專利名稱：一種快速分離目標(biāo)染色體表達(dá)序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速分離目標(biāo)染色體表達(dá)序列的方法。
背景技術(shù)：
染色體微切割和微克隆(Chromosome microdissection andmicrocloning)是指在顯微鏡下，借助顯微操作系統(tǒng)對目標(biāo)染色體或染色體片段進(jìn)行切割，將目標(biāo)染色體或染色體片段分離出來，并克隆位于目標(biāo)染色體上的DNA的技術(shù)。其應(yīng)用領(lǐng)域不只局限于對染色體研究的細(xì)胞遺傳水平，在染色體進(jìn)化研究(Jamilena等，1995；Houbean等，1996)、遺傳圖譜的構(gòu)建(Schondelmaier等，1993；Arumuganathan等，1994)、基因組物理作圖、分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜構(gòu)建(Jung等，1992；Schondelmaier等，1993)、染色體的原位雜交或染色體涂染探針(Zhou等，1999；傅俊江等，1998)等研究領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用。雖然以上幾方面工作已取得了一些成績，但染色體微切割、微分離技術(shù)的真正優(yōu)勢并未充分利用。除非將這一工作與功能基因組研究聯(lián)系起來。從這一角度來看，分離目標(biāo)染色體或染色體片段的表達(dá)序列，將會(huì)使這一技術(shù)的應(yīng)用更有價(jià)值。因?yàn)槟繕?biāo)染色體上的表達(dá)序列的分離，不僅可以提供作圖標(biāo)記和基因的分子標(biāo)記，還與功能基因組研究工作相關(guān)，并可能是分離目標(biāo)染色體或染色體片段上功能基因的有效方法。目前已經(jīng)有一些相關(guān)的工作報(bào)道，即在染色體微切割和微分離技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析相應(yīng)的染色體或染色體片段的表達(dá)序列。
近年來，發(fā)展了多種從基因組DNA或染色體DNA分離表達(dá)序列的方法。(1)探針篩選法。這是一種是基于常規(guī)的探針雜交直接篩選法。它主要有兩種方式，一種方式是用染色體微克隆文庫中的片段作為探針，在cDNA文庫中篩選同源性片段，即又稱為直接篩選法，另一種是利用cDNA片段作為探針對染色體微克隆文庫進(jìn)行篩選。該方法是以常規(guī)的點(diǎn)雜交為基礎(chǔ)的，準(zhǔn)確性應(yīng)當(dāng)很高，目前利用這種方法已從人及動(dòng)物染色體上分離了相應(yīng)的表達(dá)序列(Yokoi等，1994；Kao等，1994；Wei等，1996；Yu等，1997)。但是此法主要的缺點(diǎn)是涉及到大量的克隆操作及克隆雜交篩選等繁瑣步驟，費(fèi)工費(fèi)時(shí)。(2)借助顯微切割的cDNA捕獲法(Microdissection-mediated cDNA capture)。在這種方法中，首先用加接頭的cDNA為探針直接對染色體制片進(jìn)行原位雜交，然后通過充分洗滌將染色體制片上的未雜交cDNA洗掉，再通過顯微操作切割并分離目標(biāo)染色體或染色體上的目標(biāo)片段，分離到的目標(biāo)染色體片段作為模板，用cDNA接頭上的引物進(jìn)行嚴(yán)格條件的PCR擴(kuò)增，結(jié)果那些與該染色體上DNA雜交的同源性的cDNA就被擴(kuò)增(Yokoyama等，1997；Kim等，2001；Gracia等，1997)。該方法操作繁瑣，直接導(dǎo)致同源片斷分離的效率。同以上方法相比，本發(fā)明使用方法在液相操作，步驟簡單，后期檢測準(zhǔn)確快速，假陽性率低，表達(dá)序列分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述研究背景，本發(fā)明人深入研究，采用染色體微切割、微克隆技術(shù)，同時(shí)與同源片段特異擴(kuò)增技術(shù)(Hybrid specific amplification，HSA，Lecerf F等2001)相結(jié)合，并參考抑制消減雜交(suppressionsubtractive hybridization，SSH，Diatchenko L.等，1996)技術(shù)中的相關(guān)原理與程序，建立了一個(gè)快速分離目標(biāo)染色體表達(dá)序列的方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種分離目標(biāo)染色體的表達(dá)序列的方法，包含以下步驟(1)分離目標(biāo)染色體；(2)獲得帶有接頭的目標(biāo)染色體DNA；(3)獲得帶有另一種接頭的總細(xì)胞cDNA；(4)將上述目標(biāo)染色體DNA和總細(xì)胞cDNA進(jìn)行同源雜交；(5)進(jìn)行抑制PCR擴(kuò)增同源序列，獲得目標(biāo)染色體上的表達(dá)序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過微玻璃針分離的方法獲得目標(biāo)染色體。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)染色體DNA的獲得是利用PCR的方法(LA-PCR或DOP-PCR方法)獲得的，將獲得的目標(biāo)染色體DNA用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，并加連接接頭。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，帶有另一種接頭的cDNA的獲得是將提取的總細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并加上接頭。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)染色體上表達(dá)序列的獲得是利用單鏈cDNA或雙鏈cDNA。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)染色體上表達(dá)序列的獲得包括利用單鏈cDNA進(jìn)行目標(biāo)染色體表達(dá)序列分離，其包含(1)利用3’端特異引物反轉(zhuǎn)錄第一鏈，獲得長短不同的cDNA；(2)與目標(biāo)染色體DNA合并變性再復(fù)性，加入100倍Cot1DNA封阻，形成染色體DNA和cDNA的雜交鏈；(3)利用染色體DNA上的接頭序列和cDNA的3’端特異引物抑制PCR擴(kuò)增雜交鏈，獲得所述染色體的表達(dá)序列。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)染色體上表達(dá)序列的獲得包括利用雙鏈cDNA進(jìn)行染色體表達(dá)序列分離，其包含(1)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，限制性核酸內(nèi)切酶酶切，加連接接頭；(2)與目標(biāo)染色體或染色體片段的DNA合并變性再復(fù)性，加入100倍Cot1DNA封阻，形成染色體DNA和cDNA的雜交鏈；(3)利用染色體DNA上的接頭序列和cDNA的接頭序列抑制PCR擴(kuò)增雜交鏈，獲得染色體表達(dá)序列。
