專利名稱：粒狀殺線蟲劑的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可長期保存對于松材線蟲、根結(jié)線蟲、包囊線蟲、根腐線蟲(キタネグサレセンチユウ)等具有殺線蟲作用的菌的粒狀殺線蟲劑的制造方法。
背景技術(shù)：
例如特公平2-32251號公報中記載了屬于曲霉屬(Aspergillussp.)的菌，該菌是作為對于以松天牛為媒介昆蟲的寄生在松樹上的松材線蟲、寄生在黃瓜或卷心菜上的根結(jié)線蟲、寄生在馬鈴薯上的包囊線蟲具有殺線蟲作用的菌。不過，在上述專利文獻(xiàn)中沒有對其制劑進(jìn)行詳細(xì)的研究，調(diào)查其他文獻(xiàn)也沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的報道。
因此，本發(fā)明的目的是提供可長期保存對于松材線蟲、根結(jié)線蟲、包囊線蟲、根腐線蟲等具有殺線蟲作用的菌的粒狀殺線蟲劑的制造方法。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述問題點，本發(fā)明的殺線蟲劑的制造方法，其特征是，如權(quán)利要求1所記載的在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有殺線蟲作用的菌后，將得到的菌培養(yǎng)物和粒狀載體混合。
此外，權(quán)利要求2記載的制造方法，其特征是，在權(quán)利要求1記載的制造方法中，具有殺線蟲作用的菌是屬于曲霉菌屬(Aspergillussp.)的對于松材線蟲、根結(jié)線蟲、包囊線蟲、根腐線蟲中的至少一種線蟲具有殺線蟲作用的菌。
此外，權(quán)利要求3記載的制造方法，其特征是，在權(quán)利要求1記載的制造方法中，粒狀載體為粒狀蛭石。
此外，本發(fā)明的粒狀殺線蟲劑，其特征是，該粒狀殺線蟲劑由如權(quán)利要求4所記載的在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有殺線蟲作用的菌所得到的菌培養(yǎng)物和粒狀蛭石所組成。
根據(jù)本發(fā)明，提供可長期保存對于松材線蟲、根結(jié)線蟲、包囊線蟲等具有殺線蟲作用的菌的粒狀殺線蟲劑的制造方法。


圖1表示實施例1的4種粒狀殺線蟲劑的有效菌的生存時間評價試驗結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明的粒狀殺線蟲劑的制造方法，其特征是，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有殺線蟲作用的菌后，將得到的菌培養(yǎng)物和粒狀載體混合。根據(jù)本發(fā)明，能制造可以長期保存菌的粒狀殺線蟲劑。
為了能夠長期保存菌，希望保持菌以孢子狀態(tài)和載體混合。在本發(fā)明中，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有殺線蟲作用的菌的工序能促進(jìn)菌的孢子形成?？梢杂眠m于培養(yǎng)對象菌的公知的材料或條件作為固體培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件。作為固體培養(yǎng)基，可列舉至少向蛭石、珍珠石、泥炭苔、植物體的炭化物等粉碎物中至少添加水、形成菌的孢子所必需的營養(yǎng)成分的PDB(potatostarch，dextrose，broth)和馬鈴薯片(米糠也可以)的物質(zhì)或添加米糠(麩皮也可以)和相應(yīng)需要的各種無機(jī)成分(NaNO3、K2HPO4、MgSO4、KCl、FeSO4)、或麥芽提取物、或蛋白胨或葡萄糖的物質(zhì)。在固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分的量，使用能促進(jìn)菌的孢子形成的一般量即可。具體而言，作為固體培養(yǎng)基，可列舉含有PDB1重量％～1.5重量％和米糠(麩皮也可以)10重量％～30重量％的培養(yǎng)基，或含有相應(yīng)需要的各種無機(jī)成分(NaNO3、K2HP4、MgSO4、KCl、FeSO4)或麥芽提取物、或葡萄糖、或蛋白胨的培養(yǎng)基。在20℃～30℃下，培養(yǎng)10天～28天，培養(yǎng)直至固體培養(yǎng)基中的菌數(shù)達(dá)到108cfu/g～109cfu/g左右即可。
