR產物采用DNA Ligation Kit Version2(質粒連接試劑盒)(TAKARA)直接連接入pMD18-T，CaCl2法轉化JM109。挑取陽性菌落，擴增并按E.Z.N.APlasmid Miniprep Kit I(質粒小量抽提試劑盒)(Omega)的操作說明提取重組質粒。DNA自動測序儀(上海生工)測序鑒定表明Decorin/pMD18-T重組體構建成功。
5、將Decorin從Decorin/pMD18-T用BamHI & EcoRI切下，并用TAKARA公司生產的DNA膠回收試劑盒回收Decorin/BamHI+EcoRI，回收產物用質粒連接試劑盒(TAKARA)直接連接入同樣用BamHI & EcoRI雙酶切并膠回收的SDF-54/R-IgGlHCHR/pMD18-T/BamHI+EcoRI。連接產物轉化JM109，挑取陽性菌落PCR初步鑒定，然后用DNA自動測序儀(上海生工)測序鑒定表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重組體構建完全正確。
6、用KpnI&EcoRI(TAKARA，大連)將SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin從SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T上切下，用TAKARA公司生產的DNA膠回收試劑盒回收目的條帶SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/KpnI+EcoRI，DNA Ligation Kit Version2定向克隆至同樣被KpnI&EcoRI雙酶切的原核表達載體(NOVAGEN)pET-30a(+)，CaCl2法轉化JM109。挑取陽性克隆，擴增并按質粒小量抽提試劑盒(Omega)的操作說明提取重組質粒，酶切鑒定表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin已正確插入pET-30a(+)，DNA自動測序儀(上海生工)測序鑒定表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)嵌合重組體構建完全正確。本發(fā)明雙重靶效應基因嵌合重組體核酸編碼序列及氨基酸序列見序列表。
實施例2SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)嵌合重組體原核表達和純化1、經確證的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)重組質粒約200ng加入200μl感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)(NOVAGEN)細胞中(氯化鈣法制備)，輕輕混勻，在冰上放置30min，然后在42℃熱休克90s，立即轉到冰上放置2min，隨后加入800μl LB培養(yǎng)液在37℃條件下振蕩培養(yǎng)45min，取200μl鋪到含50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜(約12hr)，隨機挑取5個陽性菌落分別接種于50ml的LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)37℃振蕩培養(yǎng)約12hr，然后分別取50μl上述培養(yǎng)液轉接于50ml的LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素)37℃振蕩培養(yǎng)約3hr，當OD600＝0.5時，分別加入終濃度為0.75mM的IPTG 37℃誘導表達3hr，3000×g離心15min收獲細胞。然后按ProBondTMresinFor Purification of 6xHis-Tagged Proteins(鎳固相親和層析樹脂)(Invitrogen，Catalog nos.R801-01，R801-15)的操作說明進行純化，具體操作如下1)Guanidinium(鹽酸胍)裂解緩沖液(6M鹽酸胍，20mM NaPO4，pH7.8500mM NaCl)至37℃。
2)重懸菌體于8ml鹽酸胍裂解緩沖液中。
3)在冰上超聲處理細胞裂解液5s，間隔5s，重復4次。
4)在60℃條件下緩慢振蕩30min以保證菌體全部裂解。
5)3,000×g離心15min，將上清轉入干凈的試管中，取5μl裂解液上清用作SDS-PAGE檢測樣品。
6)加2mlProBondTMresin(樹脂)到8ml上清液中。
7)室溫下輕微振蕩結合30min，800×g離心15min，去除上清液。
8)用4ml Denaturing(變性)結合緩沖液(8M尿素(Urea)，20mM NaPO4，pH7.8，500mM NaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800×g離心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復一次。
9)用4ml變性洗滌緩沖液(8M Urea，20mM NaPO4，pH6.0，500mM NaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800×g離心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復一次。
10)用8ml非變性洗滌緩沖液(20mM imidazole(咪唑)，20mM NaPO4，pH8.0，500mM NaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌2min，800×g離心15min，小心去除上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE檢測樣品。此步驟重復三次。
11)用8ml溶出緩沖液(500mM咪唑，20mM NaPO4，pH8.0，500mMNaCl)重懸沉淀，在室溫下振蕩洗滌15min，800×g離心15min，小心吸取上清于干凈的試管中，并取50μl上清用作SDS-PAGE檢測樣品，其余保存于-80℃。
SDS-PAGE檢測結果表明，SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)重組體能夠在大腸桿菌BL21(DE3)中正常表達，Ni親和純化出約50KD的目標蛋白帶，與理論分子量49.42KD一致，純度至少在80％以上。
12)在4℃用復性緩沖液A(3M尿素，20mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，1mM 2-巰基乙醇(2-Mecaptoethanol)，135mM NaCl)透析上述樣品16～24hr。用復性緩沖液B(1.5M尿素，20mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，1mM2-巰基乙醇，135mM NaCl)繼續(xù)透析上述樣品16～24hr。用復性緩沖液C(20mMTris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，135mM NaCl，0.1mM GSH(還原型谷胱甘肽)，0.01mM GSSG(氧化型谷胱甘肽))繼續(xù)透析上述樣品16～24hr。用復性緩沖液D(20mM Tris-HCl(pH7.5)，135mM NaCl)繼續(xù)透析上述樣品16～24hr。
13)超濾濃縮后按說明書提供的條件用腸激酶EnterokinaseMaxTM(EKMaxTM)(Invitrogen，Catalog nos.E180-01，E180-02)切除His-Tag。