由于本發(fā)明的方法中應(yīng)用了DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)和抑制PCR原理，能降低染色體DNA和cDNA中高拷貝片段的數(shù)量，并可避免微切割染色體DNA擴(kuò)增過程中受外源DNA的污染，還能富集低表達(dá)量的DNA片段，為目標(biāo)染色體EST及新基因的分離奠定了重要基礎(chǔ)。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不應(yīng)理解為是對本發(fā)明進(jìn)行限定。
圖1是利用單鏈cDNA分離染色體表達(dá)序列的技術(shù)路線；
圖2是利用雙鏈cDNA分離染色體表達(dá)序列的技術(shù)路線；圖3是黑麥1R染色體的顯微分離過程(圖中黑色箭頭所示為帶有隨體的黑麥1R染色體所在位置，白色箭頭所指為分離并粘附在玻璃針上的1R染色體)；圖4是染色體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果(1.0％瓊脂糖凝膠)；圖5是1R染色體DNA同源的表達(dá)序列擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果(1.5％瓊脂糖凝膠)，1直接用PN1擴(kuò)增雜交終產(chǎn)物結(jié)果；2直接用PN2擴(kuò)增雜交終產(chǎn)物結(jié)果；3雜交終產(chǎn)物的二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果；4分子量標(biāo)記(從上至下依次為1000、750、500、250、100bp)；圖6是1R染色體DNA同源的表達(dá)序列克隆的PCR產(chǎn)物電泳；圖7雜交特異擴(kuò)增終產(chǎn)物克隆的點(diǎn)雜交分析a.以黑麥苗期總cDNA為探針的點(diǎn)雜交結(jié)果b.以顯微切割的1R染色體DNA擴(kuò)增產(chǎn)物探針的點(diǎn)雜交結(jié)果c.以黑麥基因組總DNA為探針的點(diǎn)雜交結(jié)果，其中8A為1R DNA，8B為cDNA，8C是黑麥基因組DNA，8D是中國春小麥基因組DNA，8E是與分離得到的終產(chǎn)物，即1R染色體DNA和cDNA中同源序列片段，1H是空白質(zhì)粒DNA，其它為用引物PN1和PN2擴(kuò)增得到的克隆子插入片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式如下所示。
顯微分離目標(biāo)染色體，LA-PCR(linker adaptor PCR)或DOP-PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR)方法(Johnson等1990；Wesley等，1989；Telenius等，1992)獲得染色體DNA，其中優(yōu)選顯微分離是借助倒置顯微鏡使用微玻璃針分離目的染色體。將分離的染色體直接放入含有蛋白酶K反應(yīng)緩沖液，濃度為50ng/μl，用1×T4DNA連接酶緩沖液配制。在37℃水浴中溫育以便蛋白酶K充分消化去蛋白，時(shí)間為4小時(shí)，然后70℃溫育20min使酶失活。如果采用DOP-PCR的方法，即可放入-20℃?zhèn)溆?。如果采用LA-PCR方法，則在原體系中加入限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A-I進(jìn)行酶切，用量為0.02U，反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)，70℃ 20min使酶失活。加入制備好的濃度為5ng/μl的接頭2μl，其中使用的接頭為Sau3A接頭，用1×T4連接酶緩沖液和20mmol/L ATP配制成5ng/μl的工作濃度。Sau3A接頭是由23mer和19mer的兩個(gè)寡核苷酸片段形成，制備接頭時(shí)，先將23mer寡核苷酸磷酸化，與等摩爾19mer寡核苷酸共變性退火制成。加入T4DNA連接酶0.5μl(3U/μl)，連接反應(yīng)最終體積為24.5μl。16℃連接過夜后，70℃ 20min失活連接酶。針對分離染色體的來源，要對蛋白酶K消化蛋白時(shí)間進(jìn)行摸索，以普通小麥為材料，消化4小時(shí)為宜。
將上述處理的染色體進(jìn)行兩輪LA-PCR擴(kuò)增或DOP-PCR擴(kuò)增獲得染色體DNA。LA-PCR第一輪底物為帶有接頭的染色體DNA，以對應(yīng)Sau3A接頭的19mer為引物進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。第二輪擴(kuò)增是取5μl第一輪產(chǎn)物為底物，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。DOP-PCR第一輪底物為經(jīng)蛋白酶K處理的染色體，以簡并引物進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。第二輪擴(kuò)增取5μl第一輪產(chǎn)物為底物，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。其中，為了有效避免外源DNA的污染，上述各步驟盡量保證在無菌條件下進(jìn)行。載玻片及蓋玻片事先在洗液或鹽酸∶乙醇＝1∶9中浸泡一天以上，雙蒸水沖洗干凈后再置于95％乙醇中，擦干，120℃烘烤2小時(shí)待用。吸管、濾紙、刀片均經(jīng)高壓滅菌，卡寶品紅染液經(jīng)抽濾滅菌后，紫外燈下照射1小時(shí)以上，在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行壓片。PCR擴(kuò)增使用的Eppendorf管、Tip頭等均經(jīng)過高壓滅菌，再紫外線照射處理30min以上。無菌水、酶解混合液、人工接頭、蛋白酶K等酶液等溶液均經(jīng)抽濾或紫外線滅菌處理。
上述過程設(shè)兩種嚴(yán)格對照陽性對照加入約10pg基因組DNA為初始底物，陰性對照中不加任何底物，其它所有操作過程同上。這是監(jiān)控試驗(yàn)效果和污染情況不可或缺的一步。