另外，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的具有殺線蟲作用的菌也可以是預(yù)先在公知的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌培養(yǎng)物。不過，如果將在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌培養(yǎng)物直接和粒狀載體混合，因為液體培養(yǎng)基中難以形成菌的孢子，所以不能得到含大量菌的制劑，存在有不能長期保存菌、或制劑時需要用于將液體培養(yǎng)基中所含的水去除的干燥工序的問題。所以，菌必須在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再和粒狀載體混合。將菌預(yù)先在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，所用的液體培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件可以采用適于培養(yǎng)對象菌的公知條件。例如作為液體培養(yǎng)基，用相對100重量份的水，含有2重量份～3重量份的PDB的PDB培養(yǎng)基，或者相對100重量份的水，含有麥芽提取物1重量份～3重量份、葡萄糖1重量份～3重量份、蛋白胨0.05重量份～0.3重量份的麥芽提取物·葡萄糖·蛋白胨培養(yǎng)基。培養(yǎng)可在20℃～35℃下，震蕩培養(yǎng)3天～10天即可。
作為混合固體培養(yǎng)基所培養(yǎng)的菌培養(yǎng)物的粒狀載體，可列舉蛭石、珍珠石、泥炭苔、植物體的炭化物等的粒狀物，從可以長期保存雜菌不共存的有效菌，即僅長期保存具有殺線蟲作用的菌這一點出發(fā)，優(yōu)選使用粒狀蛭石。另外，希望粒狀載體的粒徑為1μm～7mm。
例如，可以用混合粉體或粒狀物通常使用的混合攪拌機(jī)對用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌和粒狀載體進(jìn)行混合。也可以將二者或任何一方預(yù)先粉碎成粒狀再混合，也可以在混合時，進(jìn)行粉碎使之成為粒狀。二者的混合比例，取決于菌培養(yǎng)物中含有的菌數(shù)，希望設(shè)定成使制造的粒狀殺蟲劑中含有期望數(shù)量的菌(例如5×105cfu/cm3～109cfu/cm3)。
作為具有殺線蟲作用的菌，優(yōu)選使用屬于曲霉屬(Aspergillussp.)的菌，該菌是對于松材線蟲、根結(jié)線蟲、包囊線蟲、根腐線蟲等具有殺線蟲作用的菌。具體可列舉蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillusmelleus JAM4022，F(xiàn)ERM BP-726)，此外，也可以使用寄生曲霉JAM4002(Aspergillus parasiticus JAM4002，F(xiàn)ERM BP-724)、塔木里氏曲霉JAM4007(Aspergillus tamarii JAM4007，F(xiàn)ERM BP-723)、煙曲霉JAM4008(Aspergillus fumigatus JAM4008，F(xiàn)ERM BP-727)、黑曲霉JAM4054(Aspergillus niger JAM4054，F(xiàn)ERM BP-8300)、黑曲霉JAM4055(Aspergillus niger JAM4055，F(xiàn)ERM BP-8301)等。其中，JAM指的是株式會社應(yīng)微研的菌株分類號(JAPANAPPLIDE RESEARCHMICROORGANISMS的簡稱)。
實施例以下，通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，不過，本發(fā)明不局限于此。
實施例1制造例(工序1)將接種蜂蜜曲霉JAM4022(Aspergillus melleus JAM4022，F(xiàn)ERMBP-726)的孢子進(jìn)行了前培養(yǎng)的PDA培養(yǎng)基(日水制藥公司制造的PDA培養(yǎng)基39重量份，蒸餾水1000重量份)接種到PDB培養(yǎng)基(DIFCO公司制造的PDB培養(yǎng)基2.4重量份、蒸餾水100重量份)中，在25℃震蕩培養(yǎng)7天。將1重量份的在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的菌培養(yǎng)物接種到9重量份的固體培養(yǎng)基(DIFCO公司制造的PDB培養(yǎng)基2.4重量份、富士見園藝公司制造的粉碎珍珠石63重量份、ギャバンスバィス公司制造的馬鈴薯片63重量份、蒸餾水100重量份)中，在25℃培養(yǎng)14天。在菌絲和固體培養(yǎng)基形成凝集塊時，適當(dāng)攪拌，使之分散。確認(rèn)了固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的粒狀的菌培養(yǎng)物中含108cfu/g以上的有效菌(根據(jù)瓊脂平板培養(yǎng)基稀釋法，以下相同)。