14)反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin，His-Tag和腸激酶(Enterokinase)，最后得純化的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin，儲存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 實施例3生物活性測定1、MTT收集對數期MDA-MB-231細胞，調整細胞懸液濃度，接種于7塊96孔板，1×103Cells/孔；置37℃、5％CO2溫箱培養(yǎng)使細胞貼壁；加入預定終濃度的野生型嵌合體SDF-1WT-IgG1HCHR-Decorin和突變體嵌合體SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin蛋白，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，開始計時培養(yǎng)，分別在第0hr(加藥完畢開始計時時為0點)、24hr、48hr、72hr、96hr、120hr、144hr等時間點取出96孔板進行常規(guī)MTT檢測，最后進行數據統(tǒng)計，以OD(490nm)值為縱軸，處理時間為橫軸，描繪SDF-1WT-IgG1HCHR-Decorin和SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin對乳腺癌細胞MDA-MB-231生長的抑制效應。
2、SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin誘導MDA-MB231細胞遷徙的活性SDF-1WT-IgG1HCHR-Decorin和SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin按照一定濃度梯度加入細胞趨化實驗趨化槽的下層培養(yǎng)腔(液體容積為700μl)，小心將經纖連蛋白(fibronectin)預處理的上腔置入下層培養(yǎng)腔，并使之腔底懸浮于下腔之中。將MDA-MB-231細胞懸液加入上腔，于37℃培養(yǎng)8小時后，取下上腔底部濾膜，用棉刷輕輕去除膜上表面黏附的細胞，保留下表面黏附的細胞，將濾膜置入甲醇溶液固定后用蘇木精伊紅染色，記數濾膜下表面的細胞數。與未經任何處理的細胞相比，野生型嵌合體SDF-1WT-IgG1HCHR-Decorin明顯的誘導MDA-MB-231細胞從上腔向下腔遷徙，其作用強度呈明顯的劑量依賴關系；而在相同條件下，突變嵌合體SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin卻沒有顯示出明顯的誘導乳腺癌細胞遷徙的作用。
3、DF-54/R-IgG1HCHR-Decorin抑制野生型SDF-1α誘導的MDA-MB-231細胞遷徙的活性MDA-MB-231細胞分別被不同濃度梯度的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin(10-9～10-5Mol)于37℃預處理3hr，再加入20nM野生型SDF-1α處理5小時，以觀察SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin對野生型SDF-1α誘導MDA-MB-231遷徙的抑制作用。結果表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin明顯抑制野生型SDF-1α誘導的MDA-MB-231遷徙，其抑制作用呈明顯的劑量依賴關系。
雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用.ST25SEQUENCE LISTING<110>暨南大學<120>雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1203<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(1)..(162)<223>碳末端α螺旋缺失的人基質細胞衍生因子突變體(SDF-1/54R)的編碼序列<220>
<221>CDS<222>(163)..(168)<223>Artificial Sequence，XhoI酶切位點<220>
<221>CDS<222>(169)..(210)<223>人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)編碼序列(IgG1 Heavy Chain Hinge Region，IgG1HCHR)<220>
<221>CDS<222>(211)..(216)<223>Artificial Sequence，BamHI酶切位點<220>
<221>CDS<222>(217)..(1203)<223>Decorin基因成熟肽編碼序列<400>1aag ccc gtc agc ctg agc tac aga tgc cca tgc cga ttc ttc gaa agc 48Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser1 5 10 15cat gtt gcc aga gcc aac gtc aag cat ctc aaa att ctc aac act cca 96His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro20 25 30aac tgt gcc ctt cag att gta gcc cgg ctg aag aac aac aac aga caa144Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln35 40 45gtg tgc att gac ccg aag ctc gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac192Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His50 55 60aca tgc cca ccg tgc cca gga tcc gat gag gct tct ggg ata ggc cca240Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro65 70 75 80gaa gtt cct gat gac cgc gac ttc gag ccc tcc cta ggc cca gtg tgc288Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys85 90 95ccc ttc cgc tgt caa tgc cat ctt cga gtg gtc cag tgt tct gat ttg336Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu100 105 110ggt ctg gac aaa gtg cca aag gat ctt ccc cct gac aca act ctg cta384Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu
雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用.ST25115 120 125gac ctg caa aac aac aaa ata acc gaa atc aaa gat gga gac ttt aag 432Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys130 135 140aac ctg aag aac ctt cac gca ttg att ctt gtc aac aat aaa att agc 480Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser145 150 155 160aaa gtt agt cct gga gca ttt aca cct ttg gtg aag ttg gaa cga ctt 528Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu165 170 175tat ctg tcc aag aat cag ctg aag gaa ttg cca gaa aaa atg ccc aaa 576Tyr Leu Ser Lys Ash Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys180 185 190act ctt cag gag ctg cgt gcc cat gag aat gag atc acc aaa gtg cga 624Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg195 200 205aaa gtt act ttc aat gga ctg aac cag atg att gtc ata gaa ctg ggc 672Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly210 215 220acc aat ccg ctg aag agc tca gga att gaa aat ggg gct ttc cag gga 720Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly225 230 235 240atg aag aag ctc tcc tac atc cgc att gct gat acc aat atc acc agc 768Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser245 250 255att cct caa ggt ctt cct cct tcc ctt acg gaa tta cat ctt gat ggc 816Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly260 265 270aac aaa atc agc aga gtt gat gca gct agc ctg aaa gga ctg aat aat 864Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn275 280 285ttg gct aag ttg gga ttg agt ttc aac agc atc tct gct gtt gac aat 912Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn290 295 300ggc tct ctg gcc aac acg cct cat ctg agg gag ctt cac ttg gac aac 960Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn305 310 315 320aac aag ctt acc aga gta cct ggt ggg ctg gca gag cat aag tac atc1008Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile325 330 335cag gtt gtc tac ctt cat aac aac aat atc tct gta gtt gga tca agt1056Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser340 345 350gac ttc tgc cca cct gga cac aac acc aaa aag gct tct tat tcg ggt1104Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly355 360 365gtg agt ctt ttc agc aac ccg gtc cag tac tgg gag ata cag cca tcc1152Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser370 375 380acc ttc aga tgr gtc tac gtg cgc tct gcc att caa ctc gga aac tat1200Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr385 390 395 400aag1203Lys
雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用.ST25<210>2<211>401<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser1 5 10 15His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro20 25 30Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln35 40 45Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His50 55 60Thr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly Pro65 70 75 80Glu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val Cys85 90 95Pro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp Leu100 105 110Gly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu Leu115 120 125Asp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe Lys130 135 140Asn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile Ser145 150 155 160Lys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg Leu165 170 175Tyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro Lys180 185 190Thr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val Arg195 200 205Lys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu Gly210 215 220Thr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln Gly225 230 235 240Met Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr Ser245 250 255Ile Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp Gly260 265 270
雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用.ST25Asn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn Asn275 280 285Leu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp Asn290 295 300Gly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp Asn305 310 315 320Asn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr Ile325 330 335Gln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser Ser340 345 350Asp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser Gly355 360 365Val Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro Ser370 375 380Thr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn Tyr385 390 395 400Lys<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>根據人SDF-1序列設計的5’-末端引物，用以克隆人SDF-1/54R<400>3ggggtaccga cgacgacgac aagaagcccg tcagcctgag ctacagat 48<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>根據人SDF-1序列設計的3’-末端引物，用以克隆人SDF-1/54R<400>4ccgctcgagc ttcgggtcaa tgcacac 27<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>根據人Decorin基因cDNA序列設計的5’-末端引物，用以克隆人Decorin基因成熟肽編碼序列雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用.ST25<400>5cgggatccga tgaggcttct gggataggcc 30<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>根據入Decorin基因cDNA序列設計的3’-末端引物，用以克隆人Decorin基因成熟肽編碼序列<400>6ggaattctta cttatagttt ccgagttg28
權利要求
1.一種雙重靶效應基因嵌合重組體，其特征在于，所述雙重靶效應基因嵌合重組體核酸編碼序列為aagcccgtcagcctgagctacagatgcccatgccgattcttcgaaagccatgttgccagagccaacgtcaagcatctcaaaattctcaacactccaaactgtgcccttcagattgtagcccggctgaagaacaacaacagacaagtgtgcattgacccgaagctcgagCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAggatccgatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttcgagccctccctaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatgccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggatcttccccctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaaccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagttagtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatctgtccaagaatcagctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccatgagaatgagatcaccaaagtgcgaaaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaactgggcaccaatccgctgaagagctcaggaattgaaaatggggctttccagggaatgaagaagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcattcctcaaggtcttcctccttcccttacggaattacatcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagcctgaaaggactgaataatttggctaagttgggattgagtttcaacagcatctctgctgttgacaatggctctctggccaacacgcctcatctgagggagcttcacttggacaacaacaagcttaccagagtacctggtgggctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcataacaacaatatctctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacacaacaccaaaaaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagcaacccggtccagtactgggagatacagccatccaccttcagatgtgtctacgtgcgctctgccattcaactcggaaactataag；所述雙重靶效應基因嵌合重組體氨基酸序列為Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu SerHis Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr ProAsn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg GlnVal Cys Ile Asp Pro Lys Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr HisThr Cys Pro Pro Cys Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Ile Gly ProGlu Val Pro Asp Asp Arg Asp Phe Glu Pro Ser Leu Gly Pro Val CysPro Phe Arg Cys Gln Cys His Leu Arg Val Val Gln Cys Ser Asp LeuGly