雜交前處理染色體DNA。合并適量第二輪PCR產(chǎn)物于離心管中，加等體積酚/氯仿，11000g離心1分鐘，取上清后再用等體積酚/氯仿抽提，抽提后上清用氯仿同樣方式抽提一次，取上清加1/10體積3MNaAc(pH5.8)，兩倍乙醇于-20℃沉淀2小時(shí)，16000g離心10分鐘，70％乙醇洗一次，室溫干燥后溶于10μl去離子無菌水中。在50μl體系中，用10U Sau3A酶切染色體DNA(1μg)37℃酶切過夜，70℃滅活20min，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于適量去離子無菌水中(300ng/μl)，加入1μl接頭(接頭一)，接頭濃度10μM，接頭采用Clontech公司的消減抑制雜交試劑盒中接頭，在10μl體系中，加入0.5U T4DNA連接酶(New England Biolabs)，16℃連接16小時(shí)，72℃滅活10min，-20℃貯存?zhèn)溆谩＠肔A-PCR方法獲得染色體DNA時(shí)，使用23mer和19mer序列制成的接頭，用19mer為引物，該引物退火溫度較低，能提高擴(kuò)增效率。但在后面的抑制PCR中，為了達(dá)到抑制效果和提高擴(kuò)增特異性，所以對染色體DNA進(jìn)行二次酶切，更換接頭為接頭一。
cDNA準(zhǔn)備。提取一定時(shí)期陽性植株或經(jīng)過特殊處理后陽性植株RNA，若利用單鏈cDNA分離染色體表達(dá)序列，第一鏈合成使用5’連接M4-13序列的Oligo-dT為引物，第一鏈合成后純化，稀釋約300ng/μl備用。若利用雙鏈cDNA分離染色體表達(dá)序列，則繼續(xù)合成第二鏈cDNA并進(jìn)行末端補(bǔ)平。將純化的雙鏈cDNA溶于適量去離子水中，在50μl體系內(nèi)，用10-15U限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A消化過夜，70℃20分鐘滅活限制性內(nèi)切酶，然后經(jīng)過酚/氯仿純化，乙醇沉淀，溶于適量去離子水中(300ng/μl)，加入1μl接頭(接頭二)，接頭濃度10μM，接頭采用Clontech公司的消減抑制雜交試劑盒中接頭，在10μl體系中，加入0.5U T4DNA連接酶(New England Biolabs)，16℃連接16h，72℃滅活10min，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 分離目標(biāo)染色體上的表達(dá)序列。
同源雜交。將合成的單鏈或雙鏈cDNA約300ng、連好接頭一的附加染色體擴(kuò)增產(chǎn)物約500ng及100倍的Cot1共同乙醇沉淀，溶于4μl雜交緩沖液(50mM Hepes，pH8.3；0.5M NaCl；0.02mM EDTA，pH8.0；10％(wt/vol)PEG 8000)，上覆石蠟油，98℃變性1.5min，68℃雜交10小時(shí)。10小時(shí)后加入新鮮單鏈cDNA或雙鏈cDNA約300ng(溶解在1×雜交緩沖液中)，繼續(xù)在同樣條件下雜交10小時(shí)。雜交結(jié)束后用稀釋緩沖液(20mM Hepes，pH8.3；50mM NaCl；0.2mM EDTA)稀釋至100μl，72℃加熱穩(wěn)定7分鐘，-20℃貯藏。
抑制PCR。在PE480(Perkin Elmer，Norwalk，Conn.，USA)上進(jìn)行，兩輪反應(yīng)為25μl體系，程序同Clontech消減雜交PCR程序(PCR-Select cDNA Subtractive Kit)，其中，若利用單鏈cDNA分離染色體表達(dá)序列，第一輪引物用P1和M4-13，第二輪用PN1和M4-13擴(kuò)增。若利用雙鏈cDNA分離染色體表達(dá)序列，第一輪引物用P1和P2，第二輪用PN1和PN2擴(kuò)增。兩輪程序均加單引物擴(kuò)增做對照。
表達(dá)序列篩選。取純化的染色體第二輪PCR產(chǎn)物1μl(約100ng/μl)、1μl T4DNA連接酶緩沖液、1μlPGEM-T載體(promega)(60ng/μl)、T4DNA連接酶(New England Biolabs)1μl(3U/μl)、無菌水補(bǔ)至終體積10μl，混勻，4℃連接16小時(shí)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑獲得的白色菌落，常規(guī)方法提取質(zhì)粒，用引物PN1和M4-13或PN1和PN2進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，插入片段確為這兩個(gè)引物擴(kuò)增得到的片段。PCR擴(kuò)增釋放的克隆片段，各取1μl PCR產(chǎn)物點(diǎn)在Hybond+尼龍膜(Amersham公司)上，平行點(diǎn)三張膜，分別用分離染色體DNA，陽性植株的cDNA及酶切的基因組DNA為探針與膜雜交。點(diǎn)膜后，將DNA面朝上依次放在以下溶液中飽和的濾紙上堿變性液(1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH)變性5分鐘；中和液(3mol/LNaCl，0.5mol/L Tris HCl，pH7.4)8分鐘；2×SSC 5分鐘。室溫下稍干，DNA面朝下在紫外透射儀(BIO-RAD，USA)上照射1分鐘，進(jìn)行雜交，探針的標(biāo)記和Southern雜交過程參照B.M.公司的“The Guide Bookto DIG System User”。選取陽性的克隆測序。
注引物和接頭說明1.染色體DNA獲得使用的接頭，由23mer和19mer引物制成，在LA-PCR擴(kuò)增時(shí)使用19mer做為引物。在DOP-PCR時(shí)使用6MW為引物。
序列如下23mer引物5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′19mer引物5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′23mer和19mer合成接頭如下5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′3′-GACTCGAGCTTAAGCTGGG-5′6MW引物5′-CCGACTGATCNNNNNNATGTGG-3′(N＝A，T，C，G)2.雜交時(shí)染色體使用引物和接頭接頭一，