(工序2)在常溫下，用混合攪拌機(jī)混合工序1得到的粒狀的菌培養(yǎng)物和粒徑大約50μm左右～大約5mm左右的4種粒狀載體(粒狀蛭石、粒狀珍珠石、粒狀泥炭苔、植物體的粒狀炭化物)，制造粒狀殺線蟲劑。設(shè)定二者的混合比例以使制造的粒狀殺線蟲劑中含有5×105cfu/cm3以上的有效菌。
試驗例對用實施例1的4種粒狀載體制造的不同粒狀殺線蟲劑進(jìn)行在25℃下的為期2個月的有效菌的生存時間試驗評價。結(jié)果如圖1所示。從圖1可以明確看出用粒狀珍珠石和植物體的粒狀炭化物作為粒狀載體的粒狀殺線蟲劑的菌數(shù)顯著減少，用蛭石和粒狀泥炭苔作為粒狀載體的粒狀殺線蟲劑，自從試驗開始，即使經(jīng)過了8個月也幾乎沒有發(fā)現(xiàn)生存菌數(shù)的減少。不過，用泥炭苔作為粒狀載體的粒狀殺線蟲劑中含很多雜菌。
實施例2制造例(工序1)將接種黑曲霉JAM4055(Aspergillus niger JAM4055，F(xiàn)ERMBP-8301)的孢子進(jìn)行了前培養(yǎng)的PDA培養(yǎng)基(日水制藥公司制造的PDA培養(yǎng)基39重量份，蒸餾水1000重量份)接種到液體培養(yǎng)基(オリエンタル酵母工業(yè)公司制造的麥芽提取物20重量份、極東制藥社制備的蛋白胨1重量份、葡萄糖20重量份、蒸餾水1000重量份)中，在25℃震蕩培養(yǎng)7天。將1重量份的在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的菌培養(yǎng)物接種到16重量份的固體培養(yǎng)基(NaNO32.25重量份、K2HPO40.75重量份、MgSO4·7H2O 0.325重量份、KCl 0.325重量份、FeSO4·7H2O0.0075重量份、蔗糖22.5重量份、富士見園藝公司制造的粉碎珍珠石500重量份、米糠500重量份、水分調(diào)節(jié)用稻殼165重量份、蒸餾水750重量份)中，在25℃培養(yǎng)14天。在菌絲和固體培養(yǎng)基形成凝集塊時，適當(dāng)攪拌，使之分散。確認(rèn)了固體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的粒狀的菌培養(yǎng)物中含108cfu/g以上的有效菌。
(工序2)在常溫下，用混合攪拌機(jī)混合工序1得到的粒狀的菌培養(yǎng)物和粒徑大約50μm左右～大約5mm左右的粒狀蛭石，制造粒狀殺線蟲劑。二者的混合比例設(shè)定以使制造的粒狀殺線蟲劑中含有5×105cfu/cm3以上的有效菌。
試驗例將實施例2制造的粒狀殺線蟲劑在25℃下進(jìn)行為期2個月的有效菌的生存時間試驗，對其進(jìn)行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自試驗開始，即使經(jīng)過了6個月的時間，也幾乎沒有發(fā)現(xiàn)生存菌數(shù)的減少，而且?guī)缀醪缓s菌。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明提供了可長期保存對于松材線蟲、根結(jié)線蟲、包囊線蟲等具有殺線蟲作用的菌的粒狀殺線蟲劑的制造方法。從上述出發(fā)點考慮，本發(fā)明具有在產(chǎn)業(yè)上的可利用性。
權(quán)利要求
1.粒狀殺線蟲劑的制造方法，其特征是，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有殺線蟲作用的菌后，將得到的菌培養(yǎng)物和粒狀載體混合。
2.權(quán)利要求1記載的制造方法，其特征是，該具有殺線蟲作用的菌屬于曲霉菌屬(Aspergillus sp.)，該菌是對于選自松材線蟲、根結(jié)線蟲、包囊線蟲中的至少一種線蟲具有殺線蟲作用的菌。
3.權(quán)利要求1記載的制造方法，其特征是，粒狀載體是粒狀蛭石。
4.粒狀殺線蟲劑，其特征是，由在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有殺線蟲作用的菌所得到的菌培養(yǎng)物和粒狀蛭石所組成。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供可長期保存對于松材線蟲、根結(jié)線蟲、包囊線蟲等具有殺線蟲作用的菌的粒狀殺線蟲劑的制造方法。本發(fā)明的粒狀殺線蟲劑的制造方法，其特征在于，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有殺線蟲作用的菌后，將得到的菌培養(yǎng)物和粒狀載體混合。
文檔編號C12N1/14GK1756482SQ200480005809
公開日2006年4月5日 申請日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者門宏超, 山本惠理奈, 菅沼修一 申請人:株式會社應(yīng)微研