Leu Asp Lys Val Pro Lys Asp Leu Pro Pro Asp Thr Thr Leu LeuAsp Leu Gln Asn Asn Lys Ile Thr Glu Ile Lys Asp Gly Asp Phe LysAsn Leu Lys Asn Leu His Ala Leu Ile Leu Val Asn Asn Lys Ile SerLys Val Ser Pro Gly Ala Phe Thr Pro Leu Val Lys Leu Glu Arg LeuIyr Leu Ser Lys Asn Gln Leu Lys Glu Leu Pro Glu Lys Met Pro LysThr Leu Gln Glu Leu Arg Ala His Glu Asn Glu Ile Thr Lys Val ArgLys Val Thr Phe Asn Gly Leu Asn Gln Met Ile Val Ile Glu Leu GlyThr Asn Pro Leu Lys Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Ala Phe Gln GlyMet Lys Lys Leu Ser Tyr Ile Arg Ile Ala Asp Thr Asn Ile Thr SerIle Pro Gln Gly Leu Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu His Leu Asp GlyAsn Lys Ile Ser Arg Val Asp Ala Ala Ser Leu Lys Gly Leu Asn AsnLeu Ala Lys Leu Gly Leu Ser Phe Asn Ser Ile Ser Ala Val Asp AsnGly Ser Leu Ala Asn Thr Pro His Leu Arg Glu Leu His Leu Asp AsnAsn Lys Leu Thr Arg Val Pro Gly Gly Leu Ala Glu His Lys Tyr IleGln Val Val Tyr Leu His Asn Asn Asn Ile Ser Val Val Gly Ser SerAsp Phe Cys Pro Pro Gly His Asn Thr Lys Lys Ala Ser Tyr Ser GlyVal Ser Leu Phe Ser Asn Pro Val Gln Tyr Trp Glu Ile Gln Pro SerThr Phe Arg Cys Val Tyr Val Arg Ser Ala Ile Gln Leu Gly Asn TyrLys。
2.根據權利要求1所述的一種雙重靶效應基因嵌合重組體的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括如下步驟(1)引物1和引物2以SDF-54/R/pET-30a(+)為模板擴增SDF-54/R，在5’和3’端分別引入KpnI和XhoI酶切位點，在5’端引入腸激酶編碼序列，去除編碼序列3’端的終止密碼子；SDF-54/R PCR產物直接插入T-A克隆載體pMD18-T并轉化JM109，篩選白色的陽性菌落抽提質粒，酶切鑒定；(2)SDF-54/R/pMD18-T重組體和人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)編碼序列分別用XhoI和BamHI進行雙酶切，酶切后的IgG1HCHR/XhoI+BamHI插入酶切后的SDF-54/R/pMD18-T/XhoI+BamHI，轉化JM109，挑取陽性菌落，酶切鑒定SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T；(3)從人骨髓細胞中提取總RNA，反轉錄成cDNA，根據天然Decorin的基因序列設計兩條Decorin特異性核苷酸引物3和引物4，用引物3和引物4PCR擴增Decorin的成熟肽編碼序列，Decorin的PCR產物直接插入T-A克隆載體pMD18-T，篩選白色陽性菌落，提取質粒，酶切初步鑒定后進行測序確認；(4)將Decorin從Decorin/pMD18-T用BamHI & EcoRI切下，插入同樣用BamHI和EcoRI雙酶切的SDF-54/R-IgG1HCHR/pMD18-T/BamHI+EcoRI，連接產物轉化JM109，挑取陽性菌落PCR初步鑒定，然后測序證實；測序表明SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T嵌合重組體構建正確；(5)KpnI和EcoRI將SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin從SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pMD18-T上切下，定向克隆至同樣被KpnI和EcoRI雙酶切的pET-30a(+)，轉化JM109；挑取陽性克隆抽提質粒做酶切鑒定；經確證的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin/pET-30a(+)轉化BL21，用IPTG進行誘導表達，收獲裂解菌體，上清液通過Ni親和介質進行純化，最后用腸激酶切掉His-Tag，過HPLC柱得到純化的SDF-54/R-IgG1HCHR-Decorin重組蛋白。
3.根據權利要求2所述的雙重靶效應基因嵌合重組體的構建方法，其特征在于，所述人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)編碼序列為 CCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA ，其5’-端帶有XhoI限制性酶切位點，3’-端帶有BamHI限制性酶切位點。
4.根據權利要求2所述的雙重靶效應基因嵌合重組體的構建方法，其特征在于，所述引物1為5’-ggggtaccgacgacgacgacaagaagcccgtcagcctgagctacagat-3’；所述引物2為5’-ccgctcgagcttcgggtcaatgcacac-3’；所述引物3為5’-cgggatccgatgaggcttctgggataggcc-3’；所述引物3含有酶切位點BamHI；所述引物4為5’-ggaattcttacttatagtttccgagttg-3’，所述引物4含有酶切位點EcoRI和終止密碼子。
5.根據權利要求1所述的一種雙重靶效應基因嵌合重組體在抑制人乳腺癌細胞或組織的生長和轉移中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雙重靶效應基因嵌合重組體及其構建方法和應用。用特異性引物以SDF－54/R/pET－30a(+)為模板擴增SDF－54/R，并將其直接插入T－A克隆載體pMD18－T，然后在其3’－端順次加入人類IgG1抗體重鏈的鉸鏈區(qū)編碼序列和Decorin成熟肽編碼序列，構建成SDF－54/R－IgG1HCHR－Decorin/pMD18－T嵌合重組體。SDF－54/R－IgG1HCHR－Decorin保留對CXCR4的親和力而失去其內在活性，并能抑制野生型SDF－1α對乳腺癌細胞的趨化遷移活性、抑制乳腺癌細胞的生長，其可作為CXCR4的新型拮抗劑—同時抑制CXCR4陽性腫瘤細胞的生長和轉移，具有雙重靶效應。
文檔編號C12N15/09GK1789424SQ200510100750
公開日2006年6月21日 申請日期2005年11月1日 優(yōu)先權日2005年11月1日
發(fā)明者蔡紹暉, 杜軍, 譚毅, 蔡紹皙, 馬偉峰, 陳宏遠, 郭自剛 申請人:暨南大學