5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′3′-CCCGTCCACTAG-5′P1，5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′PN1，5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′3.雜交時(shí)cDNA使用接頭接頭二，5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′3′-CCTCCCGCCACTAG-5′P2，5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′PN2，5′-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′4.單鏈cDNA 5′連接M4-13序列M13-4，5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′實(shí)施例黑麥1R染色體表達(dá)序列的分離一材料和方法1.材料及染色體標(biāo)本制備材料為黑麥(S.cereale L)(中科院遺傳與發(fā)育研究所提供)。黑麥具大型染色體，約為8～14μm，主要由具中部和近中部著絲點(diǎn)染色體組成，2n＝14，其中只有一對1R染色體具有隨體。
染色體標(biāo)本制備1)將黑麥種子在溫室(25℃)中萌發(fā)，當(dāng)根長至0.5～1cm時(shí)即可用于預(yù)處理。在0～4℃的冰水中處理萌發(fā)的種子24小時(shí)，即可獲得足夠的中期分裂相。2)將預(yù)處理過的萌發(fā)種子置于95％乙醇∶冰醋酸(3∶1)的卡諾固定液中固定10分鐘，再轉(zhuǎn)至70％乙醇中，4℃保存待用。3)將種子在滅菌的蒸餾水中洗凈，切取根尖。將根尖置于2％纖維素酶(Onozuka，R-10，Serva)與2％果膠酶(Y-23，Serva)的混合液中，37℃酶解1小時(shí)；之后用無菌蒸餾水洗三次，卡寶品紅染色壓片，鏡檢。液氮凍片法去蓋片，直接或氣干后用于顯微切割操作。
2.引物及接頭1)用于染色體DNA擴(kuò)增的LA-PCR使用引物和接頭參照Albani等人(1993)設(shè)計(jì)的2條引物23mer引物5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′；19mer引物5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′，引物1磷酸化后，加入引物2，90℃變性2min，55℃退火20min，冷卻至室溫成接頭。
2)用于染色體DNA擴(kuò)增的簡并引物該引物是在簡并引物6MW(Telenius等，1992)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的。序列為，DOP-引物5′-CCGACTGATCNNNNNNATGTGG-3′3)用于雜交樣品的接頭接頭一，5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′3′-CCCGTCCACTAG-5′接頭二，5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′3′-CCTCCCGCCACTAG-5′上述接頭及引物是均是應(yīng)用于SSH中的接頭和引物(Diatchenko等，1996)，但接頭由原來的平端改為Sau3A的GATC粘端。
4)擴(kuò)增PCR引物P1，5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′P2，5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′PN1，5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′PN2，5′-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′M13-4，5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′5)接頭制備將用于合成接頭的寡核苷酸片段用TE溶液溶解，等摩爾混合后加熱到70℃，在2小時(shí)內(nèi)冷卻到10℃。-20℃保存。
3黑麥1R染色體的顯微分離及其DNA的PCR擴(kuò)增1)染色體顯微分離取直徑1mm左右的細(xì)玻璃棒，在微型酒精燈上拉制成直徑為1～3μm針尖的玻璃針，同時(shí)針尖具120℃左右的彎度。將選好的制片置于液氮中速凍數(shù)秒，取出后用刀片迅速揭掉蓋片，氣干待用。制好的玻璃針固定在Leitz顯微操作器(Germany)上，同時(shí)置氣干的制片于倒置顯微鏡下，鏡下選取所需分裂相。低倍鏡下緩慢下針，逐級換上高倍鏡，調(diào)節(jié)針尖的位置，最后針尖對準(zhǔn)所要分離的染色體進(jìn)行來回?fù)茈x，使其從分裂相中脫落，并粘附在玻璃針尖上。慢慢通過顯微操作器提升玻璃針，之后將粘附有染色體的針尖折斷于含有10μl反應(yīng)緩沖液的20μl的PCR管中，高速離心數(shù)秒鐘，-20℃存放待用。
反應(yīng)緩沖液用1×Taq緩沖液(Promage)配制，含50ng/μl蛋白酶K(BM)。
2)微分離染色體的體外擴(kuò)增(1)酶解去蛋白裝有染色體的PCR管放于37℃酶解4h后70℃處理品20min失活蛋白酶K。
(2)酶切加接頭加入限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A-I進(jìn)行酶切，用量為0.02U，反應(yīng)時(shí)間3小時(shí)，70℃ 20min使酶失活連接，加入Sau3A接頭2μl(5ng/μl)，T4DNA連接酶0.5μl(3U/μl)，連接反應(yīng)最終體積為24.5μl。16℃連接過夜后，70℃20min失活連接酶。
(3)PCR擴(kuò)增按下列體系加入反應(yīng)成分10×Taq酶緩沖液5.0μl，2.5mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs 4.0μl，引物(對于LA-PCR引物為19mer引物，對于DOP-PCR引物為簡并引物6MW)0.7μl(330ng/μl)，Taq酶0.5μl(5U/μl)，最后用紫外處理過的無菌水補(bǔ)至終體積50μl混勻。
PCR在Biometra PCR儀(Germany)上進(jìn)行，DOP-PCR程序如下第一輪PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，接著進(jìn)入94℃ 1min，30℃ 1.5min，72℃ 3min，其中30℃變化至72℃需3min。5個(gè)這樣的循環(huán)后接著進(jìn)入25個(gè)循環(huán)94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，并且每圈自動(dòng)延伸1s；最后72℃延伸10min，4℃保溫。LA-PCR程序如下94℃預(yù)變性5min，接著進(jìn)入94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 3min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保溫。
第二輪PCR擴(kuò)增是取1/10(5μl)的第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，反應(yīng)體系同上，PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；接著25個(gè)循環(huán)94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 3min；最后72℃延伸10min，4℃保溫。
如電泳檢測第二輪擴(kuò)增信號(hào)仍很弱，可進(jìn)行第三輪擴(kuò)增。即取1/10的第二輪PCR產(chǎn)物作為模板，其他條件同第二輪擴(kuò)增。
(3)染色體DNA擴(kuò)增純化合并PCR產(chǎn)物于離心管中，加等體積酚/氯仿，11000g離心1分鐘，取上清后再用等體積酚/氯仿抽提，抽提后上清用氯仿同樣方式抽提一次，取上清加1/10體積3M NaAc(pH5.8)，兩倍乙醇于-20℃沉淀2小時(shí)，16000g離心10分鐘，70％乙醇洗一次，室溫干燥后加10μl去離子無菌水溶解，保存于-20℃。
4.黑麥苗期RNA分離和cDNA合成1)TRIzol法提取總RNA(TRIzol Kit，GIBCOL)，按產(chǎn)品說明進(jìn)行50-100mg樣品+1mL TRIzol研磨成勻漿；15-30℃溫浴5min，加0.2mL氯仿，封好蓋，用手激烈搖動(dòng)15s，15-30℃溫溫浴2-3min，低溫離心15min(＜12,000xg)；上相移入新管，加0.5mL異丙醇沉淀RNA，15-30℃溫浴10min，離心10min(＜12,000xg)；去上相，加75％乙醇(＞1mL)渦懸洗沉淀，低溫離心5min(＜7,500xg)氣干或真空抽干(忌真空離心，不要干透)，槍頭上下吹打溶于180μl不含Rnase的水。
2)cDNA合成(1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成單鏈cDNA(Takara RNA PCR kit(AMV)ver 2.1)A按下列反應(yīng)組成調(diào)制反應(yīng)液MgCl224μl10×RNA PCR緩沖液 2μl
不含Rnase的ddH2O8.5μldNTP混合物 2μlRnase抑制劑 0.5μlAMV逆轉(zhuǎn)錄酶 1μlOligo dT-接頭引物1μl樣品(1μg總RNA) 1μl20μl/樣總共品B按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 15min～30min99℃ 5min5℃5min經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于去離子無菌水中(~300ng/μl)，-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> (2)雙鏈cDNA合成利用雙鏈分離表達(dá)序列，必須對總RNA純化，mRNA分離采用Stratagene公司的mRNA分離試劑盒分離純化，程序如下(i)65℃加熱RNA樣品5min，置冰上，加入20μl 10×樣品緩沖液使樣品緩沖液終濃度達(dá)到1×。預(yù)熱洗脫液到65℃；(ii)取下純化柱兩端蓋，拉出10ml注射器內(nèi)柄，將注射器與純化柱連接，以每兩秒一滴的速度將貯存的緩沖液推出；(iii)取下注射器，向純化柱內(nèi)加入200μl高鹽緩沖液，以每兩秒一滴的速度推出高鹽緩沖液直到排凈。重復(fù)(iii)；(iv)將RNA樣品加入純化柱，以每兩秒一滴的速度推出到一個(gè)DEPC處理過的1.5ml離心管中。將過柱回收的樣品重新按(iv)步驟過柱；(v)向純化柱內(nèi)加入200μl高鹽緩沖液，以每秒一滴的速度推出高鹽緩沖液，重復(fù)(v)；(vi)用低鹽緩沖液以每秒一滴的速度洗三遍，每次200μl；(vii)用200μl已經(jīng)預(yù)熱到65℃的洗脫液以每秒一滴的速度洗脫RNA，用DEPC處理過的1.5ml離心管回收，置冰上；
(viii)紫外分光光度計(jì)測260和280nm的讀數(shù)，260/280值為2時(shí)，樣品很純；(ix)向樣品中加入500μl預(yù)冷的乙醇，-20℃過夜；(x)用冷凍離心機(jī)以12000rpm，4℃離心30min，70％乙醇洗沉淀，沉淀干燥后，溶于20μlDEPC處理過的水中。
取mRNA 2μg，用OligoD(T)Primer進(jìn)行cDNA合成(ZAP-cDNASynthesis kit，Stratagene)。
A.cDNA第一鏈合成(i)預(yù)熱37℃水??；(ii)冰上融化所有非酶的第一鏈試劑，簡短渦懸、離心使藥品匯于管底；(iii)冰上建立如下體系(按順序)5.0μl 10×Buffer、3.0μldNTP Mix、2.0μl Link-Primer(1.4μg/μl)、17.5μl DEPC-H2O、1.0μl Rnase Block Ribonuclease Inhibitor(40U/μl)；(iv)混勻，稍離心5s，加上經(jīng)70℃水浴保溫15min后立即置冰上變性5min的mRNA，輕輕混勻，室溫下退火10min；(v)加入1.5μl MMLV-RT(50U/μl)終體積為50μl；(vi)輕輕混勻，稍離心匯于管底；(vii)37℃溫浴1-1.5h；(viii)準(zhǔn)備16℃水??；(ix)1h后，從37℃水浴中取出第一鏈反應(yīng)置冰上。
B.cDNA第二鏈合成(i)冰上融化所有非酶的第二鏈試劑，簡短渦懸、離心使藥品匯于管底；(ii)在第一鏈反應(yīng)體系中順序加入20μl 10×Buffer、6.0μl dNTPMix、114μl DEPC-H2O、2.0μl Rnase H(1.5U/μl)和11μl DNA polymeraseI(9.0U/μl)；(iii)輕輕混勻，稍離心匯于管底，16℃溫浴2.5h，注意溫度一定不要大于16℃，否則易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；(iv)第二鏈反應(yīng)2.5h后，立即置冰上。
C.cDNA末端補(bǔ)平(i)冰上加下列試劑23μl dNTP Mix，2μl Pfu DNA polymerase(2.5U/μl)；(ii)快速渦懸簡短離心后，72℃溫浴30min，不要超過30min；(iii)反應(yīng)結(jié)束后，加200μl酚/氯仿[1∶1(v∶v)]抽提一次，室溫高速離心2min，上清轉(zhuǎn)入另一新離心管；(iv)用等體積氯仿抽體一次，轉(zhuǎn)上清于另一新管；(v)加20μl 3M NaAc，400μl 100％乙醇，混勻，-20℃過夜；(vi)4℃，12000rpm離心1h，收集cDNA沉淀，70％乙醇輕輕洗，不要混合和渦懸；(vii)全速離心2min，吸出乙醇，吹干沉淀；(viii)沉淀重懸于10μl無菌去離子水中，-20℃?zhèn)溆谩?br> 5.利用液相雜交和PCR方法獲得黑麥1R染色體上cDNA片段1)雜交樣品制備取染色體DNA和雙鏈cDNA各1μg，分別于50μL體系用10U的Sau3A酶(Promage)于37℃酶切過夜。70℃ 20分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。取酶切產(chǎn)物(約300ng)、1μl接頭，接頭濃度10μM，接頭采用Clontech公司的消減抑制雜交試劑盒(Cat.No.637401)中接頭，在10μl體系中，加入0.5U T4DNA連接酶(New England Biolabs)，16℃連接16h，72℃滅活10min，-20℃貯存?zhèn)溆?。其中染色體DNA用接頭一連接，cDNA片段用接頭二連接。連接完畢后，染色體DNA中加入100倍Cot1DNA經(jīng)氯仿/酚抽提后共同乙醇沉淀。利用單鏈cDNA分離表達(dá)序列時(shí)，為了獲得3′端信息，不進(jìn)行酶切，只對染色體DNA進(jìn)行酶切，其余處理同雙鏈。
2)雜交將合成的單鏈或加了街頭的雙鏈cDNA約300ng、連好接頭的附加染色體擴(kuò)增產(chǎn)物約500ng及100倍的Cot1共同乙醇沉淀，溶于4μl雜交緩沖液(50mM Hepes，pH8.3；0.5M NaCl；0.02mM EDTA，pH8.0；10％(wt/vol)PEG8000)，上覆石蠟油，98℃變性1.5min，68℃雜交10h。10h后加入新鮮單鏈cDNA或雙鏈cDNA約300ng(溶解在1×雜交緩沖液中)，繼續(xù)在同樣條件下雜交10h。雜交結(jié)束后用稀釋緩沖液(20mMHepes，pH8.3；50mM NaCl；0.2mM EDTA)稀釋至100μl，72℃加熱穩(wěn)定7分鐘，-20℃貯藏。
3)雜交樣品的PCR擴(kuò)增在PE480上進(jìn)行，兩輪反應(yīng)為25μl體系，程序同Clontech消減雜交PCR程序，其中，若利用單鏈cDNA分離染色體表達(dá)序列，第一輪引物用P1和M4-13，第二輪用PN1和M4-13擴(kuò)增。若利用雙鏈cDNA分離染色體表達(dá)序列，第一輪引物用P1和P2，第二輪用PN1和PN2擴(kuò)增。兩輪程序均加單引物擴(kuò)增做對照，看抑制效果。模板為1μL已稀釋雜交DNA樣品，外側(cè)引物各1μL(5μM)22μL PCR master mixture prepared usingPremixEX(Takara).PCR程序?yàn)?2℃末端補(bǔ)平10min，30PCR循環(huán)(94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 1.5分鐘)。72℃延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用TE緩沖液稀釋10倍，取1μL稀釋的PCR產(chǎn)物作為模板，按第一輪的PCR條件進(jìn)行15-25個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，引物則改用接頭內(nèi)側(cè)的引物。
6.擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆擴(kuò)增產(chǎn)物利用T-vector(T-，Promage)克隆，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，用引物PN1和M4-13或PN1和PN2進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，插入片段確為這兩個(gè)引物擴(kuò)增得到的片段。
1)與載體的連接反應(yīng)本實(shí)驗(yàn)采用的載體是從Promega公司購買的pGEM-T載體。由于這種載體的插入位點(diǎn)3’端勻具突出的T(胸苷)，可大大提高其與PCR產(chǎn)物的連接效果(有些Taq聚合酶常在擴(kuò)增片段的3’端加上一個(gè)與模板無關(guān)的A(腺苷))。同時(shí)PGEM-T載體也具多克隆位點(diǎn)，方便了插入片段的釋放。在進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，取純化的染色體PCR產(chǎn)物1μl(約100ng/μl)、1μlT4DNA連接酶緩沖液、1μl PGEM-T載體(60ng/μl)、T4DNA連接酶1μl(3U/μl)、無菌水補(bǔ)至終體積10μl，混勻，4℃連接16h。
2)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備活化E.coli菌株DH5α(中科院遺傳與發(fā)育研究所提供)。從平板上挑取單菌落于10ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床上培養(yǎng)過夜。次日，取1ml菌液加入到100ml新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃快速搖動(dòng)培養(yǎng)2～3h。D當(dāng)OD值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，冰浴菌液30min。6000rpm離心5min收集菌體。棄上清，加入10ml預(yù)冷的無菌CaCl2(0.1mol/L)溶液懸浮細(xì)胞。冰浴15min。6000rpm離心5min。棄上清，將菌體細(xì)胞重新懸浮于2ml的CaCl2(0.1mol/L)溶液中。分裝到預(yù)冷的Eppendorf管中，200μl/管。
3)連接反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取連接產(chǎn)物1μl于200μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻后，冰浴30min。42℃水浴熱擊90s，立即置冰浴中1～2min。加入800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃保溫1小時(shí)(可置于37℃水浴中或37℃ 150rpm的搖床上)。同時(shí)在Amp(100g/L)的LB固體平板上均勻涂布40μl X-gal(20μg/μl)和4μl IPTG(200μg/μl)溶液。溫育之后，從1mL菌液中，取100μl涂布于平板上。37℃培養(yǎng)過夜。重組克隆子的鑒定。
經(jīng)培養(yǎng)，在含IPTG和X-gal(32g/L)的Amp(100g/L)LB平板上，出現(xiàn)了白色菌落和藍(lán)色菌落，白色菌落為重組子。
7.擴(kuò)增產(chǎn)物及其克隆片段的PCR擴(kuò)增鑒定對擴(kuò)增產(chǎn)物及克隆片段利用其接頭上的內(nèi)側(cè)單個(gè)引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)應(yīng)用兩個(gè)引物擴(kuò)增才能得到片段，而單用一個(gè)引物不能擴(kuò)增，則能證明擴(kuò)增片段及克隆是來源由兩DNA樣品中同源雜交的產(chǎn)物。
8.點(diǎn)雜交法對擴(kuò)增產(chǎn)物及克隆片段分別用地高辛標(biāo)記的顯微分離染色體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物和總cDNA作探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測，以進(jìn)一步確定擴(kuò)增產(chǎn)物及克隆片段是否來自顯微分離染色體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
1)點(diǎn)膜隨機(jī)挑選的克隆子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA逐一點(diǎn)在劃有方格的Hybond+尼龍膜(Amersham)上。用鑷子將膜轉(zhuǎn)入一培養(yǎng)皿中、其底部具有浸潤過變性液(0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl)的濾紙上，放置5min。再將膜轉(zhuǎn)移至浸濕了中和液(1.5mol/L NaCl，0.5mol/L Tris.Cl，pH7.4)的濾紙上，放置8min。將膜轉(zhuǎn)移至浸濕了2×SSC的濾紙上，放置5min。取出后放在干的濾紙上室溫下稍干，DNA面朝下在紫外透射儀上照射1分鐘，備用；2)探針標(biāo)記按產(chǎn)品說明進(jìn)行(DIG DNA Labeling and DetectionKit，Boehringer Mannheim)
取1μg左右的待標(biāo)記DNA(染色體DNA、cDNA、EcoR I酶切黑麥基因組DNA)，加無菌雙蒸水至15μl，沸水中煮10min，并迅速置冰上冷卻。在上述相同的Eppendorf管中加入六核苷酸混合液2μl，10×dNTPs(1mmol/L dATP，1mmol/L dCTP，1mmol/L dGTP，0.65mmol/L dTTP，0.35mmol/L DIG dUTP，pH7.5)2μl，Klenow酶1μl(2U/μl)，混勻后，37℃反應(yīng)過夜。加入2μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)終止反應(yīng)。加入2.5μl 4mol/LLiCl和75μl預(yù)冷的無水乙醇混勻，-20℃放置2h以上。12000rpm離心15min，70％冷乙醇沖洗。風(fēng)干DNA沉淀，并溶于50μl TE中(pH8.0)；3)預(yù)雜交在雜交盒中，放入雜交尼龍膜，并加入適量的DIG雜交液(5×SSC，0.1％ N-lauroylsarcosine，0.02％SDS，10％封阻劑)，65℃保溫至少1h；4)雜交在100μl的雜交液中加入適量探針混勻，沸水中變性5min，并迅速置于冰上。倒去預(yù)雜交液，加入適量的雜交液和已變性的探針，搖勻(加入雜交液的量要根據(jù)膜的大小而定)。用膠布封好雜交盒，65℃雜交過夜；5)洗膜倒去雜交液，室溫下2×SSC、0.1％SDS溶液中洗2次，每次5min。65℃、0.1×SSC、0.1％SDS溶液中洗兩次，每次15min；6)檢測洗后的雜交膜在馬來酸緩沖液中(0.1mol/L馬來酸、0.15mol/L NaCl，pH7.5)浸洗1～5min。加入適量(1ml/cm2)1×封阻液(1％封阻劑溶于馬來酸緩沖液中)，反應(yīng)30min。用1×封阻液稀釋地高辛堿性磷酸酶偶聯(lián)抗體(1∶10000)至75mU/ml。將膜置于適量抗體溶液中室溫反應(yīng)30min。用馬來酸緩沖液洗膜2次，每次15min。將膜轉(zhuǎn)移至檢測緩沖液中(0.1mol/L Tris.Cl，0.1mol/L NaCl，50mmol/L MgCl2，pH9.5)平衡2～5min。加入適量(0.1ml/cm2)的顯色液(NBT和X-phosphate)，同時(shí)顯色過程避光且切勿振蕩。顯色適當(dāng)后加入雙蒸水或TE緩沖液終止顯色反應(yīng)。拍照、記錄結(jié)果。
二結(jié)果
1.技術(shù)體系的確定本發(fā)明基本路線如圖1和圖2所示圖2為顯微切割分離的染色體DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和雙鏈cDNA用Sau3A酶切，分別加上不同的接頭即接頭1和接頭2，分別變性后再合并復(fù)性，結(jié)果在最后的雜交體系中少量的單鏈外，將會(huì)產(chǎn)二類雜交鏈，一是由同一樣品來源的DNA鏈復(fù)性產(chǎn)生的，另一種是不同樣品來源的同源片段復(fù)性得到的雜交鏈。
接下來將復(fù)性的片段用Taq酶補(bǔ)平接頭，用接頭外側(cè)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，則未復(fù)性的單鏈不能被擴(kuò)增，而同一來源的DNA復(fù)性產(chǎn)生的雙鏈兩側(cè)為同一種接頭，造成片段兩側(cè)有較長的互補(bǔ)序列，在PCR擴(kuò)增過程中易于形成所謂的鍋柄結(jié)構(gòu)(panhandle)并抑制了正常的擴(kuò)增反應(yīng)，只有不同來源的DNA復(fù)性產(chǎn)生的雙鏈兩側(cè)是不同的接頭，補(bǔ)平后不會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)序列并可正常擴(kuò)增，因此通過這一方法就可以選擇地?cái)U(kuò)增出兩DNA樣品的同源序列。
由于本實(shí)施例中將顯微切割染色體DNA和總cDNA作為樣品，所以通過這種HSA可以擴(kuò)增得到顯微切割染色體DNA和總cDNA間的同源序列，這就是我們所要分離的染色體上的表達(dá)序列(圖2)。
利用單鏈cDNA與切割染色體DNA雜交獲得目標(biāo)染色體上表達(dá)序列技術(shù)路線與利用雙鏈cDNA與切割染色體DNA雜交獲得目標(biāo)染色體上表達(dá)序列技術(shù)路線類似(圖1)，只是單鏈cDNA不經(jīng)過酶切。
2.黑麥1R染色體的顯微分離及其DNA的PCR擴(kuò)增按照前述方法，在顯微鏡下用微細(xì)玻璃針可分離獲得黑麥1R染色體，見圖3。利用PCR方法可獲得黑麥1R染色體DNA，見圖4。
3.1R染色體上表達(dá)序列片段的擴(kuò)增及克隆按材料和方法中的程序得到了染色體DNA和cDNA中同源的雜交片段擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物大小在100-500bp之間(圖5)。擴(kuò)增片段用T-vector載體克隆，克隆子的鑒定直接利用PN1，PN2或PN1和M4-13進(jìn)行PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)插入片段在100-500bp之間(圖6)。
4.擴(kuò)增產(chǎn)物及克隆片段來源鑒定對產(chǎn)物及克隆的進(jìn)一步分析是以地高辛標(biāo)記的顯微分離1R染色體DNA和總cDNA作為探針對擴(kuò)增產(chǎn)物及克隆片段進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，檢測結(jié)果顯示除作為對照的空載質(zhì)粒DNA沒有雜交信號(hào)外，其它克隆子擴(kuò)增片段均有雜交信號(hào)，顯示克隆片段與1R染色體DNA和cDNA同源，進(jìn)一步證實(shí)了克隆的正確性(圖7，a，b)。
為分析克隆的片段在基因組中的拷貝數(shù)，用地高辛標(biāo)記的黑麥基因組DNA作為探針對克隆片段進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，結(jié)果表明59個(gè)克隆中，只有一個(gè)克隆(6E)有較強(qiáng)的雜交信號(hào)，這表明它應(yīng)是多拷貝序列(＜2％)，其它58個(gè)克隆均無雜交信號(hào)，為單低拷貝片段的克隆(＞98％)。這與單染色體DNA文庫中單低拷貝克隆比例(約50％)相比高得多(圖7，c)。
隨機(jī)挑選一個(gè)克隆測序，測序結(jié)果表明，此表達(dá)序列為硫氧化還原蛋白基因(Secale cereale thioredoxin-like protein(Trx)mRNA)，該基因位于黑麥的1R染色體上，序列如下。
1TTTTTTTTTT TTCACAAAAC TAGCATTTTA CCAGCAGGGT CATCTTACAG TTTCACAGCA61 ATGCATATG GGCGTCGCAA AATTGTAAAA CATTGTCTAG ACGGAGAAGA CACGGAAACT121 GTACACCAGG AAACTATCAT GCAACACACA AAACACACAA GCATGGCAGC CAGATATAT181 AAGCCATGAC AAGCTGGCTC TGTTCTAATT CTGTAGCATG GTTCAACTGC CATCACCAAG241 AGCTTGTACT TTCTTCTCGA GCTCAGGTTT GTTGGCGCCG ACGAGCTTGT CGATC應(yīng)當(dāng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，但改動(dòng)或修改的等價(jià)形式同樣落在本申請權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種分離目標(biāo)染色體的表達(dá)序列的方法，包含以下步驟(1)分離目標(biāo)染色體；(2)獲得帶有接頭的目標(biāo)染色體DNA；(3)獲得帶有另一種接頭的總細(xì)胞cDNA；(4)將上述目標(biāo)染色體DNA和總細(xì)胞cDNA進(jìn)行同源雜交；(5)進(jìn)行抑制PCR擴(kuò)增同源序列，獲得目標(biāo)染色體上的表達(dá)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過微玻璃針分離的方法獲得目標(biāo)染色體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中目標(biāo)染色體DNA的獲得是利用PCR的方法(LA-PCR或DOP-PCR方法)獲得的，將獲得的目標(biāo)染色體DNA用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，并加連接接頭。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的方法，其中帶有另一種接頭的cDNA的獲得是將提取的總細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并加上接頭。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的方法，其中目標(biāo)染色體上表達(dá)序列的獲得是利用單鏈cDNA或雙鏈cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中目標(biāo)染色體上表達(dá)序列的獲得包括利用單鏈cDNA進(jìn)行目標(biāo)染色體表達(dá)序列分離，其包含(1)利用3’端特異引物反轉(zhuǎn)錄第一鏈，獲得長短不同的cDNA；(2)與目標(biāo)染色體DNA合并變性再復(fù)性，加入100倍Cot1DNA封阻，形成染色體DNA和cDNA的雜交鏈；(3)利用染色體DNA上的接頭序列和cDNA的3’端特異引物抑制PCR擴(kuò)增雜交鏈，獲得所述染色體的表達(dá)序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中目標(biāo)染色體上表達(dá)序列的獲得包括利用雙鏈cDNA進(jìn)行染色體表達(dá)序列分離，其包含(1)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，限制性核酸內(nèi)切酶酶切，加連接接頭；(2)與目標(biāo)染色體或染色體片段的DNA合并變性再復(fù)性，加入100倍Cot1DNA封阻，形成染色體DNA和cDNA的雜交鏈；(3)利用染色體DNA上的接頭序列和cDNA的接頭序列抑制PCR擴(kuò)增雜交鏈，獲得染色體表達(dá)序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，其中使用的封阻Cot1DNA是染色體DNA濃度的100倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任何一項(xiàng)的方法，其中合并變性溫度為98℃，反應(yīng)時(shí)間為1.5分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任何一項(xiàng)的方法，其中復(fù)性溫度為68℃，時(shí)間為10小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離目標(biāo)染色體上表達(dá)序列的方法，其包含分離目標(biāo)染色體；獲得帶有接頭的目標(biāo)染色體DNA；獲得帶有另一種接頭的總細(xì)胞cDNA；將上述目標(biāo)染色體DNA和總細(xì)胞cDNA進(jìn)行同源雜交；進(jìn)行抑制PCR擴(kuò)增同源序列，獲得目標(biāo)染色體上的表達(dá)序列。該方法能快速有效地獲得目標(biāo)染色體的表達(dá)序列，具有周期短和操作方便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1789417SQ200410098959
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者胡贊民, 姜淑梅, 石銳, 周若楠, 陳宇紅, 胡軍, 尹維波 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所